Name: 抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 学ぶ固体抽出と高速液体クロマトグラフィーによる乳児尿中のカテコールアミン神経伝達物質と代謝物の同時分析法。この手法は脳損傷の早期診断バイオマーカー探索に有用です。

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本研究は国立科学財団の中国 (No.81172720、号 81673230)、社会開発プログラムの江蘇省科学研究と技術部 (号によって支持されました。BE2016741)、科学技術プロジェクト中国品質監督、検査および検疫 (2015QK055)、子どもの発達と教育省の科学学習の主実験室のプロジェクトを開くプログラムの一般的な管理の東南大学 (CDL-2016-04)。私たちは心から元歌とくれたり、サンプル コレクション人劉平を認めます。

親からインフォームド コンセントが得られたと研究倫理委員会の承認が得られました。人間の世界医師会 (ヘルシンキ宣言) の倫理綱領に基づき実施されました。介護提供のすべての参加者の研究に登録されての書面します。中達の病院の倫理委員会の承認は東南大学と提携、また得られました。
1 列の抽出およびカテコールアミンの定量に必要なソリューションの準備
<ol><li>PFSPE 列を準備します。5-6 の因数に PCE PS ナノファイバーの 1-2 mg を分割し、それらの体積 200 μ L ピペット チップの終わりに整然とした圧縮に直径 0.5 mm の微細鋼棒を使用します。</li>
	<li>2.427 g 尿素、0.034 g 尿酸、0.09 g クレアチニン、0.297 g クエン酸ナトリウム、0.634 g 塩化ナトリウム、0.45 g 塩化カリウム、塩化アンモニウム 0.161 g、0.089 g 塩化カルシウム二水和物、硫酸マグネシウム 0.1 g を秤量することにより人工尿を準備します。200 mL に上記の化学物質が脱イオン七水和物、0.034 g の重炭酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム 0.003 g、0.258 g ナトリウム硫酸、0.1 g ナトリウム二水素リン酸塩と 0.011 g リン酸水素溶解水。</li>
	<li>化合物 2 mg を 1 mL の蒸留水に溶解して diphenylborate (DPBA) 溶液の原液を 2 mg/mL を準備します。4 ° C で暗闇の中でソリューションを格納します。</li>
	<li>
標準試料 注: 化学構造とカテコールアミンのプロパティ、不安定と彼らは簡単に分解です。標準の準備プロセスは非常に高速、直射日光への露出を防ぐ必要があります。<ol>
<li>NE、E、DA、MHPG、DOPAC、内部標準の 3, 4-dihydroxybenzylamine 臭化水素酸塩 DHBA 別 1.5 mL 容マイクロ チューブでの 1.0 mg の重量を量る。DHBA ソリューションを使用する前に 100 ng/mL の水で希釈します。</li>
		<li>検体を完全に溶解するまで高速で暗闇の中で準備された基準を振動させてください。これは、主な株式;数週間までの-20 ° C で保存します。</li>
		<li>セカンダリ 1,000 ng/mL 検体株を準備します。NE, E、DA、DOPAC と MHPG、4,975 μ L の蒸留水 5 mL の遠心管に主な検体銘柄ごとの 5 μ L を転送し、使用するまで 4 ° C で暗闇の中でそれを格納します。これらのソリューションの新鮮な毎日を準備します。DHBA、4,995 μ L の蒸留水 5 mL の遠心管に主な株式の 5 μ L を転送および 4 ° C で別々 に暗闇の中で保存</li>
		<li>さらに希釈標準曲線を作成する二次検体の在庫を作る (e.g。、補足表 2)。4 ° C で暗闇の中でソリューションを保存し、新鮮な毎日を準備します。</li>
		<li>適切な濃度で標準的なストックを用いた ECD 検出器の最適な電圧をテストします。分析検体が最高のピーク外観をある値に電圧が異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>燐酸 30%、15% アセトニ トリルを含む溶離液を準備し、55% 蒸留水します。溶離液溶媒 10 mL、5.5 mL の蒸留水を使用し、水にアセトニ トリルの 1.5 mL とリン酸一滴ずつの 3 mL を追加します。</li>
</ol>2. 実際の尿サンプルと移動相の調製
<ol><li>無菌尿カップを使用して彼らの幼児の最初の早朝尿を収集する母親がいます。ポリプロピレン チューブやラベルに、サンプルをすぐに転送します。その後、-20 ° C のフリーザーでサンプルを保存します。</li>
	<li>渦と遠心分離機 1,510 x g で 10 分間で尿サンプル室温 (RT) ほとんどの粒子の干渉を取り除くために。堆積物を破棄し、さらに実験の培養上清を収集します。検体を効果的に抽出するために遠心分離直後後 PFSPE 前処理 (手順 3) に進みます。</li>
	<li>
移動相を準備します。
	<ol>
<li>きれいな瓶、少なくとも 1 l. を準備します。移動相の組成は、補足表 1に記載されて1 L 移動相、クエン酸、エチレン ジアミン四酢酸 (EDTA) ナトリウム塩、単本位ナトリウム オルトリン酸の 7.02 g 93.06 mg の 6.7242 g メジャーの 404.5 mg 1 heptanesulfonic 酸ナトリウム塩とナトリウムの 3.5 g の瓶にメタンハイド レートします。アセトニ トリル 40 mL を加えて 1,000 mL に蒸留水します。扇動し、ソリューションの問題はすべてが溶解するまで 15 分間超音波振動します。</li>
		<li>ガラス電極 pH メーターを使用して、水酸化ナトリウム飽和溶液を 4.21 に移動相の pH 値を調整します。</li>
		<li>0.45 μ m ポリフッ化ビニリデン フッ化物微多孔性メンブレン、不純物を取り除くために真空吸引装置を含む移動相をフィルター処理します。</li>
		<li>移動相を使用する前にするたびにガスを抜き、15 分間超音波振動を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PFSPE 抽出および HPLC 分析
<ol><li>ナノファイバーをアクティブにします。押してメタノールの 100 μ L、100 μ L の水から順番にゆっくりと、滴状に 5 mL の注射器を使用して、PFSPE 列。</li>
	<li>ミックス 100 μ L 尿 100 μ L 2 mg/ml DPBA ソリューションと 30 μ L 100 ng/ml の DHBA 溶液 (IS、内部標準) 0.5 mL EP 管でサンプルし、PFSPE 列に混合液を転送します。空気圧の力を使って 5 mL 気密性プラスチック注射器で PFSPE の列を混合試料溶液を押します。</li>
	<li>SPE カラムに 100 μ L の DPBA ソリューション (2 mg/mL) を読み込むことによって列の 3 回を濾すし、気密性 5 mL プラスチック注射器を使用して空気圧でカートリッジをゆっくりとソリューションをプッシュします。</li>
	<li>PFSPE カラムに溶離液を 50 μ l 添加を読み込み、0.5 mL EP 管溶出液の収集の列をプッシュします。</li>
	<li>システム内の空気をガス抜き HLPC 脱を入れます。サンプル分析の前に移動相平衡し、ベースライン ノイズを低減すると 0.5 h 以上のシステムを実行してください。高速液体クロマトグラフィー システムのセットアップ パラメーターを示す補足の表 1を参照してください。</li>
	<li>自動サンプラーを使用して溶出液 20 μ L をサンプルし、HPLC-ECD システムに注入すること。</li>
	<li>実行が完了したら、検出器インターフェイスを使用して検出器セル オフにします。計測器が損傷する恐れが、検出器の背面にあるスイッチでセルを切らないでください。</li>
	<li>手動で 10% と 90% のメタノール水移動相組成を変更します。少なくとも 30 分を実行します。その後、HPLC グレードのメタノールに移動相を手動で変更します。メタノール中でシステムを保護するために約 15 分間を実行します。推奨される実行時間を次のこの手順の実行に失敗した可能性があります列と検出器に損傷。流れをオフにし、脱ガス装置をオフにします。</li>
</ol>4. フェニルボロン酸カートリッジ (PBA) 抽出
PBA カートリッジ抽出手順 Kumarらのスキームに類似していた。(2011 年)25します。 すべてのソリューションは、注射器による強制空気で PBA カートリッジ (100 mg, 1 mL) によって押されます。
<ol><li>1 mL 試しましたアセトニ トリル-水 (v/v) 1% ギ酸と 50 mM リン酸緩衝液 (10) 1 mL を順次含むとカートリッジを状態します。</li>
	<li>PBA カートリッジでバッファリングされた尿サンプル (1 mL 尿と 2 mL リン酸バッファー、pH 8.5) を押します。</li>
	<li>1 mL 50: 50 v/アセトニ トリル-リン酸バッファー (10 mM、pH 8.5) とカートリッジを洗ってください。</li>
	<li>1% ギ酸を含む 1 mL のアセトニ トリル-水 (80: 20 v/v) とカートリッジを溶出します。</li>
</ol>5. 同定とカテコールアミンの定量
<ol><li>
直線性
	<ol>
<li>6 濃度 (1.5、3、12、25、50、および 100 ng/mL); 人工尿を二次分析株式を希釈します。人工の尿の希釈容量補足テーブル 2に従います。各濃度の校正曲線を構築するため 18 検体実験的ソリューションを取得する 3 つの並列サンプルを作る。</li>
		<li>DHBA 人工尿を二次在庫を 100 ng/mL 実験的なソリューションを取得する 10 倍希釈します。</li>
		<li>5.1.1, から検体ソリューションのすべてを手順 3 (PFSPE 抽出手順) に従って前処理します。ステップ 3 のように、各対応する溶出液 20 μ L を HPLC クロマト グラムを得るためには、高速液体クロマトグラフィー ECD システムに注入します。</li>
		<li>濃度の比に対して Y 軸としてピーク面積 (ターゲット/IS) の比をプロットすることによって 5 つの analytes の較正曲線を構築 (ターゲット/IS) X 軸として補足の図 1に示すように。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
感度の値 LOD と LOQ
	<ol>
<li>サンプルの HPLC クロマト グラムを取得する (ステップ 3) のように HPLC-ECD システムに空の人工尿の 20 μ L を注入します。</li>
		<li>5.2.1 からクロマト グラムの 11 の空信号値を収集し、b平均値 X および標準偏差 Sbを計算します。L X とL、X の信頼の特定のレベルで検出することができます物質の最小の信号を計算する X =b+ K * Sb (K は、信頼レベルによって決定係数、Sbの騒音レベルを反映して、測定法と機械騒音レベル)。したがって、LOD = (XLXb)/S = (K * Sb)/S (S 作業曲線の勾配値の略)。</li>
		<li>3:1 (K = 3) 検出 (LOD) の制限としての S/N と S/N 10:1 (K = 10) 数量 (LOQ) の制限として定義します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
回収率を評価します。
	<ol>
<li>現実とスパイクの尿サンプルを準備します。3 つの濃度を実際の尿が付いている二次検体在庫を希釈 (5、50、100 ng/mL) スパイクの尿サンプルを入手します。各試料のソリューションの 3 つの並列の例を準備します。尿サンプルにスパイク対象化合物の量とスパイクの濃度をカウントします。Sとしてこの値を定義します。</li>
		<li>100 ng/ml、5.1.2 の手順と DHBA 株式を希釈します。</li>
		<li>ステップ 3 に従って 5.3.1 からそれぞれのサンプルのソリューション (PFSPE 抽出手順) を処理し、クロマト グラムの結果を得るため HPLC-ECD システムにそれぞれ対応する溶離液 20 μ L を注入します。分析値は、スパイクの尿サンプルの対象化合物の量としてカウントされます。Tとしてこの値を定義します。</li>
		<li>クロマト グラムの結果を取得する (ステップ 3) のように HPLC-ECD システムに尿サンプルの 20 μ L を注入します。分析値は、尿サンプルのターゲット化合物の初期量としてカウントされます。私としては、この値を定義します。</li>
		<li>標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。割合回復方法論的回復 % と推定される (t - Aは私) = × 100/(s)。平均値は表 1のとおりです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
不確かさ評価します。
	<ol>
<li>5、50、およびステップ 5.3.1 のように 100 ng/mL の濃度にスパイク人工尿を準備します。ソリューションごとに検体 6 並列サンプルを準備します。毎日新鮮な試料を準備します。</li>
		<li>5.1.2 のステップのように 100 ng/mL に DHBA ストックを希釈します。</li>
		<li>日中精度の評価 (n = 6)。5.4.1 ステップ 3 によると、各サンプル ソリューションを処理し、クロマト グラムを得るためには、高速液体クロマトグラフィー ECD システムに各特派員の溶離液 20 μ L を注入します。同じ日に 6 回同じ操作を行います。</li>
		<li>標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。同じ化合物の同じ濃度、1 日で六つの試金の相対標準偏差 (RSD) は、日中精度で決まります。平均値は表 1のとおりです。</li>
		<li>間日精度の評価 (n = 6)。同時に六つの連続した日の毎日、5、50、100 の 3 つの濃度のスパイク人工尿を準備 ng/mL、5.4.1 と 5.4.2。、および手順 3 に従って各試料溶液を処理。</li>
		<li>毎日クロマト グラムの結果を得るため HPLC-ECD システムに 5.4.5 各対応する溶出液 20 μ L を注入します。標準曲線の方程式から試料中の対象物質の量を計算します。間日精度は、六つの連続した日の 3 つの濃度でスパイク人工尿サンプルからの試金量の RSD によって表されます。平均値は表 1のとおりです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者は、この記事で説明の材料に関して、金融機関との利害対立がないことを証明します。

本稿で提案された PFSPE メソッドが重要なその速さ、シンプルさと利便性に関して意味のある可能性があります。プロトコルで使用される吸着剤はナノファイバー エレクトロスピニング高表面区域の容積比と高効率で、検体を吸着します。手順だけナノファイバーの数ミリグラムと少量の溶離液の有機溶媒、必要、イオンクロマトグラフィーを集中する蒸発ステップを必要としません。ここでは、検出のための効果的な方法を確立する新しいユーザーを許可する HPLC-ECD ベース プロトコルの詳細な概要と 3 つカテコールアミンおよびその代謝物 (NE, E、ダと MHPG、DOPAC) の 2 つの定量を行いました。
このプロトコルの優位性主に由来する 4 つの重要なステップ、手続き中に図 1に示すように、: 急速な吸着につながるいくつかのミリグラムに吸着剤のサイズを減らすために目的化合物をキャプチャする PCE PS ナノファイバーを使用して/脱離・溶出液 (1); の小さいボリュームを必要とします。(2); その疎水性を改善するために検体との複合体に...

カテコールアミン神経伝達物質とその代謝物内容を体液ですることができます神経機能に影響を与えるし、大部分は1に応答の刺激状態のバランスに影響を与えます。異常は、様々 な pheochromacytoma、神経、神経芽細胞腫、神経疾患1,2などの疾患を引き起こす可能性があります。抽出し、体液中のカテコールアミンの定量関連疾患の診断に有効です。ただし、生体試料中のカテコールアミンは低濃度に存在し、酸化しやすい。さらに、溶出が中3で干渉の大きい量のために非常に困難です。したがって、体液中のカテコールアミンの同時検出法はまだ挑戦です。
レビュー尿中カテコールアミンがストレスの測定をすることができ、新生児5処理触覚の刺激への応答の重要な生物学的マーカーに、自分のレベルが表示されています。調査によると脳損傷4,5,6リスクは時期尚早の事件で苦しんでいるすべての乳児と傷害は、カテコールアミンと流体に関連する事項についての異常のリリースを引き起こす可能性があります。以前のフェーズ7,8脳損傷を検出できる高度な磁気共鳴技術は存在します。ただし、最初の 48 時間以内異常発達プロセスは医療画像11で明らかにされません恒久的な脳損傷になります。その上、他の要因とともに、高コスト、乏しい計測器リソースの場合、これらの特殊なニューロ イメージング技術へのアクセスを持っているすべての新生児ユニット不可能になります。ただし、(カテコールアミンやその代謝物) など簡単に親しみやすく、実用的なバイオ マーカーの使用は、これらの欠点を克服できると人間液中バイオ マーカーのスクリーニングが脳損傷の早期診断に役立つし、要求につながる神経保護9を必要とする新生児の id。尿中のカテコールアミンは、流体と俊関数にリリースそれらの量間の直接の相関関係のため、簡単で明白なインデックスをすることができます。
体液、脳脊髄液 (CSF) と血漿中ない既存の外傷性プロシージャを介して取得する簡単とも接着タンパク質や面倒につながるその他の不純物による干渉を取り除くために非常に困難ですし、時間のかかるサンプリング プロセスが繰り返し検出に適しています。また、子供のため、外傷性ファッションのサンプルを得ることはほとんど不可能です。したがって、尿のサンプリング、サンプリングの他の形態よりだ非侵襲的、操作しやすい、繰り返し行うことができます。豊富な尿サンプルは、格納、および生体試料の他の形態上の大きな利点を表示する簡単です。
Radioenzymic 試金10、酵素免疫吸着測定法11、ボルタンメトリー12熱レンズ分光法13などの体液中のカテコールアミンを定量化するための主な方法です。しかし、欠点が存在するなど複雑な操作および検出が難しい複数のターゲット。今日では、支配的な解析手法は高速液体クロマトグラフィー (HPLC)14、その高い感度と優れた選択性のため機密性の高い電気化学15または蛍光検出16と相まっています。液体クロマトグラフィーなどのタンデム質量分析技術/質量分析法 (LC/MS) と神経伝達物質の定量化、液体クロマトグラフィー/質量分析/質量分析 (MS/LC/MS) 分析を高達成することができます正確性と特異性の17,18。ただし、高価な計測器としてメソッドを従来のほとんどの所で普遍的に適用することは困難すること大幅に修飾のマンパワー MS 技術が必要です。HPLC-ECD システムと最も慣習的および臨床的研究所の整った一般化学定量に使用する研究グループのための一般的な良い選択となっているが、導入システムにきれいに、サンプルが必要マイクロ ボリューム19。したがって、それは浄化し、解析の前にサンプルを凝縮する非常に重要なのです。浄化のステップのための古典的な方法は液液抽出14,15、20活性アルミナ列21,22 を含む、オフラインの固相抽出と diphenylborate (DPBA) 錯体23,24,25,26。
県内面ミヨンホ李ら200727以来人間の尿からカテコールアミンを個別に抽出するのに吸着剤としてクラウン エーテルで化学修飾した高分子樹脂を使用しています。また、2006 年に Haibo 彼ら。functionalizable ナノ多面体オリゴマー シルセスキオキサン (ポス) 基ナノ複合材料とカテコールアミンの濃縮に適用するボロネート親和関係抽出剤として県の簡易合成アプローチを実証尿 (ノルアドレナリン、アドレナリン、イソプレナリン)28.彼らはまたナノ エレクトロスピニングと呼ばれるナノスケールの高分子の繊維状物質を形成する技術を使用して、仕事を達成するナノ材料の利用をしました。静電紡糸プロセスは、動作電圧を制御し、他のパラメーター29と共に紡績ソリューションの内容を変更、径、形態、および製品の空間配置を調整できます。従来の SPE カートリッジと比べると、ナノファイバー エレクトロスピニングが極めて適当で抽出し、複雑なマトリックスからターゲット analytes を豊かに、検体を高効率で吸着する表面面積、体積率が高いが備わっていますし、ターゲット化合物の便利な添付ファイルを許可するより容易に制御表面物性を示します。これらの特性はそれらに SPE 吸着、固相と脱着溶剤量30,31,32,33を大幅に削減のための良い選択肢を作る。尿中カテコールアミン、エレクトロスピニング ナノファイバー PCE ポリスチレンと apolymeric クラウン エーテルから成る 3 つのカテコールアミン (NE, E、および DA)34を選択的に抽出する使用されました。紙は、NE、E、および DA は、水素結合の形成によるカテコールアミンをバインドするための正しいジオメトリに基づいていた目標をクラウン エーテルを選択的に吸着を示した。結果は効果的に生体試料に含まれている他の干渉の化合物を削除する素材のクラウン エーテルを表示されます。このレポートに触発され、手法によって開発された動物の選択的な抽出のエレクトロスピニング複合ナノファイバー PCE PS の構成の使用
本稿では、34 E、NE と DA もの MHPG および DOPAC、尿中代謝物で正常に解析するだけでなく採用し、メソッドが以前に報告しています。また吸着過程のメカニズムの新たな可能性を探ります。メソッドは、満足の抽出効率と 5 検体の選択性を示しメソッドは、周産期脳障害と健常乳児の尿の分析で検証しました。

<table><tbody><tr><td>200 &micro;</td><td>PFSPE</td>抽出鋼棒(直径約0.5ミリメートル)のためのナノファイバーPCE-PSナノファイバー材料を含むLピペットチップ<td></td><td></td>カラム</tr>は、カラム<tr><td>ガスタイトプラスチックシリンジ(5ミリリットル)</td><td></td><td></td>に<td></td></tr><tr><td></td><td>ナノファイバーを充填</td>し、先端メタノールSinopharm化学試薬株式会社67-56-1の端に溶液を圧縮します<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジフェニルボリン酸 2-アミノエチルエステル(DPBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>複合試薬</td></tr><tr><td>ノルエピネフリン(NE)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MHPG)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>分析物</td></tr><tr><td>エピネフリン(E)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3、4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>分析物</td></tr><tr><td>ドーパミン(DA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H-8502</td><td>分析物</td></tr><tr><td>3、4-ジヒドロキシベンジルアミン臭化水素酸塩(DHBA)</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>インテリアラベル</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>エルリアントおよび移動相</td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7664-38-2</td><td>eluriant</td></tr><tr><td>uric acid</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>69-93-2</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>クレアチニン</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>60-27-5</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>三ナトリウムクエン酸</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>6132-04-3</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo.、株式会社</td><td>7447-40-7</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>シノファーム化学試薬株式会社</td><td>12125-02-9</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>シノファーム化学試薬株式会社</td><td>SWC0140326</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>シノファーム化学試薬株式会社</td><td>62-76-0</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>シノファーム化学試薬株式会社</td><td>7757-82-6</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>二ナトリウムリン酸水素</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10039-32-4</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>57-13-6</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-14-5</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10034-99-8</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10035-04-8</td><td>人工尿</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-01-0</td><td>人工尿ク</td></tr><tr><td>エン酸</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>77-92-9</td><td>人工尿および移動相</td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>34124-14-6</td><td>移動相</td></tr><tr><td>単金属オルトリン酸ナトリウム</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7558-80-7</td><td>人工尿および移動相</td></tr><tr><td>1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>22767-50-6</td><td>移動相</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>1310-73-2</td><td>移動相</td></tr><tr><td>フェニルボロン酸カラム(PBAカラム)</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>PBA抽出</td></tr><tr><td>Inertsil&reg;ODS-3 5 & マイクロ;m 4.6&times;150 mm カラム</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>分離用HPLCカラム</td></tr><tr><td>島津製作所 SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER</td><td>島津製作</td><td></td>所 島津製作所 <td>LC-20AD</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>島津製作</td>所 <td>LC-20AD</td><td>HPLCポンプ</td></tr> 島津製作所 <tr><td>L-ECD-60A 電気化学検出器</td><td>島津製作</td>所<td>L-ECD-60A</td><td>分析対象物用検出器</td></tr><tr><td>ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System</td><td>Micromeritics, USA</td><td></td><td>Surface and Porosity Analyzer&nbsp;</td></tr></tbody></table>

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

神経系機能と関連疾患を評価する上で非常に重要なは、抽出と体液中のカテコールアミン神経伝達物質の分析が、その精密測定、まだ挑戦。多くのプロトコルは、各種機器、高圧液体クロマトグラフィー (HPLC) を含む神経伝達物質測定について記載されています。しかし、避けられない複数のターゲット検出ハードや複雑な操作などの欠点があり、現在、支配的な解析手法がまだために敏感な電気化学的または蛍光検出と相まって高速液体クロマトグラフィーその高い感度と優れた選択性。作曲エレクトロスピニング複合ナノファイバーを用いた幼児の実際の尿サンプルの前処理と電気化学検出高速液体クロマトグラフィー ECD) 高圧液体クロマトグラフィーによるカテコールアミンの検出のための詳しいプロトコルの説明ここでは、高分子吸着剤としてポリスチレンとクラウン エーテル繊維充填固相抽出 (PFSPE) 法とも呼ばれます。尿サンプルはナノファイバー満載固相カラムとどのようにサンプルの分析が急速に濃縮することができます、簡単に precleaned することができますが、脱着し、ECD システム上で検出された方法を紹介しています。PFSPE 大幅減少し、時間、経費、およびターゲットの損失の削減を可能にする生物学的サンプル前処理手順を簡素化します。
全体的にみて、この作品は 3 つ (ノルエピネフリン (NE)、(e)、ドーパミン (DA)) モノアミン神経伝達物質の一斉分析法との 2 つの高速液体クロマトグラフィー ECD システムと結合した固相抽出のためのシンプルで便利なプロトコルを示しています乳児の尿中代謝 (3-メトキシ-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) および 3, 4-ジヒドロキシ-フェニル酢酸 (DOPAC))。確立されたプロトコルは、尿中カテコールアミンの違いとハイリスク周産期脳障害児と健常者とその代謝物の評価に適用しました。比較分析では、尿中 MHPG のカテコールアミン代謝物が乳児の脳の損傷のリスクがある場合の早期診断のための重要な候補者マーカーをかもしれないことを示す、2 つのグループ間に有意差を明らかにしました。

このプロトコルは、尿サンプルを前処理し、HPLC-ECD システムを介して検出のための 5 つのカテコールアミンを豊かに簡便な PFSPE 法プロセスの図を図 1に示します。プロトコルは、主に 4 ステップ活性化、読み込み、洗浄、および溶出 - PCE PS ナノファイバーと単純な固相抽出装置の少量と相まって含まれています。PCE PS ナノファイバーの形態は表面および気孔率アナライザーを使用して評価された (材料の表を参照してください)。テクスチャのプロパティの賭け (プラス、エメットとテラー) 表面積、細孔容積と細孔径-2.8297 m2 g-1、0.009 cm3 g-112.76 され、nm、それぞれ。これらのデータは、プロトコルで使用される材料では、高吸着効率とプロトコルで下げられたバインディング pH に貢献するかもしれない表面のナノスケール細孔を示します。
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3 つのモノアミン神経伝達物質の一斉分析や乳児の尿中代謝物の 2 つの (ECD) の電気化学検出高速液体クロマトグラフィー (HPLC) に結合する便利な固相抽出を提案する.脳障害の早期診断のための潜在的なバイオ マーカーとして代謝物 MHPG を識別するも幼児のため。

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

この手順の全体的な目標は、電気化学的検出を備えた高圧液体クロマトグラフィーと組み合わせた便利な固相抽出を介して、乳児の尿中の3つのモノアミン神経伝達物質とその代謝産物を同時に特定することです。この手法は、完全サンプル中の不安定な標的化合物を短時間で簡単に操作でき、予測・決定することができます。サンプルは、繊維を充填した細い固体表面クォーラムで簡単に事前洗浄でき、サンプル中の分析物は、電気化学検出システムで容易に濃縮、溶解、検出できます。この方法を思いついたのは、生体液中のカテコールアミン神経伝達物質の抽出と分析が、耐性機能と関連疾患の評価に重要であることに気付いたときでした。この方法に不慣れな人は、光への曝露を避けなければならず、前処理時間をできるだけ短くする必要があるため、苦労するでしょう。その手順を実演するために、私たちの研究室の博士課程の学生であるLanlan WeiとQing Hanの2人が参加しています。まず、2ミリグラムの化合物を1ミリリットルの蒸留水に溶解することにより、DPBA溶液の1ミリリットルあたり2ミリグラムの原液を調製します。溶液は摂氏4度の暗闇で保管してください。分析種エクステンダーを調製する際は、カテコールアミンの化学構造と特性が不安定であり、カテコールアミンは容易に分解するため、調製プロセスは非常に速くなければならず、薄い日光への曝露を避ける必要があります。ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、MHPG、DOPAC、および内部標準DHBAの1.0ミリグラムを別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れて計量します。1.0ミリリットルの蒸留水を加えて、0.01モル/リットルの塩酸溶液に溶解する必要があるエピネフリンを除く各化合物を溶解します。.調製した標準試料を、分析種が完全に溶解するまで、暗所で高速で振動させます。これらは一次在庫であり、摂氏マイナス20度で最大数週間保存できます。ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、DOPAC、およびMHPGの二次分析物ストックを調製するには、各一次分析物ストックの5マイクロリットルを別々の5ミリリットルの遠心分離チューブ内の蒸留水4, 975マイクロリットルに移します。これらの溶液を毎日新鮮に調製し、使用するまで摂氏4度の暗所で溶液を保管します。DHBAの場合、5マイクロリットルの一次ストックを5ミリリットルの遠心分離管内の蒸留水4, 995マイクロリットルに移し、摂氏4度で別々に暗所に保管します。二次分析種ストックでさらに希釈して、標準曲線を作成します。溶液を摂氏4度の暗闇で保存し、毎日新鮮なものを準備します。次に、適切な濃度の標準ストックを使用して、ECD検出器の最適な電圧をテストします。電圧を変化させて、分析種が最高のピーク外観を持つ値を見つけます。10ミリリットルの溶離液溶媒を調製するには、5.5ミリリットルの蒸留水を使用し、次に1.5ミリリットルのアセトニトリルと3ミリリットルのリン酸を水に一滴ずつ加えます。移動相を調製するには、テキストプロトコールに記載されている成分をクリーンな 1 リットルのボトルに測定します。40ミリリットルのアセトニトリルと蒸留水を1, 000ミリリットルに加えます。溶液中の物質がすべて溶解するまで、15分間超音波で攪拌し、振動させます。ガラス電極付きのpHメーターを使用して、飽和水酸化ナトリウム溶液で移動相のpH値を4.21に調整します。0.45 ミクロンのポリフッ化ビニリデン微多孔質メンブレンと真空吸引装置で移動相をろ過し、不純物を除去します。超音波振動を15分間使用して、使用前に毎回移動相を脱気します。次に、尿サンプルを1,510倍Gで室温で10分間ボルテックスおよび遠心分離して、ほとんどの微粒子干渉を除去します。上清を集め、さらなる実験のために沈殿物を捨てます。分析種を効果的に抽出するには、遠心分離後すぐにパックドファイバー固相抽出(PFSPE前処理)に進みます。ナノファイバーを活性化するには、5ミリリットルのシリンジを使用して、100マイクロリットルのメタノールと100マイクロリットルの水をPFSPEカラムに順次押し込みます。尿サンプルは、その疎水性を改善し、カテコールアミンと代謝物が繊維に吸収されるのを助けるために、DPPA溶液と混合する必要があります。DHBA溶液も内部標準として追加する必要があります。尿サンプル100マイクロリットルを、2ミリグラム/ミリリットルのDPBA溶液100マイクロリットルとDHBA内部標準液100マイクロリットルの30マイクロリットルを0.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに混合します。次に、混合サンプル溶液を空気圧の力を使用して5ミリリットルのガスタイプのプラスチックシリンジでPFSPEカラムに押し込みます。5 ミリリットルのガス型プラスチックシリンジを使用して 100 マイクロリットルの DPBA 溶液を SPE カラムに充填し、溶液を空気圧でカートリッジにゆっくりと押し込み、カラムを 3 回浸出します。このすすぎステップが必要なのは、DPBA溶液が分析物を保持したまま不純物を除去できるため、分析物の感度と選択性が向上するためです。次に、50マイクロリットルの溶離液をPFSPEカラムにロードし、カラムに押し込み、0.5ミリリットルのエッペンドルフチューブで溶出液を収集します。HPLC脱気器をオンにして、システム内の空気を脱気します。サンプル分析の前に、移動相を使用してシステムを 0.5 時間以上実行し、平衡化してベースラインノイズを低減する必要があります。自動サンプラーを使用して溶出液の 20 マイクロリットルをサンプリングし、HPLC ECD システムに注入します。実行が完了したら、ディテクタ インターフェイスを使用してディテクタ セルをオフにします。検出器の背面にあるスイッチでセルの電源を切らないでください、これは機器を損傷する可能性があるためです。移動相組成を10%メタノールと90%水に手動で変更します。30分以上運転した後、移動相をHPLCグレードのメタノールに手動で交換します。システムを約15分間運転して、メタノールで保護します。推奨実行時間内にこのステップを実行しないと、カラムと検出器が損傷する可能性があります。フローをオフにしてから、デガッサーをオフにしてください。テキストプロトコルに記載されているカテコールアミン分析に進みます。ターゲットと内部標準を含むスパイク水サンプルのクロマトグラムを抽出せずに示しています。プロトコールのHPLC条件下では、PFSPE法の5つのターゲットピークは十分に分離されており、市販のフェニルボロン酸カートリッジで抽出されたピークよりも大幅に高くなっています。また、PBA カートリッジの抽出結果には DOPAC のピークが現れなかったため、PBA カラムで DOPAC を抽出できなかったことが示されています。尿サンプルが抽出されたとき、PFSPE法は良好なピーク同定でターゲットを抽出するだけでなく、尿中の干渉のほとんどを取り除くこともできました。各化合物の検量線は、ピーク面積の比をプロットして作成し、低濃度で良好な直線性を示しました。実際の尿サンプルでの検証のために、28人の高リスク乳児と22人の健康な乳児の尿サンプルを検査しました。一部のカテコールアミンは高リスク群と健常者の間で有意差がなかったが、高リスク乳児は対照群よりもMHPG代謝物の量が多かった。したがって、尿中MHPGのレベルは、高リスク乳児の早期発見のための潜在的なマーカーになる可能性があります。一度習得すれば、このテクニックは数分で完了します。手順を試みるときは、燃えがらを新鮮に準備し、心配な作業を迅速に行い、直射日光にさらされないようにすることを覚えておくことが重要です。吸収およびすすぎステップでのジフェニルホウ酸溶液の添加も重要です。この手順に続いて、血漿または脳脊髄液中のカテコールアミンおよび代謝産物の終結の欠如を測定する。Alsliverは、他の生体液の試験におけるこのプロトコルの普遍性を決定するために実施することができる。その開発後、この技術は、研究者が神経発達障害と子供のサンプル中の尿中カテコールアミンのレベルとの関係を研究する道を開きました。このビデオを見た後、nairの数字と簡単なデバイスを使用して固相抽出法を実行する方法をよく理解しているはずです、PCE PS空気線維企業廃棄物DPBAは、尿サンプル中のカテコールアミン神経伝達物質をクリーンアップするのに役立ちます。この技術は、乳児の脳損傷のリスクがあるカシスの早期診断にまで及びます。比較解析の結果、自閉症児の単項MHPGに異常な差があることが明らかになったため、カテコールアミン代謝物が重要な候補マーカーである可能性が示された。

a-convenient-method-for-extraction-analysis-with-high-pressure-liquid

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

このプロトコールは、細胞からの遊離およびエステル化された生理活性脂肪酸の抽出および分析を実証します。脂肪酸は、安定同位体希釈、キラル液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気化学イオン化、多重反応モニタリング質量分析(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)を用いて正確に定量されます。...

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 -...

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

ポストカラム誘導体化(PCD)を採用する方法のための反応流高速液体クロマトグラフィーカラムの使用に関するプロトコールが提示されます。...

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

リアルタイム高分解能質量分析および多変量統計解析で直接分析による植物材料の種の同定のための方法が提供されます。...

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

混合モードカチオン交換（MCX）96ウェルマイクロプレート上での効率的な固相抽出と組み合わせた選択的かつ高感度の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）法を、遊離3-ニトロチロシンの測定のために開発した3-NT）をヒト尿中に高スループットで導入することができ、これは臨床用途に適している。...

臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。...

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。...

天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド

学ぶ固体抽出と高速液体クロマトグラフィーによる乳児尿中のカテコールアミン神経伝達物質と代謝物の同時分析法。この手法は脳損傷の早期診断バイオマーカー探索に有用です。

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

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