抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

この手順の全体的な目標は、電気化学的検出を備えた高圧液体クロマトグラフィーと組み合わせた便利な固相抽出を介して、乳児の尿中の3つのモノアミン神経伝達物質とその代謝産物を同時に特定することです。この手法は、完全サンプル中の不安定な標的化合物を短時間で簡単に操作でき、予測・決定することができます。サンプルは、繊維を充填した細い固体表面クォーラムで簡単に事前洗浄でき、サンプル中の分析物は、電気化学検出システムで容易に濃縮、溶解、検出できます。

この方法を思いついたのは、生体液中のカテコールアミン神経伝達物質の抽出と分析が、耐性機能と関連疾患の評価に重要であることに気付いたときでした。この方法に不慣れな人は、光への曝露を避けなければならず、前処理時間をできるだけ短くする必要があるため、苦労するでしょう。その手順を実演するために、私たちの研究室の博士課程の学生であるLanlan WeiとQing Hanの2人が参加しています。

まず、2ミリグラムの化合物を1ミリリットルの蒸留水に溶解することにより、DPBA溶液の1ミリリットルあたり2ミリグラムの原液を調製します。溶液は摂氏4度の暗闇で保管してください。分析種エクステンダーを調製する際は、カテコールアミンの化学構造と特性が不安定であり、カテコールアミンは容易に分解するため、調製プロセスは非常に速くなければならず、薄い日光への曝露を避ける必要があります。

ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、MHPG、DOPAC、および内部標準DHBAの1.0ミリグラムを別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れて計量します。1.0ミリリットルの蒸留水を加えて、0.01モル/リットルの塩酸溶液に溶解する必要があるエピネフリンを除く各化合物を溶解します。.調製した標準試料を、分析種が完全に溶解するまで、暗所で高速で振動させます。

これらは一次在庫であり、摂氏マイナス20度で最大数週間保存できます。ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、DOPAC、およびMHPGの二次分析物ストックを調製するには、各一次分析物ストックの5マイクロリットルを別々の5ミリリットルの遠心分離チューブ内の蒸留水4, 975マイクロリットルに移します。これらの溶液を毎日新鮮に調製し、使用するまで摂氏4度の暗所で溶液を保管します。

DHBAの場合、5マイクロリットルの一次ストックを5ミリリットルの遠心分離管内の蒸留水4, 995マイクロリットルに移し、摂氏4度で別々に暗所に保管します。二次分析種ストックでさらに希釈して、標準曲線を作成します。溶液を摂氏4度の暗闇で保存し、毎日新鮮なものを準備します。

次に、適切な濃度の標準ストックを使用して、ECD検出器の最適な電圧をテストします。電圧を変化させて、分析種が最高のピーク外観を持つ値を見つけます。10ミリリットルの溶離液溶媒を調製するには、5.5ミリリットルの蒸留水を使用し、次に1.5ミリリットルのアセトニトリルと3ミリリットルのリン酸を水に一滴ずつ加えます。

移動相を調製するには、テキストプロトコールに記載されている成分をクリーンな 1 リットルのボトルに測定します。40ミリリットルのアセトニトリルと蒸留水を1, 000ミリリットルに加えます。溶液中の物質がすべて溶解するまで、15分間超音波で攪拌し、振動させます。

ガラス電極付きのpHメーターを使用して、飽和水酸化ナトリウム溶液で移動相のpH値を4.21に調整します。0.45 ミクロンのポリフッ化ビニリデン微多孔質メンブレンと真空吸引装置で移動相をろ過し、不純物を除去します。超音波振動を15分間使用して、使用前に毎回移動相を脱気します。

次に、尿サンプルを1,510倍Gで室温で10分間ボルテックスおよび遠心分離して、ほとんどの微粒子干渉を除去します。上清を集め、さらなる実験のために沈殿物を捨てます。分析種を効果的に抽出するには、遠心分離後すぐにパックドファイバー固相抽出(PFSPE前処理)に進みます。

ナノファイバーを活性化するには、5ミリリットルのシリンジを使用して、100マイクロリットルのメタノールと100マイクロリットルの水をPFSPEカラムに順次押し込みます。尿サンプルは、その疎水性を改善し、カテコールアミンと代謝物が繊維に吸収されるのを助けるために、DPPA溶液と混合する必要があります。DHBA溶液も内部標準として追加する必要があります。

尿サンプル100マイクロリットルを、2ミリグラム/ミリリットルのDPBA溶液100マイクロリットルとDHBA内部標準液100マイクロリットルの30マイクロリットルを0.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに混合します。次に、混合サンプル溶液を空気圧の力を使用して5ミリリットルのガスタイプのプラスチックシリンジでPFSPEカラムに押し込みます。5 ミリリットルのガス型プラスチックシリンジを使用して 100 マイクロリットルの DPBA 溶液を SPE カラムに充填し、溶液を空気圧でカートリッジにゆっくりと押し込み、カラムを 3 回浸出します。

このすすぎステップが必要なのは、DPBA溶液が分析物を保持したまま不純物を除去できるため、分析物の感度と選択性が向上するためです。次に、50マイクロリットルの溶離液をPFSPEカラムにロードし、カラムに押し込み、0.5ミリリットルのエッペンドルフチューブで溶出液を収集します。HPLC脱気器をオンにして、システム内の空気を脱気します。

サンプル分析の前に、移動相を使用してシステムを 0.5 時間以上実行し、平衡化してベースラインノイズを低減する必要があります。自動サンプラーを使用して溶出液の 20 マイクロリットルをサンプリングし、HPLC ECD システムに注入します。実行が完了したら、ディテクタ インターフェイスを使用してディテクタ セルをオフにします。

検出器の背面にあるスイッチでセルの電源を切らないでください、これは機器を損傷する可能性があるためです。移動相組成を10%メタノールと90%水に手動で変更します。30分以上運転した後、移動相をHPLCグレードのメタノールに手動で交換します。

システムを約15分間運転して、メタノールで保護します。推奨実行時間内にこのステップを実行しないと、カラムと検出器が損傷する可能性があります。フローをオフにしてから、デガッサーをオフ

テキストプロトコルに記載されているカテコールアミン分析に進みます。ターゲットと内部標準を含むスパイク水サンプルのクロマトグラムを抽出せずに示しています。プロトコールのHPLC条件下では、PFSPE法の5つのターゲットピークは十分に分離されており、市販のフェニルボロン酸カートリッジで抽出されたピークよりも大幅に高くなっています。

また、PBA カートリッジの抽出結果には DOPAC のピークが現れなかったため、PBA カラムで DOPAC を抽出できなかったことが示されています。尿サンプルが抽出されたとき、PFSPE法は良好なピーク同定でターゲットを抽出するだけでなく、尿中の干渉のほとんどを取り除くこともできました。各化合物の検量線は、ピーク面積の比をプロットして作成し、低濃度で良好な直線性を示しました。

実際の尿サンプルでの検証のために、28人の高リスク乳児と22人の健康な乳児の尿サンプルを検査しました。一部のカテコールアミンは高リスク群と健常者の間で有意差がなかったが、高リスク乳児は対照群よりもMHPG代謝物の量が多かった。したがって、尿中MHPGのレベルは、高リスク乳児の早期発見のための潜在的なマーカーになる可能性があります。

一度習得すれば、このテクニックは数分で完了します。手順を試みるときは、燃えがらを新鮮に準備し、心配な作業を迅速に行い、直射日光にさらされないようにすることを覚えておくことが重要です。吸収およびすすぎステップでのジフェニルホウ酸溶液の添加も重要です。

この手順に続いて、血漿または脳脊髄液中のカテコールアミンおよび代謝産物の終結の欠如を測定する。Alsliverは、他の生体液の試験におけるこのプロトコルの普遍性を決定するために実施することができる。その開発後、この技術は、研究者が神経発達障害と子供のサンプル中の尿中カテコールアミンのレベルとの関係を研究する道を開きました。

このビデオを見た後、nairの数字と簡単なデバイスを使用して固相抽出法を実行する方法をよく理解しているはずです、PCE PS空気線維企業廃棄物DPBAは、尿サンプル中のカテコールアミン神経伝達物質をクリーンアップするのに役立ちます。この技術は、乳児の脳損傷のリスクがあるカシスの早期診断にまで及びます。比較解析の結果、自閉症児の単項MHPGに異常な差があることが明らかになったため、カテコールアミン代謝物が重要な候補マーカーである可能性が示された。