Name: フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶマウス脾細胞のサイトカインプロファイリング。フローサイトメトリーと多重ビーズ免疫アッセイを用いて、刺激した免疫細胞の複数サイトカインを同時定量する方法です。ELISAより少ないサンプル量で高精度な免疫応答解析が可能になります。

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著者はバイオ マーカーと免疫アッセイの貢献を認識したいアッセイの開発製品開発チーム。さらに、データ分析ソフトウェア パッケージの設計の彼らの共同の努力の Vigene テクノロジー株式会社に感謝したいと思います。

<ol><li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li>
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<li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li>
<li>LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from:
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</ol>

著者は、本稿に記載されている試薬を製造する BioLegend によって用いられます。株式会社 Vigene 技術は、本稿に記載されている分析から生成されたデータを分析するために使用 LEGENDplex データ解析ソフトウェアを開発しました。

このプロトコルで記述されているアッセイ フォーマットは、実験者を提供された生体試料中の可溶性調停プロファイルの堅牢な定量化は良い研究室技術と推奨されるプロトコルに準拠して提供できます。
信頼性の高い結果を保証するために従う必要がありますいくつかの主要な手順があります。まず、ポリプロピレン チューブにのみ希釈後、アッセイバッファー推奨、フルタイムを再構成する組換え基準を許可しなければなりません。ポリスチレンのチューブは、蛋白質の標準曲線を生成するときに低信号につながることができるチューブの壁への付着を促進することが。第二に、適切な培養手順中に揺れが重要です。適切な撹拌せず試金ビーズの結合特性を著しく妨げられること。さらに、インキュベーションのステップの間の適切な洗浄も必要です。実験者は過剰試薬がプロトコルの次のステップを開始する前に井戸から削除されることを確認してください。使用して試金ビーズ フローサイトの機器設定は、同様に最適化されなければなりません。特に、PMT の設定を調整して、適切なビードの分離と標準的なカーブの広いダイナミック レンジを確保する必要があります。最後に、cytometer で分析される直前にビーズに vortexed 適切なサスペンションを保証するために、集計結果を曲げるの形成を回避する必要があります。
このプロトコルは、研究者はプレート全体の大規模な分析を実行する前に、換散のプロトコルを最適化するために喜んで提供される組織乳剤として本稿で説明したサンプルの種類を分析する可能性のある変更ことができます。実際の手法は、組織の種類によってもちろん異なりますただし、一般的にプロトコルがイオンの塩の生理学的濃度、変性無農薬、好ましくない洗剤を含む中性 pH バッファーを使用する必要があります。洗剤を使用する必要がある場合非イオン性洗剤濃度は最小値 (例えばは 1% 以上) に保つ必要があります。バッファーは、標的タンパク質の分解を防ぐために十分なプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。換散のプロトコルが使用されるに関係なく微粒子分析の前に削除する最終準備を遠心する必要があります。
試金の制限に関する生物学的サンプルの型内の試料ターゲットの濃度が異なります。適切濃度を定量化するために、標準的なカーブのための上位および下位の値に収まる必要があります。カーブの値の外挿は、必ずしも信頼性がないと、お勧めしません。したがって調査官は、完全版の試金を実行する前にパイロット実験でそれらの特定のサンプルの希釈液を最適化する必要があります。さらに、試金するのに生物学的サンプルの入念な準備は、このアッセイの形式の成功に重要です。Lipemic、溶血されました、または蛋白質の破片を含むサンプルはこの免疫測定法の基本原則を定義する抗原抗体の相互作用に影響を与える、解釈である結果をレンダリングします。
この試金はいくつかの理由のための既存の定量化方法に関して重要です。正しく実行されると、アッセイの形式することができます量的に表わす伝統的な ELISA アッセイを使用してサンプルを分析する必要があるよりもはるかに小さいボリュームを使用してサンプルから最大 13 検体。このアッセイ フォーマットも必要ありません専用計測を実行するために。これは、アッセイは、一般的に使用される流れの cytometers の任意の数を使用して実行できる、他の市販のビーズを用いたイムノアッセイと比較利点です。
健康ネットワーク分泌因子とサイトカイン演じる役割への科学的な調査と病が拡大しています。本稿で説明している分析書式は、これらの多面的で複雑な現象を理解しようとする研究者にとって貴重なツールを使用できます。アクティブな生物医学研究プログラムは、だけでなくエリアなど、一般化された炎症6、におけるサイトカイン ネットワークの役割だけでなく、アテローム性動脈硬化、癌、neuroinflammationなど特定の病気の状態のコンテキストを探検し始めています。15,16,17。間違いなく、調査は、これら慢性疾患治療の検索が拡張されるとこれらの分野で成長を続けるでしょう。これらの疾患に関連付けられている溶性メディエーターの正確性と信頼性の定量化のための必要性は、重要な研究の優先順位になります。

水溶性のシグナル伝達分子としての役割、サイトカインは宿主免疫反応を支配する因子と高い調整能力のプロセスを仲介します。彼らは解像度に開始からの炎症性プロセスのすべての段階の間に表現し、独自の合成とその細胞の受容体1を含む複雑な相互作用ネットワークを調整します。この通信ネットワークは個々 のコンポーネント間があります相乗的あるいは敵対関係を超えた複雑さと階層化します。確かに、冗長または少なくとも部分的に重なり合う機能2,3を共有する多くのサイトカインが知られています。
同時に複数のサイトカイン analytes を定量化する統合システムバイオロジーは現在複数疾患の基になる免疫反応を調整するユニークな cytokinomes のますます包括的な理解を提供します。4、5 を状態します。これら疾患状態まで炎症から癌、神経変性疾患、および心血管疾患6,7,8,9です。
LEGENDplex ビーズを用いたイムノアッセイを効果的に使用してこのようなサイトカイン ネットワークを尋問することができます。これらの試金はサンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) と同じ原理に基づいています、エンコードされた蛍光マイクロスフィアを使用し表面に共有結合接続キャプチャ抗体。これらの抗体は ELISA の従来のフォーマットに必要なそれらより小さい表面領域に固定します。これにより、このような試金をはるかに少ないサンプル量と同時に非固有のバインドおよび提供を減らすいくつかの検体の分析を多重実行します。
このプロトコルで説明アッセイは、同時に最大 13 ターゲット量的にこの技術を利用しています。この試金のデータはさまざまな一般的な流れの cytometers を使用して取得することができますとは異なり、他の利用可能なアッセイを必要としない専用の試金固有のインストルメンテーションを使用。検証済み試料パネルの拡大カタログ、いくつか継続的な生物医学研究プロジェクト10、11,12,13これらのアッセイを使用されています。
使いやすさとマウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、量的にこの実験で、アッセイ フォーマットの有用性を実証するには、13 別の複数の下で培養したマウス脾細胞から得られた培養上清からのサイトカイン濃度刺激の条件。組織培養上清、に加えてこのアッセイも実行できます血清または血漿サンプルを使用しています。

<table><tbody><tr><td>ALLEGRA 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier</td><td>Adaptor Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-bottom 9-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3&epsilon; antibody</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>抗マウスCD28抗体</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51、低エンドトキシン、アジドフリーフォーマット</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>EMDミリポア</td><td>WP6111560</td><td>フィルタープレートを使用したLEGENDplexアッセイ用(推奨)</td></tr>真空<tr><td>マニホールド</td><td>EMDミリポア</td><td>MSVMHTS00</td><td>フィルタープレートを使用したLEGENDplexアッセイ用(推奨)</td></tr><tr><td>滅菌済みディスポーザブル試薬リザーバー</td><td>フィッシャーScientific</td><td>07-200-130</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ポリプロピレンMicroFACSチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>LEGENDplexアッセイの場合、マイクロチューブ、VまたはUボトム96ウェルプレート(オプション)ピ</td></tr><tr><td>ペットキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-388-100</td><td>4つのピペットサイズ(0.2-2&micro;L、2-20&micro;L、20-200&micro;L、100-1000&micro;L)</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FA10011G</td><td>5 &mu;L から 200 &mu;L</td></tr><tr><td>マイクロプレート シェーカー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>88880023</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>75002410</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>FACS チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm 丸底</td></tr><tr><td>PMA (ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖 (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>Escherichia coli O26:B6</td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 超音波洗浄機</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1.5 mL ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>各種</td><td></td><td>575nmおよび660nmで発光波長を読み取ることができる単一のレーザー(488nm青)または2つのレーザー(488nm青または532nm緑+ 633nm赤)を装備したサイトメーター</td></tr><tr><td>96ウェルポリプロピレンプレート</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>LEGENDplexアッセイの場合、マイクロチューブ、VまたはUボトム96ウェルプレート(オプション)で実行されます</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

ビーズを用いたイムノアッセイ サンドイッチ免疫測定と同じ基本的な原理を採用しています。ビーズのサイズと内部アロフィコシアニン (APC) 蛍光強度によって区別することができます、特定の試料に特異抗体に共役をキャプチャします。次に、定義されているキャプチャ ビーズ セットの選択したパネルは、キャプチャー抗体に固有のターゲット analytes を含む生物学的サンプルと培養です。ビオチン標識検出抗体のカクテルが追加されます、キャプチャ ビーズ検体検出抗体サンドイッチの形成に 。
最後に、バインドされた試料の量に比例した蛍光信号強度を提供するビオチン検出抗体に結合するストレプトアビジン-フィコエ リスリン (SA PE) が追加されます。PE は蛍光ビーズ検体特異的領域の信号が、フローサイトメトリーを用いた定量化し、特定検体の濃度は、データ分析ソフトウェアとアッセイで生成される標準の曲線を使用して決定されます。
この実験では、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、同時に様々 な刺激条件下で培養マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に 13 の独立したサイトカイン ターゲットの濃度を定量化します。

このプロトコルは、ビーズを用いたイムノアッセイ プラットフォームを使用して同時に流れの cytometer を用いる生体試料からのサイトカインを量的に方法を示します。この例で使用されている生物学的サンプルいた以前様々 な作動条件の下で培養されていたマウス脾細胞から細胞培養上清アッセイ フォーマットは、血清または血漿サンプルで使用する検証されています。
アッセイから生成されるデータを使用して、多重パネルですべての検体の標準曲線を構築します。データ解析ソフトウェアは、ユニークなビーズのサイズと APC 強度に基づいて各特定の試料を分類し、PE レポーターを使用してそれらを定量化します。図 2 aの対数-対数スケールでプロットすると、アッセイの感度と同様に動的な範囲が示されています。ソフトウェアを使用して、分析データ、すべて標準曲線 (テーブル 1 のハイエンドとローエンドの生体試料も検出限界を提供だけでなくユーザーの検体の濃度を正確に計算する 5 パラメーター曲線近似アルゴリズム).このプロトコルで説明する形式はまた、非常に堅牢な測定精度を提供します。図 2 bおよび2 Cの各試料の測定内変動を描いたデータを掲載されています。2 つの別々 の標準蛋白質濃度 (高低) を各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。図 2と2 Dは、3 つの独立した試金からターゲット検体の測定間変動を表します。測定内の精密実験と高低標準濃度を行った 3 とそれぞれ独立した実験の複製します。ターゲット蛋白質の計算される濃度の最小変動がはっきりと見えるです。
マウス脾細胞サイトカイン発現プロファイルを尋問でビーズを用いたフローサイトメトリーによるアッセイの有用性を実証するために様々 な作動条件の下で培養。些細のコントロールでは、セルも LP、抗 CD3/抗 CD28 抗体またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート イオノマイシンと培養。細胞培養上清は、48 時間後、マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して試金を収集しました。この実験から定量化の結果は図 3で表され、サイトカイン濃度に及ぼす刺激条件を明確に線引き。
上記結果は実験者がありよい実験室技術提供の試金のプロトコルに続く限り、典型的であります。この試金の形式でエラーのソースは、サンプルの分析に使用される流れの cytometer でインキュベーション時間、洗浄、試薬ボリュームの偏差や不適切な PMT 設定からを発生します。図 4 a散布図では、成功した試金からプロットは、明確に定義された 2 の異なるビーズ人口を示しています。これは、図 4 b、どこに洗濯とプロトコルのコンプライアンスの低下が 2 つの集団をぼかしビーズ凝集体に導いたに対比ことができます。さらに、左下腹部の残骸によって証明されるようゲート イベントのみの優先のフォーマットではなく、分析の合計 cytometer イベントが輸出されました。設定適切な cytometer は、このアッセイで信頼性の高いデータを生成するのに不可欠です。図 4適切な pmt 関数の設定は APC 分類チャネル 6 検体のそれぞれの解像度のこと。不適切な光電子増倍管の設定は図 4 APC チャネルが重複分類強度を持つビーズ集団で提示したようなデータになります。試金ビーズの明確に定義された集団なし濃度を計算することが可能になりますので、試金は無効になります。
<img alt="サイトカイン定量の直線性と変動性;グラフ;アッセイ内/アッセイ間の変動分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
図 2: 標準曲線の範囲と測定精度。(A)マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して生成された代表的な標準的なカーブです。標準的な曲線は、各アッセイで実行されなければなりません。(B ・ C)測定内の有効桁数です。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルを各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。(D ・ E)測定間の精度。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルは、各サンプルに対して 3 の複製を 3 つの独立したアッセイで行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="免疫刺激試験におけるサイトカインレベル(pg/mL)の棒グラフ:CD3/CD28、LPS、PMA+Iono。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
図 3: 代表結果の定量化します。37 ° C + 5% CO2様々 な条件下で培養したマウス脾細胞 (1 x 10 の6セル): 些細、LPS (100 ng/mL)、αCD3 (1 μ G/ml プレート コーティング) + αCD28 (1 μ g/mL 水溶性)、PMA (20 ng/mL) + イオノマイシン (500 ng/mL)。培養上清は 48 時間後に収集されたし、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して量を示されます。刺激条件に応じて各種サイトカイン発現プロファイルが明確に表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="細胞集団分析を示す、SSC 対 FSC、APC 対 PE を示すフローサイトメトリーグラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
図 4: 失敗した試金と成功の結果します。(A)成功した試金微粒子集団の異なるビーズ人口しているが。(B)失敗したアッセイでお越しの貧しい人口分離、ビーズの集計、および収集されたイベントが多すぎます。(C)正常な試金がゲートし、定量化しやすい分類蛍光チャネルの強度が明確に定義します。(D)失敗した試金が不十分な分離と分類強度定量化を難しく、複数のビーズ集団を重複します。注意付着試金のプロトコルを介してこれらのエラーの多くを回避できます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">標準曲線</td>
			<td colspan="2">感度 (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>検体</td>
			<td>フィット式</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>分。</td>
			<td>Max。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5 P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5 P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF Α</td>
			<td>5 P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5 P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5 P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td&gt;1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5 P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5 P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 9</td>
			<td>5 P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17A</td>
			<td>5 P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17F</td>
			<td>5 P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>イリノイ 21</td>
			<td>5 P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 22</td>
			<td>5 P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 13</td>
			<td>5 P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

表 1: 標準的なカーブ フィットとアッセイ感度。データ解析ソフトウェアは、マルチプレックス アッセイに含まれているすべての分析の標準的な曲線の生成に使用されました。この全自動分析アッセイからアルゴリズムを希釈シリーズ規格にふさわしい堅牢な 5 パラメーター曲線を適用し、検出の理論的な限界を使用してアッセイ感度の定義にも使用されました。

このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

このプロトコルの全体的な目標は、マルチプレックスビーズベースのイムノアッセイとフローサイトメーターを使用して、刺激されたマウス脾細胞から収集された組織培養上清中の複数のサイトカインターゲットを同時に定量することです。この方法は、特定の疾患状態の状況で免疫応答を調整する独自のサイトカインプロファイルは何かなど、免疫学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、従来のELISAフォーマットよりもはるかに少ないサンプル量で複数のアネロイドの同時定量を行うことができると同時に、非特異的な結合を減らすことができることです。この手順を実演するのは、製品開発チームの研究員であるNicholas Johnsenです。この手順は、テキストプロトコルに記載されている生物学的サンプルの調製から開始します。プレミックス抗体固定化ビーズを調製するには、プレミックスビーズボトルを室温のソニケーターバスで1分間超音波処理します。その後、使用前に30秒間ボルテックスします。ソニケーターバスが利用できない場合は、渦時間を1分に増やします。標準調製では、250マイクロリットルのアッセイバッファーを添加して、凍結乾燥マウスTh Cytokine Standardカクテルを再構成します。短時間ボルテックスして混合し、バイアルを室温で10分間放置します。標準のカクテルをC7とラベル付けされたポリプロピレン製微量遠心チューブに移します。これがトップスタンダードとして使用されます。6本のポリプロピレン製微量遠心チューブにC1からC6のラベルを付けます。これらのチューブのそれぞれに75マイクロリットルのアッセイバッファーを加えます。その後、トップスタンダードのC7を25マイクロリットルC6チューブに移し、ボルテックスでよく混合します。これがC6標準になります。各チューブに新しいピペットチップを使用して、次に低い標準チューブの75マイクロリットルのアッセイバッファーに前の標準の25マイクロリットルを追加することにより、シリアル1〜4希釈を続けます。各追加に続いてボルテックスします。アッセイバッファーをゼロピコグラム/ミリリットル標準として使用します。アッセイを行うには、すべての試薬を室温まで温めてから使用してください。このデモンストレーションでは、ポリプロピレン製のフィルタープレートを使用しています。ビーズの損失を避けるために、洗浄ステップを含むアッセイ手順全体を通してプレートを直立させておくことが絶対に必要です。各ウェルに100マイクロリットルの1X洗浄バッファーを加えて濾紙を事前に湿らせ、プレートを室温で1分間放置します。バキュームマニホールドを使用してバッファボリュームを取り外します。プレートの底から余分な洗浄バッファーを拭き取り、清潔なペーパータオルの山にプレートを押し付けます。次に、プレートを逆さプレートカバーの上に置きます。細胞培養上清サンプルの場合は、すべてのウェルに25マイクロリットルのアッセイバッファーを添加します。各標準液の25マイクロリットルを標準ウェルに加えます。最後に、各サンプルの25マイクロリットルをサンプルウェルに加えます。混合ビーズを30秒間ボルテックスします。次に、25マイクロリットルの混合ビーズを各ウェルに加え、ビーズボトルを断続的に振ってビーズが沈降しないようにします。プレートシーラーでプレートを密封します。密封したら、逆さプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに載せて固定し、室温で約500RPMで2時間振とうします。反転せずに、プレートをバキュームマニホールドに置き、前と同じようにバキュームを適用します。次に、200マイクロリットルの1X洗浄バッファーを各ウェルに加えます。アッセイプレートウェルの内容物を真空ろ過により除去します。プレートの底から余分な洗浄バッファーを吸収性パッドまたはペーパータオルで拭き取ってから、この手順をもう一度繰り返します。次に、各ウェルに25マイクロリットルの検出抗体を添加します。新しいプレートシーラーでプレートを密封した後、逆さプレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで1時間振とうします。掃除機をかけずに、25マイクロリットルのストレプトアビジンフィコエリトリン試薬を直接各ウェルに加えます。以前と同様にプレートを密封して包みます。次に、プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500RPMで30分間振とうします。真空ろ過ステップを2回繰り返した後、各ウェルに200マイクロリットルの1X洗浄バッファーを加えます。プレートシェーカーにビーズを1分間再度懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルをフィルタープレートからFACSチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを読み取ります。装置に付属の製造元の指示に従って、フローサイトメーターと取得ソフトウェアを起動します。X 軸に前方散乱光、Y 軸に側面散乱光を持つドット プロットを作成します。前方散乱と側面散乱を線形モードに設定します。キットに含まれている生ビーズのバイアルを30秒間ボルテックスして、ビーズを再懸濁します。400マイクロリットルの生ビーズを新しいFACSチューブに移します。フローサイトメーターの流量を低く設定します。生のビーズを実行し、前方散乱と側方散乱のゲインと電圧を慎重に調整して、これらのビーズの両方のサイズの集団が目に見えて分離され、ゲートしやすくなるようにします。前方散乱のしきい値を調整して、不要なイベントを除外します。前方散布図と側面散布図のプロットで、すべてのビード集団を含むゲートを描画します。前方散乱図と側方散布図のゲートビーズ集団を 2 番目のドットプロットに表示し、X 軸に PE、Y 軸に APC を表示します。APC蛍光チャネルのPMT電圧を調整して、すべてのビーズ集団のAPC信号が10〜5, 000の間にある蛍光強度の中央値(MFI)を持つようにします。次に、PEセットアップビーズのバイアルを30秒間ボルテックスして、ビーズを再懸濁します。再懸濁したPEビーズ400マイクロリットルを新しいFACSチューブに移します。フローサイトメーターの生ビーズチューブをPEビーズチューブと交換します。PEビーズのMFIがPEビーズバイアルに記載されているロット固有の範囲の間に収まるように、PE蛍光チャネル設定の光電子増倍管電圧を調整します。データ取得を行うには、取得するビーズイベントの数を陽極液あたり約300個に設定します。分析する前に、各サンプルを5秒間ボルテックスします。次に、サンプルを読み取ります。サンプルを読み取るときは、まずフローサイトメーターをセットアップモードに設定し、ビーズの集団が安定するまで待ってから取得モードに切り替えてください。テキストプロトコルで説明されているように、データ分析を実行する前に、イベントの合計ではなく、ゲートされたイベントのみをエクスポートします。ターゲット陽極質の代表的な標準曲線は、マウスTヘルパーサイトカインパネルを使用して作成しました。適切に実施されたアッセイでは、ここに示すように、広いダイナミックレンジで曲線が実証されます。標準曲線は、アッセイを実行するたびに実行する必要があります。マウス脾細胞を種々の条件下で48時間培養した。培養上清を採取し、マウスTヘルパーサイトカインパネルを用いて13のターゲットの濃度を定量しました。刺激条件に応答したサイトカイン発現プロファイルの違いがはっきりと見えます。この手法の実験室のベンチワークは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間半未満で完了することができます。データ取得とダウンストリーム分析にかかる時間は、サンプル数によって異なります。このビデオを見た後、このプロトコルの使用方法、サイトメトリー、ビーズベースのイムノアッセイを使用して生物学的サンプル中の陽極質濃度を定量する方法を十分に理解できるはずです。これには、試薬の調製、インキュベーションステップ、データ取得のためのフローサイトメーターのセットアップが含まれます。

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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この手順では、刺激により活発に分泌するIL -...

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

このビデオでは、サンプル中の複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイを実演しています。サイトカイン特異的抗体に結合した異なるマイクロスフェアの混合物を使用して、サンプル中に存在するサイトカインに結合します。ストレプトアビジンタグ付きレポーターは、ビオチン化検出抗体を使用して結合サイトカインに固定化されます。フローサイトメトリーは、マイクロスフェアのユニークなサイズと内部蛍光強度に基づいて結合したサイトカインを同定し、レポーターの蛍光強度はサイトカインの数を示します。...

複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

涙映画サイトカインの解析は、様々 な眼疾患の勉強に役立ちます。ビーズによるマルチプレックスアッセイは簡便かつ高感度、少量サンプルの複数のターゲットのテストを有効にします。ここで涙映画サイトカインを使用してプロファイリングするためのプロトコルを説明ビーズ基づくマルチプレックス...

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導)...

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

サイトカイン放出アッセイ参照試薬を使用することで、免疫療法モノクローナル抗体の再現性と標準化された in vitro...

モノクローナル抗体の安全性予測のためのサイトカイン放出アッセイの頑健性を確認するための参照試薬の使用

このプロトコルは、個々のヒト末梢血単核細胞のサイトカイン分泌動態を定量的に測定するための高度なマイクロ流体プラットフォームを説明しています。このプラットフォームは、例としてリポ多糖で刺激された個々の細胞ごとに最大3つのサイトカイン(IL-6、TNFα、およびIL-1β)を並行して測定します。...

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ 

全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。...

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

私たちは、感染中の病原体遺伝子発現プロファイリングに対して、迅速で感度が高く、再現性のあるプロトコルを開発しました。...

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

学ぶマウス脾細胞のサイトカインプロファイリング。フローサイトメトリーと多重ビーズ免疫アッセイを用いて、刺激した免疫細胞の複数サイトカインを同時定量する方法です。ELISAより少ないサンプル量で高精度な免疫応答解析が可能になります。

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

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