Name: 全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶシロイヌナズナの花器官とsiliqueの全体マウントクリアリングと染色法。固定、解剖、透明化、染色の各ステップを含み、発生段階のスクリーニングや突然変異体解析に応用可能です。

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この作品はチューリッヒ大学 IEF マリー キュリーの助成金によって支えられた (付与なし。A. h. に TransEpigen-254797)、欧州研究評議会の高度な許可 (許可なし。U. g. に MEDEA-250358)、および SystemsX.ch、システム生物学のスイスの取り組みから研究・技術開発のプロジェクト (u. g. に MecanX グラント)。

1. 花と Silique 固定
<ol><li>収穫の花と植物から siliques 最初の花のオープニングで同期されます。 注: ここで使用される実験条件下で植物開花を開始土壌培地・培 (MS) 版の移植後約 21 日間。種子は 4 ° C で 3-4 日間の成層、発芽/暮れた 22 ° C/16 h 光と 18 ° C/8 時間で MS プレート上のもとに同じ条件 (図 1) 鍋で栄養豊富な土に苗を移植する前に、8 〜 10 日間。複製の数特定の研究の目的によって異なりますが、各治療のため (5 個体) から 5 花房の最小値をお勧めします。花は実験機である場合 10 花あたりの最小値をお勧めします。</li>
	<li>花序または花 (図 1E-H) (例えば爪のはさみ) 小さいはさみを使って切り取り、(単一の花序/花固定) の微量遠心チューブまたは (の集団注視) 円錐管ですぐにそれらを配置新鮮なを含む製カルノワのやメタノール/酢酸 FPA50 定着剤 (アプリケーションによっては、下記参照) 氷の上。 注: のサンプルは、固定液で完全に水没する必要があります。</li>
	<li>4 ° C で一晩に 4 h 用定着剤内の組織を残す 注: 真空浸透を組織に定着剤の浸透をスピードアップするため使用できますが、これは、組織の構造を維持する有害かもしれない。著者は、真空浸潤を実装しないでください。</li>
	<li>定着剤を削除、サンプルをカバーする十分な 70% エタノールを追加し、少なくとも 24 時間; 4 ° C にそれらを返すサンプルは、このソリューションに無期限に滞在できます。エタノールを除去した後すぐに次のステップに進んでください。郭清、または SDS クリア。</li>
</ol>2、実体顕微鏡下で解剖
<ol><li>入れて 70% エタノールを支える小さなシャーレ上に配置の時計メーカーのガラスで作られて。</li>
	<li>
場所この花房/花/silique は、定着剤をたてさせ、鉗子、注射器の針を用いた顕微鏡下で解剖。
	<ol>
<li>時計メーカーのガラスまたはサンプル (がく片、花弁、雄しべはこの段階で切り裂かれる成熟した花の花器を離れて引き裂く、花序の解剖のためのエタノール (推奨) で完全にカバーすることができる同様のデバイスを使用して、) 乾燥のサンプルのリスクを回避します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
以下の説明に従って siliques およびスライドの小さなつぼみを解剖します。
	<ol>
<li>処理済みサンプルの時計メーカーのガラスはさておき、最終的な郭清のため通常のスライドを使用します。</li>
		<li>スライドに興味のサンプルを移動し、新鮮な 70% エタノールを 10 μ l 添加します。最終的な郭清の迅速作業、サンプルの余分な液体ことがなく潤いを保つには、必要に応じて、エタノールの 10 μ L を追加します。</li>
		<li>おしべから花粉を解放する, ステップ 5.1 を参照してください。心皮および胚珠を解剖の図 2で説明されている手順に従います。この手順は、緑の siliques の開発の段階を含む、心皮の開発のすべての段階に適用されます。 注: は、サンプルの内容を移動から十分なエタノールのキャリー オーバーがある場合、エタノールを追加しないでください。非常に小さいサンプルを解剖は、液体の最小限の量ではるかに簡単です。スライドに関心 (がく片、花びら、雄しべ、心皮、胚珠、種子、または花粉) の器官だけを常に保ちます。この手順はスライドと高い均一性とこうして顕微鏡検査 (対象の標本のより高い数のための効率の結果、審査機関の厚さに対応する coverslip の一様な厚さを確保します。同じ焦点面)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>吸収し、可能な限りできるだけ多くのエタノールを削除するあぶらとり紙の小片を使用します。すぐにうちサンプル乾く前に (セクション 3、4、または 6) の次のステップに進みます。</li>
</ol>3. 決済抱水クロラールと組み合わせたクリア染色
注: FPA50 材料を固定抱水クロラール ベース クリアするため最高の結果が得られました。
<ol><li>クリア ソリューションの場所 20 μ L (抱水クロラール/グリセリン、変更 Hoyer の中、君の 4 または君の壱岐 4 ソリューション) 標本ベアリング スライドに。必要に応じて、それらの間のスペースを減らすことおよびそれらを反転、標本の位置皮下針と注射器のペアを使用して興味のオルガンが下向き。針を使って残りの空気の泡を削除します。</li>
	<li>横の coverslip を下げると優しく非常に優しくを押すと、それを配置し、クリア ソリューションの間の隙間が埋まるまで待ちます。Coverslip の下で全体のスペースを埋めるために、必要な場合は、最小限のクリア ソリューションを追加します。</li>
	<li>スライド ホルダーにスライドを配置し、ヒューム フードの下でそれを残します。少なくとも 4 時間後、次の 4-5 日間顕微鏡による観察に進みます。</li>
</ol>4. 結合染色アレクサンダーと葯の君の 4 クリア
注: 元のアレクサンダー ・ プロトコルは、染色する前にスライドの花粉を解放に基づいています。効率的でより有益な変更アレクサンダー染色し、プロシージャをクリアは成熟しているが非裂開葯内花粉粒の染色します。
<ol><li>非裂開葯を開こうとして新鮮な収穫の花蕾を選択します。 メモ: は、染色アレクサンダーは成熟した花粉を対象として、未熟花粉を効率的に染色されませんので若い花蕾になりません。別の植物と花序から収穫される治療あたり 5 花の最小値をお勧めします。</li>
	<li>花のつぼみが水没する十分なアレキサンダーのソリューションと 96 ウェルのプレートを準備します。萼片と花弁を削除することによって葯を公開し、それらをアレキサンダーの溶液に浸します。1-3 h のヒューム フードの下でサンプルを保ちます。</li>
	<li>君の 4 ソリューションとアレキサンダーのソリューションを交換し、一晩インキュベートの発煙のフードの下に戻ってウェル プレートを配置します。</li>
	<li>鉗子を使用して、優しくクリアの花のつぼみを新しいスライドを移動します。アレキサンダーのソリューションのいくつかのキャリー オーバーが発生するため、可能な限りクリア ソリューションを削除するのにあぶらとり紙を使用します。</li>
	<li>雄しべを解剖し、他のすべての組織を削除します。君の 4 ソリューションを使用して 3 のセクションで手順に従います。</li>
</ol>5. 花粉から性物質が外殻を除去
注: DAPI 染色のカルノワの定着剤の使用をお勧めします。
<ol><li>セクション 1 と 2 で固定と郭清の手順に従ってください。今では、1 つは、スライド内の 70% のエタノールの最小量の多くの雄蘂、一つをしてください。</li>
	<li>あぶらとり紙を使用して余分なエタノールを削除、DAPI 溶液の 5-10 μ L を追加します。針と注射器のいくつかを使用して、その少量の溶液 (例えばおしべと花粉を解放する他の固定化使用 1 つの注射器) の内で花粉を解放します。ソリューションが乾く場合は、DAPI の別の 5 μ L を追加します。</li>
	<li>花粉粒のみがスライドと、coverslip の間残っていることなど重要なステップは、おしべのすべての残骸を削除します。</li>
	<li>片軸受スライドの横にそれを下げることによって観察を配置し、最小限のスペースを埋めるために必要な DAPI ソリューションを追加します。上、人差し指を置きも退治することがなく多くが手っ取り早く、しっかりと短い滑り運動。 注: 必要な力と滑り運動の振幅を測定するには、このステップべきでは数回、たびに顕微鏡下で結果を確認します。</li>
	<li>DAPI ソリューションを必要な場合に追加し、1 h ワイド フィールド蛍光や 24 時間以内の共焦点顕微鏡下その場観察に進みます 4 ° C 15 分で暗闇の中で湿気のあるボックスでスライドかどうか、さらにチェックをクリア SDS とこの手順を結合する場所を向上させるメンツが得られます。</li>
</ol>6. ナトリウム Dodecyl 硫酸塩 (SDS) をクリア
注: によって分析される花器と非常に柔らかく、小さな検体を分析する研究者のスキル、SDS の処置でも行えます (経験者) の前にいずれかまたは解剖手順 (少ない経験の後研究者) メタノール酢酸酸材料を固定します。
<ol><li>時計メーカーのガラス、凹面のスライド、または微量遠心チューブを使用して、1 %sds と室温で一晩 0.2 N 水酸化ナトリウム溶液中または非解剖解剖サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>サンプルは非常に柔らかい透明な外観をしているので取り扱いに注意。数回を水ですすいでください。 注: SDS ソリューションの残党は、染色液、例えば、アニリン ブルーを追加するとき析出する可能性があります。</li>
	<li>非解剖サンプルのセクション 2、70% エタノールではなく水を使用で説明した解剖手順に従います。目的の組織を解剖後残党と、破片、あぶらとり紙で、余分な水分を削除する染色液の 20-40 μ L を追加し、6.5 の手順に進みます。</li>
	<li>切り裂かれたサンプルには、慎重に洗浄液からサンプルを移動しきれいなスライドに配置、染色液の 20-40 μ L を追加します。</li>
	<li>スライドの横にそれを下げることによって観察をそっと置きます。準備をスカッシュに注意してください。組織が柔らかすぎる場合は、いずれかの薄いスライドと (例えば、テープまたは壊れた coverslip)、その四隅に coverslip の間の区切り記号の場所は、coverslip 試料を粉砕しないように、スライドと観察の間商工会議所のようなスペースを残してください。</li>
	<li>湿気の多いボックス内のすべてのスライドに配置、アルミ箔でカバーし、少なくとも 1 h. 広視野蛍光または 24 h 内共焦点の顕微鏡を使用して標本の観察に進みます 4 ° C で置きます。</li>
</ol>

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シロイヌナズナ、すべて花の発達段階にまたがる単一の花序内の多くの花蕾の存在が治療や発達機能の効果を特徴を目指した研究のユニークな機会を提供しています花の開発のさまざまな段階で同時に異なる個体間の良好な基準点は主要な花序の最初の花の開いています。植物が開花が同期されているような方法で扱われる可能な (例えば、4 ° C で最大同期種子の発芽およびそれ故によりも開花 3 – 4 日) と同じ日に彼らの最初の花を開く植物のみが同じくらいトリートメントや複製; 間に配布するバッチとして撮影バッチ連続した日の準備ができては、実験を再現する使用できます。次のこの手順より堅牢な比較分析、環境と開発のバリエーション内と植物間の制御を実行できます。
最近の報告クラシック クリア ソリューションと比較してクリアのサンプルのコントラストを改善するのみならず、花と胚の開発の間にデンプンのダイナミクスを特徴付けることができました君のクリア ソリューションとルゴール染色を組み合わせて、シロイヌナズナ46. こ...

花は最も重要な被子植物の器官を定義しています。顕花植物登場いくつかの 9000 万年前1、急速な外見だったチャールズ ・ ダーウィン2「忌まわしい謎」として記載されて、非常に高速の多様化。花の開発の植物研究者の関心は多様であります。いくつかの研究は、全体または花3,4,5,6 の特定の解剖学的、構造的・機能的特性の進化として花の進化的起源を理解することに焦点を当ててください。.フローラル フォームの構造と、それらに依存する性および無性生殖様式の高い変化は花に非常に複雑な構造を作る。これは遺伝学的および分子調査7と組み合わせることができる光と電子顕微鏡技術を使用して花の器官の解剖学と構造機能を特徴付けるため多様な活動につながっています。さらに果実や種子のソースとして、花は人間および動物栄養物のため非常に重要です。したがって、花とフルーツの開発の特性、応用研究、増え人口と変化する環境8下で生態系保全戦略のための食料安全保障を含む多くの影響,9,10。
シロイヌナズナの花の開発には花成誘導と花序 (花のグループ) の分裂組織に植物の分裂組織の変容が始まります。花原基は、花序メリステム11の側面に横方向に開始されます。花の器官原基の花の中心に外から同心円状の渦巻き状に徐々 に形し、がく片、花びら、雄しべ、心皮の7に最終的に開発。これらの花器を果たす個別栄養、保護、および機能 (例えば、送粉者魅力) オスとメスの配偶体、それぞれ12の発達を支える性的器官との異なる植物の役割,13配偶体、ターンでは、それぞれを区別する男性 (精子) のペアと雌性の配偶子 (卵と中央のセル) に結合する二重次世代、受精と一次胚乳を形成する受精ターミナル組織支援、。胚14,15の開発。果実や種子の開発は、成長、成熟および胚と、最終的には、その分散の保全をサポートします。シロイヌナズナ7,16,17モデル種を中心に、多様な植物の花と胚の開発を特徴付ける広範な研究を行った。
花の開発の初期の顕微鏡分析は時間のかかるサンプル加工、パラフィンまたは樹脂埋め込み断面などの手法は組み合わせて光または電子顕微鏡の観察に基づいていた。これらの伝統的な顕微鏡の技術は蛋白質の免疫検出の in situハイブリダイゼーションによる RNA の局在や突然変異体の顕微鏡分析などの分子遺伝の調査との組み合わせでよく使用されました。最新の 3次元コンピューター支援画像解析と最低限の処理のホール マウント標本で使用できる分子の方法の継続的な改良の広視野および共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の必要性をもたらした優先的に定量分析に適している効率的かつ最小限のサンプル処理技術。近年、全体マウント動物標本のクリアリングの技術の開発の重要な進歩をしました。レンダリング サンプル透明水性尿素または砂糖ベースの試薬 (例えばスケール、SeeDB、立方体) を使用して18,19、20、または後の脂質 (洗剤 SDS を使用) の選択的除去安定したゲル; に試料を埋め込む脂質の除去をすることができます受動拡散によっていずれかを達成した (例えば、変更明確プロトコル21, 協定 PARS リム22) または電気泳動 (元明確プロトコル23と法律さきがけ24) によって積極的に。この高速の進歩に励まされて、いくつかの派生技術、プラント用も浮上しています。
シロイヌナズナのモデルに焦点を当てた本のメソッドで花蕾、花、そして若い siliques の適切な郭清と全体マウント多様な染色サンプルのクリアリングの手順と観察の手順について述べる古典的なまたは最近 SDS ベースのクリア方法。澱粉、カロース、クロマチン染色の例のとおりです。ただし、これらの手順は、使用すると他の種の適応の改善とさらに必要があります、彼らは多くの研究プロジェクトの出発点は、これらの単純ですが重要なメソッドのさらなる研究のための段階を設定いただければ幸いです。

<table><tbody><tr><td>試薬および材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シャーラウ</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% 分子生物学グレード</td></tr><tr><td>氷河酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シャーラウ</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ロス</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>アラビアガム</td><td>フルーカ</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>乳酸</td><td>フルーカ</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>フェノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>77607-250ML</td><td>私たちは液体フェノールを使用しました(密度を使用して、ソリューションに必要なボリュームを見つけます)</td></tr><tr><td>クローブオイル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>ロス</td><td>4436.1</td><td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ</td>素<td>フルカ</td><td>57665</td><td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ化カリウム</td>メル<td>ク</td><td>5043</td><td></td></tr>マラ<tr><td>カイトグリーン</td><td>フルカ</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>フクシン酸</td><td>フルーカ</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>オレンジ G</td><td>シグマ</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L3771</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>蛍光増白剤 28</td></tr><tr><td>オーラミン</td><td>クロマ</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>有毒</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr>アニ<tr><td>リンブルーメル</td><td>ク</td><td>1275MS</td><td></td></tr><tr><td>ミディア</td><td>ムカロライナ</td><td>19-57030</td><td></td></tr>栄養<tr><td>豊富な基質</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr>時計<tr><td>メーカーのガラス</td><td></td><td></td><td>特定のブランドはありません</td></tr><tr><td>15ミリリットルの鷹の遠心分離管VWR</td><td></td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>デュモンド鉗子</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>準備針</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>カットエッジ</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>湿ったボックス</td><td></td><td></td><td>湿ったペーパータオルとスライドサポートが入ったプラスチックの箱<</td></tr><tr><td>strong>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong<></td></tr><tr><td>strong>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixatives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carnoy's (Farmer's) 固定液</td><td></td><td></td><td>無水エタノール : 氷酢酸, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>メタノール/酢酸</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) メタノール, 10 % (v/v) 氷酢酸 脱イオン水</td></tr><tr><td>FPA50 固定液</td><td></td><td></td><td>ホルマリン, プロピオン酸, 50% エタノール; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><強力>クリアリング溶液</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物/グリセロール</td><td></td><td></td><td>クロラール水和物:グリセロール:水、8:1:2 (g:ml:ml)。花の発育期全般に使用でき、DIC顕微鏡によるシリック発育にも使用可能です。最良の固定剤は、ホルマリンベースのFPA50</td></tr><tr><td>変性ホイヤー</td><td></td><td></td><td>ガムアラビア7.5 g、クロラール水和物100 g、グリセロール5 ml、水30 mlです。花の発育期全般に使用でき、DIC顕微鏡によるシリック発育にも使用可能です。最もよい固定剤はホルマリンによって基づくFPA50</td></tr><tr><td>Herrの4&frac12; 液体乳</td><td></td><td></td><td>酸、クロラール水和物、フェノールの結晶、クローブ油、キシレン; 2:2:2:1、重量によって; 2:2:2:1である。すべての花の発育段階(特に雄しべの発育)とDIC顕微鏡によるシリックの発育に使用できます。最適な固定剤は、ホルマリンベースのFPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH溶液</td><td></td><td></td>で、<td>SDSとNaOHストック溶液を1% SDS / 0.2 N NaOH(10倍希釈)に混合希釈します。花とシリックの発達段階のすべての段階に。最適な固定剤は、メタン/酢酸固定剤です。他の2つの固定剤も使用できます。カルコフロー、オーラミン、DAPI、アニリンブルー染色液と組み合わせることができます。</td></tr><tr><td>SDSストック溶液</td><td></td><td></td><td>10%(w / v)ドデシル硫酸ナトリウム。10 gのドデシル硫酸ナトリウムを80 mlの脱イオン水に溶解し、脱イオン水で最大100 mlを作ります。</td></tr><tr><td>NaOHストック溶液</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH溶液:4 gのNaOHを40 mlの脱イオン水に溶解し、脱イオン水で最大100 mlを作り</td></tr>ます<tr><td>透明化と染色を組み合わせた溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HerrのIKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>標準4&frac12;(合計9 g)追加:ヨウ素100 mg、ヨウ化カリウム500 mg。この清算液は、すべての花の発育段階と、コントラストの増加またはデンプンダイナミクスの特性評価のためのシリック開発に使用できます。構造解析にはFPA50を、定量デンプン分析にはカーノイの固定液を使用します。</td></tr><tr><td>アレキサンダー染色</td><td></td><td></td><td>エタノール95%10ml、マラカイトグリーン(95%EtOH中1%)1ml、フクシン酸(ddH2O中1%)5ml、オレンジG(ddH2O中1%)0.5ml、フェノール5g、クロラール水和物5g、氷酢酸2ml、グリセロール25ml。この清算/染色は、単独で、またはHerrの4&frac12と組み合わせて;このソリューションは、成熟した三細胞花粉粒を持つ花の花粉流産を評価するために使用できます。それは新しく研ぎ澄まされた非固定材料で使用されます。</td></tr><tr><td><強>染色液</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルコフルーオリュール溶液</td><td></td><td></td><td>カルコフルーオ 0.007% 水 (g:ml)。もともとは蛍光増白剤として使用されていました。細胞壁のセルロース、カルボキシル化多糖類、カロースの染色に使用できます。花粉粒のインタインを染色するためによく使われます。この溶液では、3つの固定剤すべてを使用できます。</td></tr><tr><td>オーラミン溶液</td><td></td><td></td><td>オーラミン0.01%水(g:ml)。この親油性蛍光色素は、キューティクル、クチン、エキシンなどの染色に使用できます。3つの固定剤はすべて、この溶液</td></tr><tr><td>Calcofluor-Auramine混合物</td><td></td><td></td><td>Auramine溶液:Calcofluor溶液、3:1で使用できます。両方の溶液による複合染色に使用できます。他の比率は、オーラミンに対してカルコフルーアのより小さな割合を維持してアッセイすることができる。</td></tr><tr><td>DAPI溶液</td><td></td><td></td><td>DAPI0.4 ug / ml、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7)、0.1%Triton-X-100、1 mM EDTA。この溶液は、男性と女性の減数分裂中の染色体スプレッド、および任意の組織の細胞核の染色に使用できます。花粉粒の発達の研究によく使われます。Carnoy'sおよびメタノール/酢酸は、この溶液に最適な固定剤です。FPA50などのホルムアルデヒド系固定剤は、染色を妨げる可能性があります。UVでの励起と最大発光は約461nmです。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム緩衝液(0.1 M)</td><td></td><td></td><td>プロトン受容体:0.2 M Na2HPO4、プロトンドナー:0.2 M NaH2PO4、プロトンドナー/プロトン受容体の比率:1.364(pH 7の場合)</td></tr><tr><td>アニリンブルー溶液</td><td></td><td></td><td>0.1%(w / v)アニリンブルー、108 mM K3PO4(pH 11)、2%グリセロール。この溶液は、多くの発達段階のカロースおよびセルロースの染色に使用できます(例:オスおよびメスのテラッドへのカロース沈着、花粉管内のカロースプラグ)。UVでの励起と最大放出は約455です。また、514 nmで励起され、細胞内容物の染色のために赤色で発光します。</td></tr></tbody></table>

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および siliques の染色

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

分子遺伝学的研究の素晴らしいツールによるシロイヌナズナは植物生物学で、特に、植物生殖生物学の最も著名なモデル種の一つです。ただし、植物形態学的、解剖学的、および微細構造分析時間のかかる埋め込み、明視野、スキャン、および電子顕微鏡のための手続の区分を含む伝統的。最低限の処理のホール マウント標本に使用される分子技術の継続的な改良、新式の 3次元計算機援用微視的解析、共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の需要の増加につながっています。効率的かつ最小限のサンプル処理技術を開発します。このプロトコルでは正しく解剖シロイヌナズナの花や siliques、基本的な技術をクリアするための手法について述べるとのいくつかの汚損プロシージャ全体マウント生殖構造の観察。

シロイヌナズナは花序 (図 1) に配置された両性花で花序を軸受、Brassicacea 家族に属しています。それぞれの花は 4 がく片、花びら、(4 つの長いおよび 2 つの短い)、六つの雄しべ、4 つの同心円状の渦巻き25,26で配置 2 先天性融合心皮 (図 1 階H) から成る syncarpous 雌ずい。シロイヌナズナは tenuinucellate、それぞれ卵巣 (45-80 胚珠の合計) の 2 つの locules の 2 つの行 (各行の 12-20 胚珠) 頭頂の胎盤に配置された倒胚珠 (未発表データおよび参照27,28,...

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と siliques、いくつかの基本的な清算のテクニックの適切な解剖のためのテクニックの説明し、生殖構造の観察を全取り付ける染色を選択しました。

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

このプロトコルは、花のつぼみ、花、若いシリックを適切に解剖する方法を説明しています。そして、その後の多様な染色および観察技術のための全埋込クリアリング。この方法は、性的な植物生産分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、着実な突然変異体解析や、環境的および実験的に誘発された花の発育と機能の失敗などです。この技術の主な利点は、多くの発達段階を同時に簡単かつ迅速にスクリーニングできることです。花器官の解剖手順は、花の解剖学と解剖スキルの予備知識が必要なため、習得が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。まず、小さなハサミを使って、同期した植物から花を取り除きます。そしてすぐに、適切な固定剤が入った個々の微量遠心チューブに入れます。次に、固定液を取り出し、サンプルを完全に覆うのに十分な70%エタノールを追加します。サンプルを摂氏4度に少なくとも24時間戻します。次に、時計職人のグラスに作りたての70%エタノールを入れ、小さなシャーレに入れて支えます。次に、花序を時計職人のガラスに入れ、エタノールで完全に覆われていることを確認します。鉗子と針付きの注射器を使用して、がく片、花びら、雄しべを引き裂くことにより、実体顕微鏡で花を解剖します。次に、時計職人のガラスを脇に置き、スライドガラスを使用して最終的な解剖を行います。サンプルをスライドに移動し、作りたての70%エタノールを10マイクロリットル加えます。手根骨の両側に切り込みを入れ、必要に応じて回転させます。次に、バルブをそっと取り外して胚珠を露出させます。鋭利な小さな切り込みを入れて、透過組織の半分をレセプタクルから取り外し、鉗子と針を使用して2つの半分を引き裂きます。柱頭スタイルと鋭い切り傷のある花柄を取り除きます。鉗子と針を使用して、まだ取り付けられている胚珠を静かに反転させて配置し、2つの平行な列を取得します。小さなあぶらとり紙を使用して、スライドガラス上のサンプルからエタノールを取り除きます。次に、スライドに20マイクロリットルの清澄溶液を追加します。皮下注射針付きの注射器を使用して、検体を配置し、残っている気泡を取り除きます。次に、カバースリップをスライド上にそっと置き、透明化溶液がカバースリップとサンプルの間のスペースを満たすまで待ちます。スライドをスライドホルダーに入れ、ドラフトの下に置いておきます。そこで、収穫したての花芽を、非裂開性の葯で開こうとしているところをささ。次に、花のつぼみを完全に沈めるのに十分なアレキサンダー溶液を含む96ウェルプレートを準備します。がく片と花びらを取り除き、葯を露出させ、それらをアレクサンダー溶液に浸します。プレートをドラフトの下に1〜3時間置いておきます。次に、Alexander溶液をHerrの4.5溶液に交換し、プレートをヒュームフードの下で一晩インキュベートします。翌日、鉗子を使用して、クリアした芽を新しいスライドに慎重に移動します。次に、雄しべを解剖し、サンプルから他のすべての組織を取り除きます。その後、クロラール水和物ベースの清澄化と、Herrの4.5溶液を用いた複合清澄染色を進めます。まず、花を時計職人のガラスからスライドに移し、あぶらとり紙を使用して余分なエタノールを取り除きます。5〜10マイクロリットルのDAPI溶液を追加します。皮下注射針付きの2本の注射器を使用して、雄しべを解剖し、他のすべての花器官を取り除きます。次に、花粉粒をDAPI溶液に放出します。滑り台から雄しべからすべての破片を取り除き、花粉粒だけが滑り台に残るようにします。スライドからすべての雄しべの破片を取り除くことは、エキシン除去の最も重要なステップです。スライドとカバースリップの間には花粉粒だけを残してください。次に、試験片ベアリングスライドにカバースリップを置き、スライドとカバースリップの間のスペースを埋めるために必要な最小限のDAPI溶液を追加します。カバースリップに人差し指をそっと置き、すばやく短くスライドさせます。スライドを暗所4°Cの人間の箱に少なくとも15分間置きます。その後、24時間以内に広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でスライドを観察します。解剖したサンプルを時計職人のガラスから、1%SDSと0.2水酸化ナトリウム溶液で満たされた空洞のあるガラスプレートに移します。室温で一晩インキュベートします。SDS水酸化ナトリウム溶液は、サンプルを迅速に透明にし、数分以内に透明に見えます。サンプルを水で慎重にすすぎ、きれいなスライドに置きます。次に、スライドに20〜40マイクロリットルの染色液を追加します。このDS治療は、分析する花の臓器や研究者のスキルにもよりますが、経験豊富な研究者の場合は解剖ステップの前、または経験の浅い研究者の場合は解剖ステップの後に行うことができます。次に、準備をつぶさないように注意しながら、カバースリップをスライドに置きます。次に、準備したすべてのスライドをアルミホイルで覆われた人間の箱に入れ、摂氏4度で1時間インキュベートします。最後に、広視野蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で試料を観察します。プロトコルに記載されている解剖手順に従い、観察を妨げる可能性のある不要な組織を除去し、より詳細な画像を実現します。目的に応じて、クロラール水和物染色は、花芽全体での早期の花の発達、葯の減数分裂とマイクロゴメダルの発生、初期の胚珠の発達と巨大胞子母細胞の仕様、雌のゴメド化発達、さらには中央グリッドの花粉管侵入を特徴付けるために使用できます。アレキサンダー染色とHerrの4.5クリアリングを組み合わせることで、特定の小葉または葯全体における花粉流産の評価が可能になります。生存可能な花粉粒は赤い細胞質を示しますが、流産された花粉粒は空の細胞質を示し、最終的には不規則な形をして完全に押しつぶされます。エキシンを除去すると、核の染色強度が増加し、クロマチン組織の詳細が高くなります。染色前にSDS水酸化ナトリウムを除去すると、花序が透明になりました。その結果、花組織内のカロースの染色が増加しました。その結果、通常はカロースの蓄積が見づらいことが明らかになりました。例えば、生殖細胞を栄養細胞から分離するカロース層などです。花粉粒がまだ葯の中に含まれていたときでさえ。これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、48時間以内に行うことができます。この手順を試行する際、結果は、適切な固定剤の使用、適切な解剖の実施、スライド上の目的の組織の分離など、適切なサンプル調製に大きく依存することを覚えておくことが重要です。

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。...

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

結晶性セルロースは、植物の細胞壁の重要な構成要素です。しかし、細胞分解能での定量化は技術的に困難です。...

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。...

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。...

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

拡張期間にわたってシロイヌナズナ葉の蛍光ライブ...

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3...

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

ここでは、蛍光タンパク質の安定性を維持しつつ植物組織を透明にする方法について説明する。この技術は、物理的な切片化なしに、クリアされた植物組織の深いイメージングを容易にする。...

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

本プロトコルは、 Plasmodiophora brassicae によって誘導されるゴールの組織学的観察のための最適化された方法を記載する。胚軸のビブラトーム切片は、蛍光イメージングの前に除去され、疾患進行中の転写因子と植物ホルモンの関与を研究します。このプロトコルは、樹脂包埋の制限を克服し、蛍光タンパク質の プランタ 可視化を可能にします。...

透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化

本稿では,シロイヌナズナの花粉管誘導・受容観察のためのセミインビトロ(SIV)法の改良により,胚珠の受容性を高める方法について述べる.ハイスループットSIV兼セプタム法は、配偶体マーカーラインおよび遺伝的にコード化されたバイオセンサーと組み合わせて、受精の動的プロセスを監視できます。...

セミインビトロ中隔法によるシロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のライブイメージング

ここでは、シロイヌナズナの花粉水分補給プロファイルを測定するための改善された方法について説明します。新しい方法は、より高い解像度を提供し、非侵襲的であり、再現性が高いです。このプロトコルは、受粉の初期段階を規制するプロセスをより細かく解剖するための新しいツールを表しています。...

シロイヌナズナの高分解能単粒in in vivo花粉水和バイオアッセイ

学ぶシロイヌナズナの花器官とsiliqueの全体マウントクリアリングと染色法。固定、解剖、透明化、染色の各ステップを含み、発生段階のスクリーニングや突然変異体解析に応用可能です。

全体マウントクリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

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