Name: 代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶノロウイルスカプシド構造健全性の定量方法。アプタマー結合、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いて感染性粒子を識別し、ウイルス不活化処理のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、NoroCORE プロジェクトを通じて農業と食品研究イニシアチブ競争グラント号 2011-68003-30395 からアメリカ合衆国農務省、国立食品研究所、農業によって支えられました。オープン アクセス料金のための資金は、米国農務省によって提供されました。ロバート Atmar (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) 提供いただきありがとうございます親切私たち精製カプシドとヴァレリー Lapham の TEM 画像で彼女の援助したいと思います。提示実験を開始私たちを助けるためフランク N. バリーに感謝も申し上げます。

1 です評価損失の高次ノロウイルス カプシド構造の結合アッセイのプレート ベース 注: ここで提示されるものに非常によく似た ELASA プロトコル公開 29 日となっています。研究の一部記事他 17 , 18 , 22 として以前と同様 ELASA アッセイを報告されているとします。
<ol><li>人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理 <ol><li>を得る精製人間ノロウイルス GII.4 シドニーの主要カプシド蛋白 (VP1) (加盟: JX459908) カプシドで組み立ています 。
		注: 研究のカプシド (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) R. Atmar 礼儀得られた</li>。
		リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) 個々 の 15 μ L の最大ボリュームに × 1 で 50 μ g/mL に <li>Dilute カプシドは、PCR チューブを頂いた。チューブに少なくとも 600 が含まれていることを確認キャプシドの ng。600 があることを確認治療配位子の組み合わせごとキャプシドの ng</li>。
		<li>予熱目的の熱処理サーマルサイクラー 。
		注: このプロトコルは、別の回の 68 ° C で治療の目的のため (0 - 25 分) 選ばれた</li>。
		<li>は、即時の冷却のための 4 ° C に追加サーマルサイクラーを予熱します。希望の時間に、サーマルサイクラーにキャプシド ソリューションとチューブを追加します。すぐに加熱後 5 分間予冷 4 ° C サーマルサイクラーに転送します。
		<ol><li>含める 95年 ° C 5 分治療を変性キャプシド対照として。肯定的な制御として未処理 (23 ° C) キャプシドのソリューションが含まれます。PBS は、追加のネガティブ コントロールとしてないのキャプシド</li>。
		</ol></li> <li>簡単にスピン ・ ダウン チューブの下にすべての滴を取得して希薄 PBS で扱われたキャプシド溶液 3 μ g/mL に、遠心分離機で。希薄化後、扱われたカプシド (100 μ L/ウェル) の少なくとも 200 μ L があることを確認します</li>。
	</ol></li> <li>治療あたり少なくとも 2 つの井戸があることを確認、各ウェルにキャプシド ソリューションの適用 100 μ L。さらに、それぞれの ligand; 100 μ L の PBS で 2 コントロール井戸があります。これは、アッセイのバック グラウンドの吸光度を提供します。カバー蓋付きプレート、シール パラフィンとエッジ蒸発量を削減する映画し、のまま一晩室温で 2 h、4 ° C で揺れインキュベーターにします</li>。
	<li>0.05% で PBS で脱脂乳固形分 5% (w/v) を行うことでブロックのバッファーを準備トゥイーン 20 (pbst;).</li>
	<li>は、プレートから扱われるキャプシド ソリューションを削除します。200 μ L/ウェルのブロック バッファーを追加します。2 時間室温で孵化させなさいまたは一晩、4 で密封 ° C</li>
	準備リガンド結合ビオチン アプタマー M6 2 18 , 29 のためのソリューションとビオチン標識合成 HBGA 血液型 A またはビオチン化型 h. <li>
	<ol><li>Dilute ヌクレアーゼ フリー水 1 μ M にビオチン化アプタマー。各治療の合計 200 μ L の十分な解決策があることを確認します。30 μ g/ml ブロック バッファーに選ばれたビオチン HBGA を希釈します。各治療のため 200 μ L 容量の十分な解決策があることを確認します 。
		注: 少ない HBGA を使用するには、HBGA の 10 μ G/ml 0.25% スキムミルク PBST で置き換えることができます。ビオチン標識 M6 2 の HBGA 濃度の最適化で以前と、報告します</li>。
	</ol></li> <li>ブロック バッファーを削除し、3 回で 200 μ L/ウェル PBST プレートを洗います。残留水分を乾燥滅菌ペーパー タオルに逆さまプレートをパットします</li>。
	<li>追加 100 μ L/ウェル リガンドの結合ソリューションは熱処理配位子の組み合わせごと 2 井戸が確実します。室温で 1 時間約 60 rpm で軌道シェーカーのふたで覆われているプレートをインキュベートします 。
	注: はそれぞれ正と負のコントロールとして未処理カプシドとそれぞれの ligand のため完全に変性カプシドの各 2 井戸を含めるようにしてください。さらに、2 を &#34; ないキャプシド &#34; プレートとしてそれぞれの ligand のための井戸背景コントロール</li>。
	<li>は、リガンド ソリューションを削除し、200 μ L/ウェル PBST で 3 回洗浄します。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします</li>。
	<li>0.2 のソリューションの追加 100 μ L/ウェル μ G/ml ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ PBS で。軌道シェーカーで穏やかな揺れで室温で 15 分間インキュベートします 。
	注: 異なるストレプトアビジンを西洋わさびの過酸化酵素抱合体が異なる濃度を持っています。ユーザーを参照してください &#39; ELISA 用酵素の濃度の理想的な範囲のための s マニュアル必ずそれが最適と</li>。
	<li>共役ソリューションを削除します。200 μ L/ウェル pbst; 3 回洗います。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします</li>。
	<li>追加 100 μ L/ウェル 3, 3 &#39; 5, 5、&#39;-テトラメチルベンジジン (TMB) 基板ができ、いずれかの 5-15 分観察ネガティブ コントロール井戸色し、必ずレプリケート平板間同時に一貫して開発していく色。プレート リーダーを使用すると、同様の吸光度範囲に注意してください 。
	注: 開発の回は使用する配位子/試薬の品質に基づいて異なる場合があります</li>。
	<li>は、100 μ L/ウェル 1 M リン酸との反応の開発を停止します。板 450 で、すぐに読む nm。データを保存します 。
	注: 酸の導入は、一般的に大幅に反応が遅くなりますが、完全にそれを停止しません。吸光度の読み取りの前に時間の延長量停止板を放置しないでください</li>。
</ol> 2。プレート ベースのアッセイの結果の解析 <ol><li>は、スプレッドシート プログラムで生吸光度データを保存します。特定治療と配位子とよくペアごとに平均の結果を生成します。すべてのそれに続く分析のこれらの平均値を使用します 。
	注: 比較井戸のペアには大幅に異なる値がないことを確認する両方のよくカラムベッド</li>。
	絶対キャプシド整合性 (すべてバインディング) を分析し、生の吸光度を差し引く <li>、&#34; ないキャプシド &#34; コントロールすべての他のサンプルの吸光度値から 。
	注: また、高次 (二次、第三、第四) 構造の喪失によるバインディングの損失直接分析できます。負 (カプシドない) コントロールの吸光度を差し引くではなく完全に変性キャプシド コントロールの値を減算します。この非特異的な装置へのバインドし同様、キャプシド シーケンスによるバインドによる信号のすべてのバインドを削除します。HBGA とアプタマー M6 2、どちらの方法でも同様の結果を生成するので、ほとんどのバインディングを完全に変性キャプシドに表示されます。アプタマーの非特異的な結合に起因する偽の肯定的な信号は使用する分析を選択するとき考慮必要があります</li>。
	<li>と、負の値または変性制御調整結果、100 治療彼らのそれぞれ正 (無処理) によって吸光度吸光度を制御し、乗算で割る。これは未処理のコントロールを基準として扱われたキャプシドの信号の割合を提供します</li>。
	カプシド シーケンスに起因するそれぞれの ligand 結合信号の程度を推定する <li>を引く、&#34; ないキャプシド &#34; 負の初期の結果から制御および変性キャプシドの調整された吸光度を取る。肯定的な制御信号の調整後の吸光度でこれを割り、100 を掛けます。これは変性キャプシド/キャプシド シーケンスへのリガンドの結合により信号が明白な割合を与えます</li>。
</ol> 3。熱処理後のウイルスの凝集を検出するための DLS 注。以下の手順は、ソフトウェアに固有かもしれないと計測器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用します。
<ol><li>DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 25 ° C、平衡時間 0 秒、電池の種類を = = 使い捨てのキュベット (小さい容積、ZEN0040)、測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間自動測定の数 = 3、測定間の遅延を = = 0 秒、データ処理: 解析モデル汎用 (標準解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します</li>。
	<li>ソフトウェアでは、緑の実行ボタンを選択し、サンプルの名前します</li>。
	<li>1.1.1 群集の熱処理のための 1.1.4 からの手順に従います</li>。
	<li>Dilute 熱は、群集を 1:10 に最終濃度 5 μ g/mL の 1x PBS で扱われます。(省略可能)ダスト粒子を削除する 1 μ m の細孔径とサンプルのフィルターを適用します。DLS は、大きな粒子は小さな粒子黒より多く光が散乱、ほこりに非常に敏感です</li>。
	<li>使い捨ての小さなボリュームに希釈した群集の転送 50 μ L のキュベットです。楽器のサンプル室にキュヴェットを挿入します</li>。
	<li>実行] を起動し、使用、&#39; コレログラム &#39;、&#39; キュムラント フィット &#39; と &#39; エキスパート アドバイス &#39; データの品質を評価するためのタブ。
	<ol><li>分散インデックス値よりも小さいことを表す、品質測定で 0.3 チェックの実行、中に、&#8216; マルチビュー &#8217;] タブで、相関係数が定数と、閉じるが短時間で、1 以上を確認。・保存時は粒子の粒径特性 0 急激に低下。使用、&#8216; エキスパート アドバイス &#8217; 測定中にデータの品質に関するフィードバックのタブ</li>。
		測定が完了したら、<li>は分散インデックス値が 0.3 未満であることを再確認します。キュムラント適合データ ポイントに密接にライン次のようであることを確認してください、&#8216; フィット キュムラント &#8217;] タブ</li>
	</ol></li> <li>各サンプルの粒度として測定ごとに報告された Z 平均粒子径の平均を取る。プロットの温度 ° C 対 nm の直径</li>
</ol> 4。リアルタイムで検出ウイルス集計の DLS 注: 以下の手順ソフトウェアにある可能性があります、楽器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用されます。
<ol><li>DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 目的、平衡時間として 0 秒、電池の種類を = = 石英キュベット測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間 = 自動、測定の数 = 50 (増加又は減少によって凝集率があります)、測定間の遅延 = 0 秒、データ処理: 解析モデル複数の狭いモード (高解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します</li>。
	<li>を開き、新しいサンプルの名前をソフトウェア内で実行の矢印を選択でき、温度平衡に到達する計器</li>。
	<li>濃度 5 μ G/ml と 200-500 μ L 間ボリュームで微量遠心チューブに 1x PBS で、群集を中断渦停止します</li>。
	<li>スピン ・ ダウン解消ガス卓上遠心分離機で 5-10 s 用 VLP ペンション。サイズの測定と干渉する熱処理中に気泡を防ぐことができます</li>。
	<li>転送 VLP サスペンションが少量の石英キュベットは、泡を避けるため、キュヴェットの壁にゆっくりピペットします。計測器は、温度平衡に達した、キュヴェット試料室に挿入します</li>。
	サンプル温度平衡に <li>を待つ 10 秒は、実行を開始します。実行の開始時にタイマーを開始します。最初の測定の最後にタイマーを停止します。最初の時点として、この時間を取る。ソフトウェアによって記録された測定時間から後にポイントを取得します</li>。
	<li>、実行を開始し、コレログラム、フィット、配布、データの品質を評価するための専門家のアドバイスを監視します 。
	注: PDI が必ずしもサンプルとしてこれらの測定値の 0.3 未満は集計中多をする予定です。
	<ol><li>相関係数は定数と、閉じるは短時間で 1 以上と 1 つまたは複数の後の時代、粒子の粒径特性でが激減していることを確認します</li>。
		<li>分布適合データ ポイントを密接にラインの次を確認してください</li>。
	</ol></li> <li>サイズ データを分析します。
	各計測と初期時点の時間の違いから <ol><li>を決定するたびにポイント。測定期間は、まったく同じではありません</li>。
		<li>強度分布を使用して記録計測/時間の各ポイントの最大領域とピークのサイズ</li>。
		<li>対分時間 nm のピークの直径をプロット</li>
	</ol></li></ol> 5。TEM のサンプル準備 TEM 用に設計された <ol><li>取得カーボン サポート フィルム (ニッケル) グリッド 。
	注: 相談施設顕微鏡で推奨される試薬および使用のために処理の中核施設。乾燥や湿気への露出を最小限に抑えるための真空チャンバーを含むボックスのグリッドを保存してください</li>。
	<li>は、フィルター ペーパーの約 5 cm × 5 cm 部分を引き裂きます。ガラス シャーレを取得し、適切な自己終了逆ピンセット顕微鏡で使用するために設計されています</li>。
	<li>は、パラフィン膜の約 2.5 cm × 5 cm 部分をカットします。ベンチトップ場所</li>。
	<li>ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理 <ol><li>1.1.1 - 1.1.5 以外の手順で説明したとおりに熱処理の手順に従います: PBS ではなく治療のため 10 mM HEPES (pH 7.4) を使用し、カプシドを更に希釈していません。(50 μ G/ml に維持液) の治療後。ピペットのパラフィン フィルム上に扱われたキャプシド ソリューションの全体 ~ 15 μ L ドロップします</li>。
	</ol></li> <li>グリッドを保持するために端に閉じることができますピンセットでグリッド エッジをつかむし、グリッド炭素側-ダウン処理溶液の一滴の上に配置します。グリッドにアタッチするカプシドを許可する 10 分間インキュベートみましょう。
	<ol><li>キャプシド準備の純度によって扱われたキャプシド液滴後線に置く 10-15 μ L 液滴の形で必要な場合に 10 mM HEPES ソリューションの洗浄を追加します</li>。
		<li>後 10 分は、液滴とグリッドを拾います。液滴を離れて放出するろ紙の部分にほぼ垂直グリッドを配置します。グリッドに 10-15 μ L HEPES 緩衝液の液滴をピックアップ、フィルター紙ワシントン州の別の部分で 30 秒、その後、芯先の保持</li>
	</ol></li> <li>空の領域でのパラフィン映画のウラニル 2% 酢酸溶液の 15 μ L の液滴を配置。
	<ol><li>グリッドと酢酸ウランの液滴をピックアップし、保持 45 s. 芯先の酢酸ウラン、ソリューションの大部分を削除することを確認されています。グリッド炭素側にグリッドがしないように注意しながら、フィルター紙の &#34; スティック &#34; ピンセットで湿気に。オープン ガラス シャーレに濾紙グリッドを配置します 。
		注: は、グリッドはそれらに静電気的に引き付けられる、立ち往生になるプラスチック シャーレを使用しないでください皿にします</li>。
	</ol></li> <li>すべての治療を繰り返します。Tem 観察の前に乾燥して一晩乾燥器で、グリッドを使用してシャーレ半分を配置します</li>。
	<li>相談顕微鏡施設それぞれの施設で準備されたグリッドの観測について。いくつかの施設の設備の操作に関するトレーニングを受けるユーザーに許可 &#39; 秒計測器。セットアップおよび特定の顕微鏡の観察に関する詳細は beyond この資料のスコープします</li>。
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

プロトコルとここで説明する手法は、人間ノロウイルス キャプシドの整合性/機能を評価する手段を提供します。これらのメソッドは、機械論的洞察、ウイルスに対する不活性化処理の効果を得るため使用することができ、Rt-qpcr またはプラーク アッセイなどのより伝統的な不活化評価方法を補うことができる可能性があります。たとえば、ウイルスの不活性化の程度のその不活性化の基になるメカニズムではなく単独でプラクの試金による化学的又は物理的不活化の評価を提供します。また、ウイルス集計できます価の過小評価の結果、したがって治療効果30を過大評価します。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性に治療薬の効果についての情報を提供することによってこのような研究を知らせることができるさらに。最近では、2 つの in vitro (細胞培養) 栽培方法人間ノロウイルスのされている報告された5,6;これらにまだ頼った PCR ウイルス列挙の TCID50 の提示した ente...

ヒトのノロウイルスはかなり保健負担を担当、世界的に約 6 億 8500 万病気や 212,000 人が死亡の原因と毎年1ドル2,3の十億の費用で。今日では、ノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅および/またはリガンド ベースのプラットフォームが含まれます。前者は、量的な情報はより敏感、偽陽性の結果4のリスクが低く、一般に好ましい。最も一般的なノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅技術は、逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) です。対象人間ノロウイルスのゲノムの小さなセグメントを増幅するので、RT qPCR だけでは感染を区別できないと非感染性粒子、無料のゲノム RNA として破損しているゲノムを含むカプシド、カプシドと致命的なゲノムの変異切り捨てはまだ Rt-qpcr によって増幅することができます。両方はまだウイルス定量 RT qPCR に依存し、まだ日常臨床・環境の可能なメソッドではありません 2 つ新しい体外栽培技術人間ノロウイルス5,6は、最近報告されているが、ヒトのノロウイルスをテストします。従って、RT qPCR 残る臨床・環境をテストするためのゴールド スタンダードです。
その他の培養方法は、ノロウイルス粒子の感染状態を適切に推定するために開発されています。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性をアドレスとゲノムの評価として一般に分類できます。前者のアプローチはより普及しました。これは致命的な変異があるウイルス粒子と同様、ウイルスの粒子はそのまま残りますが、宿主受容体/co-因子をバインドする機能がないため考慮しませんしかし、一般的に使用されるメソッドはウイルスのゲノム RNA の抽出前に RNase 前処理または切り捨てたりゲノム7をわずかに破損しています。人間ノロウイルス co-receptor/共同因子、炭水化物であるにバインドする、ウイルスの能力に基づいて、キャプシドの整合性を評価できる病理組織血液型抗原 (HBGAs) として知られています。HBGAs 糖タンパク質や糖脂質 (他の複数の組織) の中の一部として宿主の腸管上皮細胞に存在し唾液のような体液の分泌があります。その表面上 HBGA 様物質を含む腸内細菌は、ヒトのノロウイルス8,9,10をバインドする示されているし、このような相互作用は、ノロウイルス感染症5を促進する可能性が。HBGA バインディングを活用の基本概念は、ウイルス粒子のみ、推定受容体/共同-factor をバインドできる細胞を感染させることができることです。複数の研究が核酸増幅の前ビーズ ベース HBGA バインディングが感染性差別11,12,13,14のための有望な方法であることを示唆しています。 15,16。HBGAs に関する主要な課題は、人間ノロウイルス遺伝子型のすべてをバインドできます単一 HBGA 型がないことです。これに対処するため HBGAs が含まれている、豚の胃粘液は、合成、一貫性、およびコスト削減の容易さの利益のための浄化された HBGA 炭水化物の代わりに使用されています。
ムーアらによって最近の出版17は、ヒトのノロウイルス キャプシド整合性を推定するための新しい技術のセットを導入しました。HBGAs、ムーアらの代わりに17広く反応性核酸アプタマー (M6-2)18 , 広く反応性モノクローナル抗体 (NS14)19熱処理 GII.4 シドニー ノロウイルス カプシド (ウイルス様粒子または群集) のバインドを調査し、これを比較して合成 HBGAs にバインドします。核酸アプタマーは、短い (20 ~ 80 nt) 単一鎖核酸 (一本鎖 Dna または RNA) それらの順序の結果としてユニークな立体構造に折るし、ターゲットをバインドします。核酸があり、彼らはより少なく高価です。簡単に化学的に合成、精製、および変更された;熱に安定しています。アプタマー ノロウイルスに対して生成のいくつかのレポートが存在するそれらのいくつかのさまざまな系統18,20,21,22に広範な反応性を示します。一例として、ムーアら17アプタマー M6 2 精製、組み立てられた人間ノロウイルス カプシド (群集) にバインドされのより高い順序 (例えば、二次、三次) タンパク質の構造を維持するためにウイルスのキャプシド依存 HBGA にも同様の振る舞いを示した発生するバインディング。その一方で、抗体にノロウイルス VLP バインディングのかなりの割合 NS14 は残った完全に変性させるとカプシド後です。ムーアらによる研究ではノロウイルスのバインディングの評価17が行われた elisa 法のような単純なプレート ベース メソッドを用いたアプタマーは抗体の代わりに使用する例外 (したがってメソッドが ELASA 呼び出された)。この高スループット実験法は、ノロウイルス カプシド、物理的または化学的ストレッサーへの露出にウイルス不活化の機構を理解する上で貴重な作品でさまざまな治療法の効果を評価する使用されました。ただし、このメソッドに欠点は、低感度とアプタマーによる非特異的結合を引き起こす可能性より高いレベルでの汚染物質のマトリックス関連の寛容の欠如です。
ムーアら17は、熱処理への応答でウイルス粒子の集合を監視するのに別の方法、動的光散乱法 (DLS) を使用しました。DLS は、ナノ粒子懸濁液のサイズを評価する使用され、蛋白質23,24やウイルス25,26,27に拡張されています。溶液中の粒子からの散乱光の強度は拡散係数と、確立された式を使用して粒径の計算を可能にする粒子の大きさの関数として変動します。DL 法は、サイズ27に基づいたウイルス集計や二量体、個々 のキャプシド分散されたウイルスの検出を可能にするナノスケールまで分散粒子の流体力学的直径を区別できます。粒子サイズの増加によって表される、ウイルスの集計はキャプシドの整合性の損失を表しています。カプシドの変性しその構造の破壊、疎水性残基さらされる、一緒にスティックし、集合体を形成する粒子を引き起こします。DLS は、指定した処理やリアルタイム17,28の集計速度後粒子サイズを測定する使用できます。このメソッド ソリューションのキャプシド挙動の観察を許可する利点がある完全自然の状態でウイルスを代表することができない精製キャプシドの高濃度が必要です。
ムーアらによって利用される最後の方法17は、透過型電子顕微鏡 (TEM) だった。このメソッドは、感度を欠いている、定量的データを生成しません、ウイルスのカプシド構造のさまざまな治療法の効果の可視化が可能です。まだ臨床/環境設定の理想的な組み合わせでこれらのメソッドの使用は人間のノロウイルス不活性化を理解する上で貴重です。プレート ベースの結合の試金 (ELASA)、DL の詳細なプロトコルを提供するこの記事の目的は、TEM の準備メソッドを使用してキャプシドに治療の及ぼす影響のコンテキストでノロウイルス キャプシドに及ぼす熱処理の効果を調査整合性・ ムーアらに提示されています。17。

<table><tbody><tr><td>高次ノロウイルスキャプシド構造の損失を評価するためのプレートベースの結合アッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル、中結合ポリスチレンEIAプレート</td><td>Fisher(Costar)</td><td>07-200-36</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート用蓋</td><td>Thermo Fisher</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンフィルム(Parafilm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS(pH 7.2)</td><td>Life Technologies</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.2) + 0.05% ポリソルベート 20</td><td>該当</td><td>なし 該当なし 精製</td><td></td></tr><tr><td>、組み立てられたヒトノロウイルス GII.4 キャプシド</td><td>該当</td><td>なし 該当なし</td><td></td></tr><tr><td>個別 0.2 ml PCR チューブ</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>22-154G</td><td></td></tr><tr><td>2 サーモサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>卓上型ミニ遠心分離機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク固形物</td><td>サーモフィッシャー</td><td>LP0031B</td><td></td></tr><tr><td>合成組織血液型A型二糖類、ビオチン化</td><td>グリコテック</td><td>01-017</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化アプタマー M6-2 (ストック濃度 100 & micro;ヌクレアーゼフリー水中のM):5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート (ELISA グレード)、Life Technologies SNN2004</td> Life <td>Technologies</td><td>SNN2004</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン (TMB) 基質、室温</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>1 M リン酸</td><td>N/</td><td>A N/</td>A <td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダーを使用450 nm</td><td>Tecan</td><td>Infinite m200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Analysis of Plate-Based Assay Results</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excelまたは同様のプログラム</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>動的光散乱実験</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer ZSP、または同様の粒度分析装置</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>フィッシャーサイエンティフ</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>クォーツキュベット</td><td>ヘルマ</td><td>104-002-10-40</td><td></td></tr><tr><td>小容量使い捨てキュベット(VLP使用量を減らすため)</td><td>マルバーン・インスツルメンツ</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡 サンプル調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニッケル電子顕微鏡グリッド、カーボンサポートフィルム付き</td><td>Ladd Research</td><td>10880-100</td><td></td></tr><tr><td>自己閉鎖型逆電子顕微鏡ピンセット</td><td>Ted Pella</td><td>5372-NM</td><td></td></tr><tr><td>定性的濾紙</td><td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td><td>WHA1002055</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455743</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ストック HEPES 溶液 (pH 7.2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2% 酢酸ウラニル</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

ヒトのノロウイルスは、かなりの公衆衛生と世界的な経済損失を強要します。体外新興栽培の進歩はまだ適用されませんルーチン検出ウイルスのためです。電流検出と定量化技術は、核酸増幅に主に依存している差別しない非感染性のウイルス粒子の感染。この資料の目的は、さらにウイルス粒子の感染状況に関する情報を取得するために一緒に使用される技術の最近の進歩に関する特定の詳細を提示することです。1 つの技法は、カプシドにノロウイルス一本鎖 Dna アプタマーの結合を評価します。簡単に合成し、変更されているという利点がある、アプタマーとは、安価で安定しました。別の手法、動的光散乱 (DL)、ソリューションにおけるキャプシド挙動を観察することの利点があります。電子顕微鏡によるウイルスのカプシドの構造の整合性の可視化が可能です。有望なが非特異的アプタマーへのバインディングなど荷電分子サンプル マトリックスから dl、精製キャプシドの要件と感度不良電子顕微鏡検査のためのそれぞれの手法のいくつかの欠点があります。それにもかかわらず、これらの技術を組み合わせて使用する場合生成データの体について説明しますより包括的な感染性の正確な評価のために不可欠である情報を推論するためノロウイルス キャプシドの整合性不活化メソッドまたはウイルスの検出の解釈。この資料では、感染のヒトのノロウイルス粒子を識別するこれらのメソッドを使用してプロトコルを説明します。

人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシド (群集) の構造の整合性は、ムーアらによって表されるいくつかの手法を使用して評価されました。17。 で実験が最初に行われていたと推定される受容体/共同-factor (HBGA) を一本鎖 Dna アプタマー (M6-2) を結合する機能の機能として、カプシドの整合性であった (図 1) を比較。表示される結果は、以前ムーアらによって提示されています。17、アプタマー M6 2 カプシド バインディング動作様々 な露光時間に 68 の ° C の熱処理への暴露ウイルス HBGA 拘束に類似していたことを示す。HBGA バインディング信号が少し以前よりも失われるのアプタマー M6 2、M6 2 表示信号の損失の計算後に群集が 65 ° C にさらされた、様々 な時間のための 68 の ° C の (表 1</strong...

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー バインディング、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた感染症ノロウイルス粒子の識別を支援する別の方法について詳細なプロトコルを提供することです。

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

これらの手法の全体的な目的は、処理がヒトノロウイルスキャプシドの感染性または完全性に及ぼす影響について、さらなる知見を得ることにあります。この手法は、非エンベロープウイルスの不活化分野における重要な疑問、例えば、特定の処理後にウイルスのキャプシドが細胞に感染する能力にどのような変化が起きているか、といった問いに答えるのに役立ちます。これらの手法の主な利点は、任意の処理がウイルスに及ぼす作用について、さらなるメカニズム的な知見を得られることです。この手法はヒトノロウイルス不活化戦略への知見を提供できるだけでなく、ライノウイルスやA型肝炎ウイルスなどの他の非エンベロープウイルスにも適用できる可能性があります。まず、カプシドとして組み立てられた精製ヒトノロウイルス主要カプシドタンパク質を、1Xリン酸緩衝生理食塩水を用いて50 µg/mLに希釈します。個々のキャップ付きPCRチューブに使用する液量は、最大15 µLとしてください。チューブに少なくとも600 nanogramsのカプシドが含まれていること、および、1つの治療用リガンドの組み合わせあたり600 nanogramsのカプシドがあることを確認します。次に、サーマルサイクラーを目的の熱処理温度まで予熱します。その後、別のサーマルサイクラーを直ちに冷却できるよう4 °Cに予熱しておきます。カプシド溶液の入ったチューブをサーモサイクラーに入れ、所定の時間加熱します。加熱後、直ちにチューブを4°Cに予冷したサイクラーに移し、5分間保持します。遠心分離機でチューブを短時間スピンダウンし、すべての液滴をチューブの底に集めます。処理済みのカプシド溶液およびPBSを3 µg/mLに希釈します。希釈後の処理済みカプシドが少なくとも200 µL確保されるようにしてください。次に、各ウェルにカプシド溶液を100 µLずつ分注し、1つの処理につき少なくとも2ウェルを確保します。さらに、各リガンドに対してPBS 100 µLを入れたコントロールウェルを2つ設けます。これにより、アッセイのバックグラウンド吸光度を算出できます。プレートに蓋をし、蒸発を抑えるために縁をパラフィンフィルムで密封します。プレートを4 °Cの振盪インキュベーターで一晩、または室温で2時間静置します。インキュベーション後、処理したカプシド溶液をプレートから取り除きます。次に、ブロッキングバッファーを1ウェルあたり200 µLずつ加えます。室温で2時間、または4 °Cで密閉して一晩インキュベートします。その間に、ビオチン化アプタマーをヌクレアーゼフリー水で1 µMに希釈します。各処理につき合計200 µLの溶液が十分に確保されていることを確認してください。また、選択したビオチン化HPGAをブロッキングバッファーで30 µL/mLに希釈します。ここでも、各処理につき合計200 µLの容量を確保できるよう、十分な量の溶液を用意してください。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを除去し、1ウェルあたり200 µLのPBSTでプレートを3回洗浄します。プレートを滅菌ペーパータオルの上に逆さまに置き、残留水分を拭き取って乾燥させます。次に、熱処理とリガンドの組み合わせごとに2ウェルずつとなるように、1ウェルあたり100 µLのリガンド結合溶液を添加し、カバーをしたプレートをオービタルシェーカーを用いて室温で約60 RPMで1時間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されている手順でウェルを洗浄した後、PBSで希釈した0.2 µg/mLのストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼを1ウェルあたり100 µLずつ添加します。ウェルを再度洗浄する前に、オービタルシェーカーを用いて緩やかに振盪しながら、室温で15分間インキュベートします。その後、もう一度洗浄し、1ウェルあたり100 µLのTMB基質を加え、5～15分間発色させます。ウェルの色の変化を確認してください。繰り返し測定を行うプレート間では、発色時間を一貫させるようにし、使用するプレートリーダーの吸光度測定範囲に注意してください。1ウェルあたり100 µLの1 M リン酸を用いて反応を停止させます。直ちに450 nmでプレートを測定してください。テキストプロトコルに従い、DLS装置ソフトウェアで新しいサイズ標準操作手順（SOP）を作成します。次に、ソフトウェア内の緑色の実行矢印を選択し、サンプルに名前を付けます。熱処理したウイルス様粒子（VLP）を1X PBSで10倍に希釈し、最終濃度を5 µg/mLにします。次に、1 µmの孔径のフィルターでサンプルをろ過し、塵埃粒子を除去します。大きな粒子は小さな粒子よりもはるかに多くの光を散乱させるため、DLSは塵埃に対して非常に敏感です。希釈したVLP 50 µLを小容量の使い捨てキュベットに移します。キュベットを装置のサンプルチャンバーに挿入します。測定を開始し、コレログラムのキュムラントフィッティング（cumulant fit）およびエキスパートアドバイス（expert advice）タブを使用して、データの品質を評価します。測定中、多分散指数（polydispersity index）の値が0.3未満であることを確認してください。これは、測定品質が良好であることを示しています。Multiviewタブで、相関係数が短時間では一定で1に近く（ただし1を超えないこと）、その後時間が経過すると急激に0まで低下することを確認してください。これは粒子径に特徴的な挙動です。測定中のデータ品質に関するフィードバックについては、エキスパートアドバイスタブを使用してください。測定完了後、多分散指数（polydispersity index）の値が0.3未満であることを改めて確認してください。cumulants fitタブにおいて、キュムラント適合線がデータポイントに密接に沿っていることを確認してください。テキストプロトコルに詳述されている通り、DLS装置ソフトウェアで新しいサイズ標準操作手順を作成します。ソフトウェア内の実行矢印を選択して、新しいサンプルの展開と命名を行い、装置が温度平衡に達するまで待ちます。VLP懸濁液を小容量の石英キュベットに移します。この際、気泡が入らないよう注意し、キュベットの壁面に沿ってゆっくりとピペッティングしてください。装置が温度平衡に達した後、キュベットをサンプルチャンバーに挿入します。サンプルの温度が安定するまで10秒間待機した後、測定を開始し、同時にタイマーを始動させます。最初の測定が終わった時点でタイマーを停止させます。この時間を第1タイムポイントとします。以降のタイムポイントは、ソフトウェアによって記録された測定時間から取得してください。PBSを10 millimolar HEPES (pH 7.4) に置き換え、処理後のカプシドをさらに希釈しない以外は、前述と同様に熱処理を行います。次に、処理済みカプシド溶液の15 microliterのドロップ全体をパラフィンフィルム上にピペットで分注します。ピンセットでグリッドの端を挟んで固定し、処理済み溶液のドロップの上にグリッドのカーボン面を下にして置きます。カプシドをグリッドに吸着させるため、10分間インキュベートします。カプシド調製液の純度に応じて、処理したカプシドの液滴に続いて、HEPES溶液を10〜15 µLの液滴状に並べて加え、洗浄を行います。10分後、液滴がついた状態のグリッドを回収します。グリッドをフィルターペーパーにほぼ垂直に当て、液滴を吸い取ります。次に、グリッドを使用して10〜15 µLのHEPES緩衝液の液滴を取り上げ、30秒間保持します。30秒間の洗浄後、別のフィルターペーパーで吸い取ります。次に、2%ウラニル酢酸溶液の15 µLの液滴を、パラフィンフィルムの空いている場所に置きます。グリッドでウラニル酢酸の液滴をすくい上げ、45秒間保持します。その後、溶液の大部分が除去されるように、ウラニル酢酸を吸い取ります。グリッドのカーボン側を上にしてフィルターペーパーの上に置きます。この際、グリッドがピンセットの水分に付着しないよう注意してください。次に、グリッドを載せたフィルターペーパーを、蓋のないガラス製ペトリ皿に入れます。すべての処理についてこの操作を繰り返した後、グリッドが入ったペトリ皿の半分をデシケーターに入れ、一晩乾燥させてからTEMで観察します。以下のグラフは、68 °Cで処理した際のヒトノロウイルスキャプシドの結合能の時間経過に伴う低下を示しています。見ての通り、HPGA結合が最初に完全に消失します。この時点で、溶液中の大多数のキャプシドが宿主細胞のHPGAに結合する能力を失い、その結果、細胞内への取り込みが不可能になったと考えられます。アプタマーの結合はHBGAの結合と同様ですが、シグナルを除去するには、わずかに長めの熱処理が必要です。ここに、高品質なデータの代表例であるDLS相関係数曲線を示します。時間がゼロに近いとき、コレログラムは1に近いが、それを下回る一定の値となります。その後、粒子径に特有の時間で急激にゼロまで低下します。この実験から得られた粒子径の結果は、信頼できる可能性が高いと言えます。対照的に、こちらの相関係数曲線は、データ品質が低いことを示しています。コレログラムは1以上の値から始まり、徐々に0まで低下します。この実験結果は使用すべきではありません。ここでは、粒子径データにより、68 °Cで処理したカプシドに明確な凝集プロファイルが見られ、約20分後に超凝集塊が形成されることが示されています。超凝集が発生する時間は、VLPがその処理に対してどの程度の感受性を持つかを示す指標となります。この図は、ヒトノロウイルスキャプシドへの加熱処理に関するTEMの結果を可視化したものです。ここでは、左から右に向かって60から80 °Cでキャプシドを処理しています。見ての通り、カプシドが凝集および変性するため、処理によってカプシドの形態が明らかに変化します。同様の現象が、68 °Cで0分から25分間処理したカプシドでも認められます。これらの手法を習得すれば、適切に実施することによって1時間から24時間で完了させることができます。本手法の開発により、食品ウイルス学分野の研究者は、ヒトノロウイルス カプシドにおける不活化のメカニズムとその影響を探索するための新たな手段を得ることとなりました。本手順に続き、RNase前処理の有無を組み合わせたリアルタイムRT-PCR、ウイルス カプシドのSDS-PAGE、および培養可能な代替ウイルスを用いたプラークアッセイなどの他の手法を実施することで、特定の処理後におけるウイルス減少のより包括的な全体像を把握することが可能です。本ビデオを視聴することで、リガンド結合、動的光散乱法、および透過電子顕微鏡法を用いて、不活化処理がヒトノロウイルス カプシドに及ぼす影響について、さらなるメカニズム的な知見を得るための活用方法を十分に理解できるはずです。使用する試薬の中には危険なものがあるため、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用や実験室の安全基準の遵守など、常に適切な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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