全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と siliques、いくつかの基本的な清算のテクニックの適切な解剖のためのテクニックの説明し、生殖構造の観察を全取り付ける染色を選択しました。

このプロトコルは、花のつぼみ、花、若いシリックを適切に解剖する方法を説明しています。そして、その後の多様な染色および観察技術のための全埋込クリアリング。この方法は、性的な植物生産分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、着実な突然変異体解析や、環境的および実験的に誘発された花の発育と機能の失敗などです。この技術の主な利点は、多くの発達段階を同時に簡単かつ迅速にスクリーニングできることです。花器官の解剖手順は、花の解剖学と解剖スキルの予備知識が必要なため、習得が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

まず、小さなハサミを使って、同期した植物から花を取り除きます。そしてすぐに、適切な固定剤が入った個々の微量遠心チューブに入れます。次に、固定液を取り出し、サンプルを完全に覆うのに十分な70%エタノールを追加します。

サンプルを摂氏4度に少なくとも24時間戻します。次に、時計職人のグラスに作りたての70%エタノールを入れ、小さなシャーレに入れて支えます。次に、花序を時計職人のガラスに入れ、エタノールで完全に覆われていることを確認します。

鉗子と針付きの注射器を使用して、がく片、花びら、雄しべを引き裂くことにより、実体顕微鏡で花を解剖します。次に、時計職人のガラスを脇に置き、スライドガラスを使用して最終的な解剖を行います。サンプルをスライドに移動し、作りたての70%エタノールを10マイクロリットル加えます。

手根骨の両側に切り込みを入れ、必要に応じて回転させます。次に、バルブをそっと取り外して胚珠を露出させます。鋭利な小さな切り込みを入れて、透過組織の半分をレセプタクルから取り外し、鉗子と針を使用して2つの半分を引き裂きます。

柱頭スタイルと鋭い切り傷のある花柄を取り除きます。鉗子と針を使用して、まだ取り付けられている胚珠を静かに反転させて配置し、2つの平行な列を取得します。小さなあぶらとり紙を使用して、スライドガラス上のサンプルからエタノールを取り除きます。

次に、スライドに20マイクロリットルの清澄溶液を追加します。皮下注射針付きの注射器を使用して、検体を配置し、残っている気泡を取り除きます。次に、カバースリップをスライド上にそっと置き、透明化溶液がカバースリップとサンプルの間のスペースを満たすまで待ちます。

スライドをスライドホルダーに入れ、ドラフトの下に置いておきます。そこで、収穫したての花芽を、非裂開性の葯で開こうとしているところをささ。次に、花のつぼみを完全に沈めるのに十分なアレキサンダー溶液を含む96ウェルプレートを準備します。

がく片と花びらを取り除き、葯を露出させ、それらをアレクサンダー溶液に浸します。プレートをドラフトの下に1〜3時間置いておきます。次に、Alexander溶液をHerrの4.5溶液に交換し、プレートをヒュームフードの下で一晩インキュベートします。

翌日、鉗子を使用して、クリアした芽を新しいスライドに慎重に移動します。次に、雄しべを解剖し、サンプルから他のすべての組織を取り除きます。その後、クロラール水和物ベースの清澄化と、Herrの4.5溶液を用いた複合清澄染色を進めます。

まず、花を時計職人のガラスからスライドに移し、あぶらとり紙を使用して余分なエタノールを取り除きます。5〜10マイクロリットルのDAPI溶液を追加します。皮下注射針付きの2本の注射器を使用して、雄しべを解剖し、他のすべての花器官を取り除きます。

次に、花粉粒をDAPI溶液に放出します。滑り台から雄しべからすべての破片を取り除き、花粉粒だけが滑り台に残るようにします。スライドからすべての雄しべの破片を取り除くことは、エキシン除去の最も重要なステップです。

スライドとカバースリップの間には花粉粒だけを残してください。次に、試験片ベアリングスライドにカバースリップを置き、スライドとカバースリップの間のスペースを埋めるために必要な最小限のDAPI溶液を追加します。カバースリップに人差し指をそっと置き、すばやく短くスライドさせます。

スライドを暗所4°Cの人間の箱に少なくとも15分間置きます。その後、24時間以内に広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でスライドを観察します。解剖したサンプルを時計職人のガラスから、1%SDSと0.2水酸化ナトリウム溶液で満たされた空洞のあるガラスプレートに移します。

室温で一晩インキュベートします。SDS水酸化ナトリウム溶液は、サンプルを迅速に透明にし、数分以内に透明に見えます。サンプルを水で慎重にすすぎ、きれいなスライドに置きます。

次に、スライドに20〜40マイクロリットルの染色液を追加します。このDS治療は、分析する花の臓器や研究者のスキルにもよりますが、経験豊富な研究者の場合は解剖ステップの前、または経験の浅い研究者の場合は解剖ステップの後に行うことができます。次に、準備をつぶさないように注意しながら、カバースリップをスライドに置きます。

次に、準備したすべてのスライドをアルミホイルで覆われた人間の箱に入れ、摂氏4度で1時間インキュベートします。最後に、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で試料を観察します。プロトコルに記載されている解剖手順に従い、観察を妨げる可能性のある不要な組織を除去し、より詳細な画像を実現します。

目的に応じて、クロラール水和物染色は、花芽全体での早期の花の発達、葯の減数分裂とマイクロゴメダルの発生、初期の胚珠の発達と巨大胞子母細胞の仕様、雌のゴメド化発達、さらには中央グリッドの花粉管侵入を特徴付けるために使用できます。アレキサンダー染色とHerrの4.5クリアリングを組み合わせることで、特定の小葉または葯全体における花粉流産の評価が可能になります。生存可能な花粉粒は赤い細胞質を示しますが、流産された花粉粒は空の細胞質を示し、最終的には不規則な形をして完全に押しつぶされます。

エキシンを除去すると、核の染色強度が増加し、クロマチン組織の詳細が高くなります。染色前にSDS水酸化ナトリウムを除去すると、花序が透明になりました。その結果、花組織内のカロースの染色が増加しました。

その結果、通常はカロースの蓄積が見づらいことが明らかになりました。例えば、生殖細胞を栄養細胞から分離するカロース層などです。花粉粒がまだ葯の中に含まれていたときでさえ。

これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、48時間以内に行うことができます。この手順を試行する際、結果は、適切な固定剤の使用、適切な解剖の実施、スライド上の目的の組織の分離など、適切なサンプル調製に大きく依存することを覚えておくことが重要です。