フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

このプロトコルの全体的な目標は、マルチプレックスビーズベースのイムノアッセイとフローサイトメーターを使用して、刺激されたマウス脾細胞から収集された組織培養上清中の複数のサイトカインターゲットを同時に定量することです。この方法は、特定の疾患状態の状況で免疫応答を調整する独自のサイトカインプロファイルは何かなど、免疫学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、従来のELISAフォーマットよりもはるかに少ないサンプル量で複数のアネロイドの同時定量を行うことができると同時に、非特異的な結合を減らすことができることです。

この手順を実演するのは、製品開発チームの研究員であるNicholas Johnsenです。この手順は、テキストプロトコルに記載されている生物学的サンプルの調製から開始します。プレミックス抗体固定化ビーズを調製するには、プレミックスビーズボトルを室温のソニケーターバスで1分間超音波処理します。

その後、使用前に30秒間ボルテックスします。ソニケーターバスが利用できない場合は、渦時間を1分に増やします。標準調製では、250マイクロリットルのアッセイバッファーを添加して、凍結乾燥マウスTh Cytokine Standardカクテルを再構成します。

短時間ボルテックスして混合し、バイアルを室温で10分間放置します。標準のカクテルをC7とラベル付けされたポリプロピレン製微量遠心チューブに移します。これがトップスタンダードとして使用されます。6本のポリプロピレン製微量遠心チューブにC1からC6のラベルを付けます。これらのチューブのそれぞれに75マイクロリットルのアッセイバッファーを加えます。

その後、トップスタンダードのC7を25マイクロリットルC6チューブに移し、ボルテックスでよく混合します。これがC6標準になります。各チューブに新しいピペットチップを使用して、次に低い標準チューブの75マイクロリットルのアッセイバッファーに前の標準の25マイクロリットルを追加することにより、シリアル1〜4希釈を続けます。

各追加に続いてボルテックスします。アッセイバッファーをゼロピコグラム/ミリリットル標準として使用します。アッセイを行うには、すべての試薬を室温まで温めてから使用してください。

このデモンストレーションでは、ポリプロピレン製のフィルタープレートを使用しています。ビーズの損失を避けるために、洗浄ステップを含むアッセイ手順全体を通してプレートを直立させておくことが絶対に必要です。各ウェルに100マイクロリットルの1X洗浄バッファーを加えて濾紙を事前に湿らせ、プレートを室温で1分間放置します。

バキュームマニホールドを使用してバッファボリュームを取り外します。プレートの底から余分な洗浄バッファーを拭き取り、清潔なペーパータオルの山にプレートを押し付けます。次に、プレートを逆さプレートカバーの上に置きます。

細胞培養上清サンプルの場合は、すべてのウェルに25マイクロリットルのアッセイバッファーを添加します。各標準液の25マイクロリットルを標準ウェルに加えます。最後に、各サンプルの25マイクロリットルをサンプルウェルに加えます。

混合ビーズを30秒間ボルテックスします。次に、25マイクロリットルの混合ビーズを各ウェルに加え、ビーズボトルを断続的に振ってビーズが沈降しないようにします。プレートシーラーでプレートを密封します。

密封したら、逆さプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに載せて固定し、室温で約500RPMで2時間振とうします。反転せずに、プレートをバキュームマニホールドに置き、前と同じようにバキュームを適用します。

次に、200マイクロリットルの1X洗浄バッファーを各ウェルに加えます。アッセイプレートウェルの内容物を真空ろ過により除去します。プレートの底から余分な洗浄バッファーを吸収性パッドまたはペーパータオルで拭き取ってから、この手順をもう一度繰り返します。

次に、各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体を添加します。新しいプレートシーラーでプレートを密封した後、逆さプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで1時間振とうします。

掃除機をかけずに、25マイクロリットルのストレプトアビジンフィコエリトリン試薬を直接各ウェルに加えます。以前と同様にプレートを密封して包みます。次に、プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで30分間振とうします。

真空ろ過ステップを2回繰り返した後、各ウェルに200マイクロリットルの1X洗浄バッファーを加えます。プレートシェーカーにビーズを1分間再度懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルをフィルタープレートからFACSチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを読み取ります。

装置に付属の製造元の指示に従って、フローサイトメーターと取得ソフトウェアを起動します。X 軸に前方散乱光、Y 軸に側面散乱光を持つドット プロットを作成します。前方散乱と側面散乱を線形モードに設定します。

キットに含まれている生ビーズのバイアルを30秒間ボルテックスして、ビーズを再懸濁します。400マイクロリットルの生ビーズを新しいFACSチューブに移します。フローサイトメーターの流量を低く設定します。

生のビーズを実行し、前方散乱と側方散乱のゲインと電圧を慎重に調整して、これらのビーズの両方のサイズの集団が目に見えて分離され、ゲートしやすくなるようにします。前方散乱のしきい値を調整して、不要なイベントを除外します。前方散布図と側面散布図のプロットで、すべてのビード集団を含むゲートを描画します。

前方散乱図と側方散布図のゲートビーズ集団を 2 番目のドットプロットに表示し、X 軸に PE、Y 軸に APC を表示します。APC蛍光チャネルのPMT電圧を調整して、すべてのビーズ集団のAPC信号が10〜5, 000の間にある蛍光強度の中央値(MFI)を持つようにします。次に、PEセットアップビーズのバイアルを30秒間ボルテックスして、ビーズを再懸濁します。

再懸濁したPEビーズ400マイクロリットルを新しいFACSチューブに移します。フローサイトメーターの生ビーズチューブをPEビーズチューブと交換します。PEビーズのMFIがPEビーズバイアルに記載されているロット固有の範囲の間に収まるように、PE蛍光チャネル設定の光電子増倍管電圧を調整します。

データ取得を行うには、取得するビーズイベントの数を陽極液あたり約300個に設定します。分析する前に、各サンプルを5秒間ボルテックスします。次に、サンプルを読み取ります。

サンプルを読み取るときは、まずフローサイトメーターをセットアップモードに設定し、ビーズの集団が安定するまで待ってから取得モードに切り替えてください。テキストプロトコルで説明されているように、データ分析を実行する前に、イベントの合計ではなく、ゲートされたイベントのみをエクスポートします。ターゲット陽極質の代表的な標準曲線は、マウスTヘルパーサイトカインパネルを使用して作成しました。

適切に実施されたアッセイでは、ここに示すように、広いダイナミックレンジで曲線が実証されます。標準曲線は、アッセイを実行するたびに実行する必要があります。マウス脾細胞を種々の条件下で48時間培養した。

培養上清を採取し、マウスTヘルパーサイトカインパネルを用いて13のターゲットの濃度を定量しました。刺激条件に応答したサイトカイン発現プロファイルの違いがはっきりと見えます。この手法の実験室のベンチワークは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間半未満で完了することができます。

データ取得とダウンストリーム分析にかかる時間は、サンプル数によって異なります。このビデオを見た後、このプロトコルの使用方法、サイトメトリー、ビーズベースのイムノアッセイを使用して生物学的サンプル中の陽極質濃度を定量する方法を十分に理解できるはずです。これには、試薬の調製、インキュベーションステップ、データ取得のためのフローサイトメーターのセットアップが含まれます。