代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

これらの方法の全体的な目標は、ヒトノロウイルスカプシドの感染性または完全性に対する治療の影響についてさらに洞察を得ることです。この方法は、非エンベロープウイルス不活化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、特定の治療後にウイルスのカプシドが細胞に感染する能力に何が起こっているのかなどです。

これらの方法の主な利点は、ウイルスに対する任意の治療の作用について、追加のメカニズムの洞察を提供できることです。この方法は、ヒトノロウイルスの不活化戦略に関する洞察を提供することができますが、ライノウイルスや肝炎などの他の非エンベロープウイルスにも適用できる可能性があります A.To、希釈精製されたヒトノロウイルスの主要なキャプシドタンパク質を希釈し、1Xリン酸緩衝生理食塩水で1ミリリットルあたり50マイクログラムに組み立てます。個々のキャップ付きPCRチューブには最大容量15マイクロリットルを使用してください。

チューブに少なくとも600ナノグラムのカプシドが含まれていること、および治療リガンドの組み合わせごとに600ナノグラムのカプシドがあることを確認してください。次に、サーモサイクラーを目的の熱処理に予熱します。次に、追加のサーモサイクラーを摂氏4度に予熱して、すぐに冷却します。

キャプシド溶液を含むチューブをサーモサイクラーに所望の時間加えます。加熱後、すぐにチューブを予冷した摂氏4度のサイクラーに5分間移します。遠心分離機でチューブを短時間回転させて、すべての液滴をチューブの底に送ります。

処理したカプシド溶液とPBSを3マイクログラム/ミリリットルに希釈します。少なくとも200マイクロリットルの希釈処理済みキャプシドがあることを確認してください。次に、100マイクロリットルのキャプシド溶液を各ウェルに適用し、処理ごとに少なくとも2つのウェルがあることを確認します。

さらに、各リガンドに100マイクロリットルのPBSを含む2つのコントロールウェルを含めます。これにより、アッセイのバックグラウンド吸光度が得られます。プレートを蓋で覆い、蒸発を減らすために端をパラフィンフィルムで密封します。

プレートを摂氏4度の振とうのあるインキュベーターに一晩、または室温で2時間放置します。インキュベーション後、処理したカプシド溶液をプレートから取り出します。次に、ブロッキングバッファーのウェルあたり200マイクロリットルを追加します。

室温で2時間インキュベートするか、摂氏4度で一晩密封します。その間に、ビオチン化アプタマーをヌクレアーゼフリー水で1マイクロモルに希釈します。各治療で合計200マイクロリットルの十分な溶液があることを確認してください。

また、選択したビオチン化HPGAをブロッキングバッファー中で30マイクロリットル/ミリリットルに希釈します。繰り返しになりますが、各治療の総量200マイクロリットルに十分な溶液があることを確認してください。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを取り外し、PBSTのウェルあたり200マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。

滅菌済みのペーパータオルでプレートを逆さまに軽くたたいて、残留水分を乾かします。次に、リガンド結合溶液のウェルあたり100マイクロリットルで、熱処理リガンドの組み合わせごとに2つのウェルが存在することを確認し、カバープレートをオービタルシェーカー上で室温で約60RPMで1時間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているようにウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン、西洋ワサビ、ペルオキシダーゼ、PBSの1ミリリットルあたり0.2マイクログラムのウェルあたり100マイクロリットルを追加します。

オービタルシェーカーで穏やかに振とうしながら室温で15分間インキュベートしてから、ウェルを再度洗浄します。次に、別の洗浄後、TMB基質のウェルあたり100マイクロリットルを追加し、色が5〜15分間発色するのを待ちます。ウェルの色を観察します。

レプリケートプレート間で同じ時間に一貫して現像するようにし、使用するプレートリーダーの吸光度範囲に注意してください。1モルリン酸のウェルあたり100マイクロリットルで反応の進行を停止します。すぐに450ナノメートルでプレートを読み取ります。

DLS装置ソフトウェアで、テキストプロトコルに詳述されているように、新しいサイズの標準操作手順を作成します。次に、ソフトウェア内の緑色の実行矢印を選択し、サンプルに名前を付けます。加熱処理したウイルス様粒子またはVLPを1X PBSで1〜10に希釈し、最終濃度を1ミリリットルあたり5マイクログラムにします。

次に、1ミクロンの細孔サイズでサンプルをろ過して、ほこりの粒子を取り除きます。DLSは、大きな粒子が小さな粒子よりもはるかに多くの光を散乱させるため、ほこりに非常に敏感です。希釈したVLP50マイクロリットルを少量の使い捨てキュベットに移します。

キュベットをサンプルに挿入しますamp機器のチャンバー。実行を開始し、correlogram cumulant fit タブと expert advice タブを使用してデータ品質を評価します。実行中に、インデックス値のポリ分散が品質測定値を表す0.3未満であることを確認してください。

[マルチビュー] タブで、相関係数が一定で、短時間では 1 に近く、それ以上ではなく、後で 0 で急激に低下する (粒子サイズの特性) ことを確認します。専門家のアドバイスタブを使用して、測定中のデータ品質に関するフィードバックを得ることができます。測定終了後、インデックス値のポリ分散が0.3未満であることを再度確認してください。

キュムラントフィットラインがキュムラントフィットタブのデータポイントに密接に従っていることを確認します。テキストプロトコルに詳述されているように、DLS装置ソフトウェアで新しいサイズの標準操作手順を作成します。ソフトウェア内の実行矢印を選択して新しいサンプルを開き、名前を付けて、装置が温度平衡に達するのを待ちます。

VLP懸濁液を少量の石英キュベットに移し、気泡を避け、キュベットの壁に対してゆっくりとピペットで動かします。装置が温度平衡に達した後、キュベットをサンプルチャンバーに挿入します。サンプル温度が平衡化するのを10秒待った後、ランを開始し、同時にタイマーを開始します。

最初の測定の終了時にタイマーを停止します。この時間を最初の時点と見なします。ソフトウェアによって記録された測定時間から後続の時点を取得します。

10ミリモルヒープ、pH 7.4のPBSを代用する以外は、以前と同様に熱処理を行い、処理後にカプシドをさらに希釈しないでください。次に、処理したキャプシド溶液の15マイクロリットル滴全体をパラフィンフィルムにピペットで移します。ピンセットでグリッドの端をつかみ、端で閉じてグリッドを保持し、処理された溶液の滴の上にグリッドのカーボン面を下にして置きます。

グリッドを10分間インキュベートして、キャプシドがグリッドに付着するのを待ちます。キャプシド調製物の純度に応じて、処理されたキャプシド液滴の後に一列に配置された10〜15マイクロリットルの液滴の形でヒープ溶液の洗浄液を追加します。10分後、液滴のついたグリッドを拾います。

グリッドを濾紙に対してほぼ垂直に配置して、液滴を吸い取ります。次に、グリッドを使用して10〜15マイクロリットルのヒープバッファの液滴を拾い上げ、30秒間保持します。30秒の洗浄時間の後、別の濾紙で吸い取ります。

次に、15マイクロリットルの液滴である2パーセント酢酸ウラニル溶液をパラフィンフィルム上の空の領域に置きます。酢酸ウラニルの液滴をグリッドで拾い上げ、45秒間保持します。次に、酢酸ウラニルを吸い取り、溶液の大部分を確実に取り除きます。

グリッドがピンセットの湿気にくっつかないように注意しながら、グリッドのカーボン面を上にして濾紙の上に置きます。次に、グリッドを上にした濾紙を開いたガラスのペトリ皿に置きます。このプロセスをすべての処理で繰り返した後、ペトリ皿の半分をグリッドと一緒にデシケーターに一晩置いて乾かしてから、TEMで観察します。

次のグラフは、摂氏68度で処理した場合のヒトノロウイルスカプシドの結合能の経時的な低下を示しています。ご覧のとおり、HPGA結合は、完全に消える最初のシグナルです。この時点で、溶液中のカプシドの大部分は宿主細胞HPGAに結合する能力を失っており、したがって細胞に取り込むことができないと想定されます。

アプタマー結合はHBGAの結合を反映していますが、信号を除去するにはわずかに多くの熱処理が必要です。ここに示されているのは、良質なデータを代表するDLS相関係数曲線です。0 に近い時間では、コレログラムは 1 に近いが 1 未満の値で一定になります。

その後、粒子サイズに特徴的な一度に急激にゼロに低下します。この実験のサイズ結果は、おそらく信頼できるものです。逆に、この相関係数曲線は、質の悪いデータを表しています。

コレログラムは 1 より大きい値から始まり、徐々に 0 まで低下します。この実験の結果は使用しないでください。ここでは、粒子サイズデータは、摂氏68度で処理されたカプシドの明確な凝集プロファイルを示しており、約20分後にはスーパー凝集体が形成されます。

スーパーアグリゲーションが発生するタイミングは、VLPがその処理に対して感受性を示すものです。この図は、ヒトノロウイルスカプシドの加熱処理におけるTEMの結果を視覚化したものです。ここでは、カプシドを左から右に摂氏60〜80度で処理していました。

ご覧の通り、カプシドの形態は、カプシドが凝集して変性するため、処理によって明らかに変化します。同様の現象は、摂氏68度で0〜25分間処理されたカプシドでも見られます。これらのテクニックを習得すると、適切に実行されれば、1時間から24時間で実行できます。

開発後、この技術は、食品ウイルス学の研究者がヒトノロウイルスのカプシドに対する不活化のメカニズムと効果を調査するための追加の手段を提供しました。この手順に続いて、RNase前処理の有無にかかわらずリアルタイムRT-PCR、ウイルスキャプシドのSTSページ、培養可能な代理ウイルスを用いたプラークアッセイなどの他の方法を実行して、特定の治療後のウイルス減少のより完全な全体像を得ることができます。このビデオを見れば、リガンド結合、動的光散乱、透過型電子顕微鏡をどのように活用し、ヒトノロウイルスのカプシドに対する不活化処理の影響についてさらにメカニズム的な洞察を得ることができるかを十分に理解できるはずです。

使用する試薬の一部を扱うことは危険であり、この手順を実行する際には、個人用保護具の着用や実験室の安全に関するベストプラクティスに従うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。