代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

これらの手法の全体的な目的は、処理がヒトノロウイルスキャプシドの感染性または完全性に及ぼす影響について、さらなる知見を得ることにあります。この手法は、非エンベロープウイルスの不活化分野における重要な疑問、例えば、特定の処理後にウイルスのキャプシドが細胞に感染する能力にどのような変化が起きているか、といった問いに答えるのに役立ちます。

これらの手法の主な利点は、任意の処理がウイルスに及ぼす作用について、さらなるメカニズム的な知見を得られることです。この手法はヒトノロウイルス不活化戦略への知見を提供できるだけでなく、ライノウイルスやA型肝炎ウイルスなどの他の非エンベロープウイルスにも適用できる可能性があります。

まず、カプシドとして組み立てられた精製ヒトノロウイルス主要カプシドタンパク質を、1Xリン酸緩衝生理食塩水を用いて50 µg/mLに希釈します。個々のキャップ付きPCRチューブに使用する液量は、最大15 µLとしてください。

チューブに少なくとも600 nanogramsのカプシドが含まれていること、および、1つの治療用リガンドの組み合わせあたり600 nanogramsのカプシドがあることを確認します。次に、サーマルサイクラーを目的の熱処理温度まで予熱します。その後、別のサーマルサイクラーを直ちに冷却できるよう4 °Cに予熱しておきます。

カプシド溶液の入ったチューブをサーモサイクラーに入れ、所定の時間加熱します。加熱後、直ちにチューブを4°Cに予冷したサイクラーに移し、5分間保持します。遠心分離機でチューブを短時間スピンダウンし、すべての液滴をチューブの底に集めます。

処理済みのカプシド溶液およびPBSを3 µg/mLに希釈します。希釈後の処理済みカプシドが少なくとも200 µL確保されるようにしてください。次に、各ウェルにカプシド溶液を100 µLずつ分注し、1つの処理につき少なくとも2ウェルを確保します。さらに、各リガンドに対してPBS 100 µLを入れたコントロールウェルを2つ設けます。これにより、アッセイのバックグラウンド吸光度を算出できます。プレートに蓋をし、蒸発を抑えるために縁をパラフィンフィルムで密封します。プレートを4 °Cの振盪インキュベーターで一晩、または室温で2時間静置します。

インキュベーション後、処理したカプシド溶液をプレートから取り除きます。次に、ブロッキングバッファーを1ウェルあたり200 µLずつ加えます。室温で2時間、または4 °Cで密閉して一晩インキュベートします。

その間に、ビオチン化アプタマーをヌクレアーゼフリー水で1 µMに希釈します。各処理につき合計200 µLの溶液が十分に確保されていることを確認してください。

また、選択したビオチン化HPGAをブロッキングバッファーで30 µL/mLに希釈します。ここでも、各処理につき合計200 µLの容量を確保できるよう、十分な量の溶液を用意してください。

インキュベーション後、ブロッキングバッファーを除去し、1ウェルあたり200 µLのPBSTでプレートを3回洗浄します。プレートを滅菌ペーパータオルの上に逆さまに置き、残留水分を拭き取って乾燥させます。次に、熱処理とリガンドの組み合わせごとに2ウェルずつとなるように、1ウェルあたり100 µLのリガンド結合溶液を添加し、カバーをしたプレートをオービタルシェーカーを用いて室温で約60 RPMで1時間インキュベートします。

テキストプロトコルに記載されている手順でウェルを洗浄した後、PBSで希釈した0.2 µg/mLのストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼを1ウェルあたり100 µLずつ添加します。

ウェルを再度洗浄する前に、オービタルシェーカーを用いて緩やかに振盪しながら、室温で15分間インキュベートします。その後、もう一度洗浄し、1ウェルあたり100 µLのTMB基質を加え、5～15分間発色させます。ウェルの色の変化を確認してください。

繰り返し測定を行うプレート間では、発色時間を一貫させるようにし、使用するプレートリーダーの吸光度測定範囲に注意してください。1ウェルあたり100 µLの1 M リン酸を用いて反応を停止させます。直ちに450 nmでプレートを測定してください。

テキストプロトコルに従い、DLS装置ソフトウェアで新しいサイズ標準操作手順（SOP）を作成します。次に、ソフトウェア内の緑色の実行矢印を選択し、サンプルに名前を付けます。

熱処理したウイルス様粒子（VLP）を1X PBSで10倍に希釈し、最終濃度を5 µg/mLにします。次に、1 µmの孔径のフィルターでサンプルをろ過し、塵埃粒子を除去します。大きな粒子は小さな粒子よりもはるかに多くの光を散乱させるため、DLSは塵埃に対して非常に敏感です。希釈したVLP 50 µLを小容量の使い捨てキュベットに移します。キュベットを装置のサンプルチャンバーに挿入します。測定を開始し、コレログラムのキュムラントフィッティング（cumulant fit）およびエキスパートアドバイス（expert advice）タブを使用して、データの品質を評価します。測定中、多分散指数（polydispersity index）の値が0.3未満であることを確認してください。これは、測定品質が良好であることを示しています。

Multiviewタブで、相関係数が短時間では一定で1に近く（ただし1を超えないこと）、その後時間が経過すると急激に0まで低下することを確認してください。これは粒子径に特徴的な挙動です。測定中のデータ品質に関するフィードバックについては、エキスパートアドバイスタブを使用してください。測定完了後、多分散指数（polydispersity index）の値が0.3未満であることを改めて確認してください。

cumulants fitタブにおいて、キュムラント適合線がデータポイントに密接に沿っていることを確認してください。テキストプロトコルに詳述されている通り、DLS装置ソフトウェアで新しいサイズ標準操作手順を作成します。ソフトウェア内の実行矢印を選択して、新しいサンプルの展開と命名を行い、装置が温度平衡に達するまで待ちます。

VLP懸濁液を小容量の石英キュベットに移します。この際、気泡が入らないよう注意し、キュベットの壁面に沿ってゆっくりとピペッティングしてください。装置が温度平衡に達した後、キュベットをサンプルチャンバーに挿入します。サンプルの温度が安定するまで10秒間待機した後、測定を開始し、同時にタイマーを始動させます。

最初の測定が終わった時点でタイマーを停止させます。この時間を第1タイムポイントとします。以降のタイムポイントは、ソフトウェアによって記録された測定時間から取得してください。

PBSを10 millimolar HEPES (pH 7.4) に置き換え、処理後のカプシドをさらに希釈しない以外は、前述と同様に熱処理を行います。次に、処理済みカプシド溶液の15 microliterのドロップ全体をパラフィンフィルム上にピペットで分注します。ピンセットでグリッドの端を挟んで固定し、処理済み溶液のドロップの上にグリッドのカーボン面を下にして置きます。

カプシドをグリッドに吸着させるため、10分間インキュベートします。カプシド調製液の純度に応じて、処理したカプシドの液滴に続いて、HEPES溶液を10〜15 µLの液滴状に並べて加え、洗浄を行います。10分後、液滴がついた状態のグリッドを回収します。

グリッドをフィルターペーパーにほぼ垂直に当て、液滴を吸い取ります。次に、グリッドを使用して10〜15 µLのHEPES緩衝液の液滴を取り上げ、30秒間保持します。30秒間の洗浄後、別のフィルターペーパーで吸い取ります。

次に、2%ウラニル酢酸溶液の15 µLの液滴を、パラフィンフィルムの空いている場所に置きます。グリッドでウラニル酢酸の液滴をすくい上げ、45秒間保持します。その後、溶液の大部分が除去されるように、ウラニル酢酸を吸い取ります。

グリッドのカーボン側を上にしてフィルターペーパーの上に置きます。この際、グリッドがピンセットの水分に付着しないよう注意してください。次に、グリッドを載せたフィルターペーパーを、蓋のないガラス製ペトリ皿に入れます。すべての処理についてこの操作を繰り返した後、グリッドが入ったペトリ皿の半分をデシケーターに入れ、一晩乾燥させてからTEMで観察します。

以下のグラフは、68 °Cで処理した際のヒトノロウイルスキャプシドの結合能の時間経過に伴う低下を示しています。見ての通り、HPGA結合が最初に完全に消失します。この時点で、溶液中の大多数のキャプシドが宿主細胞のHPGAに結合する能力を失い、その結果、細胞内への取り込みが不可能になったと考えられます。

アプタマーの結合はHBGAの結合と同様ですが、シグナルを除去するには、わずかに長めの熱処理が必要です。ここに、高品質なデータの代表例であるDLS相関係数曲線を示します。時間がゼロに近いとき、コレログラムは1に近いが、それを下回る一定の値となります。

その後、粒子径に特有の時間で急激にゼロまで低下します。この実験から得られた粒子径の結果は、信頼できる可能性が高いと言えます。対照的に、こちらの相関係数曲線は、データ品質が低いことを示しています。

コレログラムは1以上の値から始まり、徐々に0まで低下します。この実験結果は使用すべきではありません。ここでは、粒子径データにより、68 °Cで処理したカプシドに明確な凝集プロファイルが見られ、約20分後に超凝集塊が形成されることが示されています。

超凝集が発生する時間は、VLPがその処理に対してどの程度の感受性を持つかを示す指標となります。この図は、ヒトノロウイルスキャプシドへの加熱処理に関するTEMの結果を可視化したものです。ここでは、左から右に向かって60から80 °Cでキャプシドを処理しています。

見ての通り、カプシドが凝集および変性するため、処理によってカプシドの形態が明らかに変化します。同様の現象が、68 °Cで0分から25分間処理したカプシドでも認められます。

これらの手法を習得すれば、適切に実施することによって1時間から24時間で完了させることができます。

本手法の開発により、食品ウイルス学分野の研究者は、ヒトノロウイルス カプシドにおける不活化のメカニズムとその影響を探索するための新たな手段を得ることとなりました。本手順に続き、RNase前処理の有無を組み合わせたリアルタイムRT-PCR、ウイルス カプシドのSDS-PAGE、および培養可能な代替ウイルスを用いたプラークアッセイなどの他の手法を実施することで、特定の処理後におけるウイルス減少のより包括的な全体像を把握することが可能です。本ビデオを視聴することで、リガンド結合、動的光散乱法、および透過電子顕微鏡法を用いて、不活化処理がヒトノロウイルス カプシドに及ぼす影響について、さらなるメカニズム的な知見を得るための活用方法を十分に理解できるはずです。

使用する試薬の中には危険なものがあるため、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用や実験室の安全基準の遵守など、常に適切な予防措置を講じてください。