Name: マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶマウス胚の心臓前駆細胞集団の定量的ホールマウント免疫染色解析法。E8期の胚を用いて組織動態の定量的情報を得られ、再現性の向上した自動解析パイプラインで心臓発生を研究できます。

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この作品は、NIH/NHLBI R56 HL128646 と Mindich 子保健開発研究所 (MCHDI) (n.d.) に ISMMS での資金を供給されました。E.B. は、NIH/NIDCR 見習 T32 HD075735 によってサポートされます。マウント シナイ P30 CA196521-がんセンター助成金でティッシュ癌研究所で部分的にサポートされているシナイ山で、Icahn 医学部の顕微鏡コアで顕微鏡と画像解析を行った.

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとシナイ山で、Icahn 医学の利用委員会によって承認されている。
 1 収穫と処理心臓三日月胚 <ol><li>スタッド肥沃な男性と肥沃な雌マウスのチームメイト。</li>。
	鈍的プローブまたは鉗子を使用して膣に交尾の有無をチェック <li>プラグ。プラグイン検出の日の正午の萌芽期と見なされます (E) (参照してください 図 1 a の完全なタイムライン) 0.5 日 。
	注: プラグを確認するか朝は、彼らが 1 日を通して失われると</li>。
	<li>8 番目 の日 (E8.25) の朝、CO 2 吸入、または地方および制度上の規制によると妊娠中のダムを犠牲します 。
	注: 正確なタイミングのひずみ依存をすることができますおよび形態によって、経験的に決定する必要があります</li>。
	<li>は、地域をきれいにし、放出を最小限にする 70% のエタノールとマウスの腹部をスプレーします。腹部切開の皮膚と体壁の両方を実行することによって内臓を公開します</li>。
	<li>子宮を見つけるし、動物から全体の子宮角を慎重に取り外します。子宮頸の終わりに進む中から脂肪をトリミング 1 卵管上切断して起動します。子宮頸部を切って、卵管子宮全体を解放する切断の上部端まで続行します</li>。
	リン酸 <li>10 cm で子宮の場所皿はバッファリング生理食塩水 (PBS、pH 7.4) 過剰な血を洗い流すためです。サブ胚が含まれているそれぞれの deciduum と mesometrium を切断することによって子宮を解剖します。新鮮な PBS の 6 cm 皿に胚を転送します</li>。
	<li>解剖顕微鏡の下で脱落膜組織から子宮の組織を除去する微細鉗子 (#5) を使用します</li>。
	<li>使用鉗子は、胚を明らかにする deciduum の胚の半分の先端を慎重にスライスします。胎児を押し出すと慎重に胎児を引き出す deciduum をピンチします</li>。
	<li>( 図 1 b) 胚の形態を損なうことがなく可能な限り離れて初期胚胚体外組織を解剖します</li>。
	<li>は、新鮮な PBS の 1.5 mL のチューブに胚を置くし、氷の場所に転送ピペットを使用します。続行する前に、残りの胚に 1.7 〜 1.9 を繰り返します</li>。
	<li>吸引 PBS PBS で 1 回洗浄.PBS を吸い出しなさい 。
	注: は、損傷や胚を乾燥せずにできるだけ多くの PBS を削除しようとします。胚の損失を避けるためにすべての手順でソリューションを手動で削除を推奨します</li>。
	室温 1 時間 PBS の <li>修正胚 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 
	注: 胚を固定することができます 4 宿泊 (O/N) ° C</li>
	<li>PBS で 3 回すすぎ。蛍光抗体法を続行する準備ができるまで、4 ° C で胚を維持します 。
	注: 一時停止ポイント。胚安全に格納できる PBS 4 ° C で数週間</li>。
</ol> 2。蛍光抗体染色 注: 以下の培養条件は異なるスケジュールに合わせて調整できます。穏やかな揺れや長い潜伏のすべてのステップのロッキングを使用をお勧めします。
<ol><li>PBS を削除し、1 mL のブロック バッファー (1% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の 0.5% サポニン) を追加します</li>。
	<li>インキュベート、少なくとも 4 時間室温これは、こともできます O/N 4 ° C</li>
	<li>は、ブロック バッファーを削除し、ブロック バッファーで希釈した一次抗体の混合物を追加します。O/N 4 ° c. で孵化させなさい 
	注: は、材料使用し、希釈を提案した抗体の説明のセクションを参照してください。抗体希釈液は経験的に決定する必要があります。心臓の三日月の参照汚れとして Nkx2 5 の使用お勧めおよび下流にキー画像セグメンテーションと分析手順は、</li>。
	<li>吸引により一次抗体を削除します</li>。
	<li>0.1% で、1 h を 3 回洗浄 PBS でトリトン</li>。
	<li>は、洗浄を削除し、ブロック バッファーで希釈した二次抗体の混合物を追加します。室温 3 時間インキュベートします。これは、こともできます O/N 4 ° C</li>
	<li>洗浄 3 回 0.1% で、1 h の PBS のトリトン。これは、こともできます O/N 4 ° C</li>
	<li>対比染色 4 &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS で 10 分の 
	注: この対比染色を同時実行できる二次抗体と</li>。
	<li>0.1% で各 5 分の 2 回洗う PBS でトリトン</li>。
	<li>はゆっくりと耐フェード マウント メディア (2 w/v n-プロピルガ レート (nPG)、90% のグリセロール、1x PBS; で胚を中断します。詳細についてを参照してください材料セクション)。マウントする前に、少なくとも 1 h を平衡することができます。胚耐フェード ソリューションにドロップのため定期的にチューブを軽くフリックします 。
	注: 一時停止ポイント。マウントし、イメージの準備ができるまで胚耐フェード ソリューションで数日間格納できます</li>。
</ol> 3。顕微鏡検査のための胚をマウント <ol><li>準備顕微鏡スライド両面テープまたはシリコーン スペーサーを使用して取り付け。両面テープを使用するなら 5-6 層約 15-20 mm の 2 つの並列スタック離れて。胚を入れ、coverslip ( 図 1) を固定するのに十分なスペースを残してこれ</li>。
	<li>は、両面テープの間に、スライドに耐フェードの 15 μ L のドロップを配置します。慎重にスライドを 1 つの胚を転送します 。
	注: 2 つ以上の胚は、スライドに配置できます。しかし、その後オリエンテーション手順は複数の胚を難しく、写真漂白につながる可能性があります長い期間をイメージングします</li>。
	<li>微細鉗子を用いた解剖顕微鏡の下で胚の位置前方面がスライドの長軸に沿って体軸方向のスライドからなるような。取り付けセットアップの模式図、 図 1 を参照してください</li>。
	<li>慎重に両面テープの 1 つのスタックの 1 つの側面を休憩して鉗子を使用して他のテープに接触するまで、coverslip をそっと下げるサンプル上観察を配置します 。
	注: 手順 3.3 と 3.4 イメージングのための胚の向きが正しいことを確認する重要です。前方方向の後部に沿って coverslip を下げることによって胚をロールバックできませんする必要があります、心臓の三日月地域は倒立顕微鏡のイメージングに最適なスライドから離れる方向にとどまるです</li>。
	<li>ピペットを使用して追加の耐フェード スライドとストレージ/イメージング中に死んでからサンプルを維持する coverslip の間を追加します</li>。
</ol> 4。共焦点イメージング <ol><li>取得画像ビューの 1 つのフィールドでキャプチャする全体心臓三日月地域では、最高倍率の目的を使ってします。ナイキストのサンプリング レートを使用して、x ・ y ・ z のボクセルの大きさを決定します。ほとんどの顕微鏡メーカーがあります、&#34; を最適化 &#34; ナイキスト サンプリングが確実にボタン 。
	注: は心臓三日月地域全体を描くが、ここでは、有益な Nkx2 5 の染色です。Z ステップ サイズを小さく (サンプリング) 良い 3 D モデリングの結果になりますが、拡張集録時間および/またはいくつかのサンプルの漂白につながる可能性があります</li>。
	<li>は、イメージング最高画像の標準的なプラクティスを使用してパラメーターを設定します。すなわち、各 fluorophore の良い信号対雑音比を達成するため、利得を選択し、信号を飽和させることがなく広いダイナミック レンジを得られるレベルをオフセットする最低の可能なレーザー強度を使用します 。
	注: は、直接比較するサンプル間でパラメーターを画像と一致します。これは下流 3 D 分析と定量化のため特に重要です</li>。
</ol> 5。画像解析と定量の 3 D モデリング 注。このプロトコルの Imaris ソフトウェア パッケージを使用して画像を分析しました。同様の分析は、新しい別のパッケージを使用して可能かもしれない。以下の説明は、参照チャネル (すなわち Nkx2 5) の解析パイプラインと 1 つの実験水路 (すなわち YFP) をカバーしています。これらの手順を繰り返し、追加のチャネルを分析できます。例のデータセットは、以下の分析をレプリケートする使用できる提供されています。
<ol><li>Imaris アリーナ ビューに raw 画像データ セットを読み込むし、サーパス ビューで必要な胚のためのファイルを開きます。データは、MIP (最大) モードで 3 D ビューで読み込む必要があります。ディスプレイの調整ウィンドウを開き、参照チャネルのみを選択します</li>。
	良い可視化のために必要な場合、<li>はイメージのしきい値を調整します。この分析では、セグメンテーションの信号対雑音比が小さすぎる場合にガンマを調整します 。
	注: 非線型の調整では、ガンマ補正を実行している場合調整後の画像は強度の測定や比較のため使用できません。この段階で、信号対雑音比を満足できない場合に更なるイメージ事前処理 (すなわち照明修正、ガウス分布のぼかしやその他のフィルター) を実行できます。事前処理を行う場合は、データセットのすべてのイメージの処理前と同じ手順を実行する必要が</li>。
	<li>表面アルゴリズム対話参照チャネルの新しいサーフェスを作成します。
	<ol><li>を選択、&#34; のみ興味の地域をセグメント &#34; チェック ボックス</li>。
		<li>参照染色による線引きは領域 (ROI、すなわち 心臓の三日月形の領域) が含まれるように境界ボックス領域を調整します</li>。
		<li>は、ソース チャンネルのドロップ ダウン メニューからチャンネルを選択します。スムージング (z ボクセル サイズに等しい) の既定の設定が通常十分な実証的な最適化が必要な可能性があります。この分析では、スムージング z ボクセルの大きさの半分に等しいを使用します</li>。
		<li>絶対強度で実行するしきい値。表面がチャンネルの信号を超えて拡張されませんように調整スライダーを使用して下限値 。
		注: セルを簡単に線引きできる場所、特定の画像を含めることができます、&#34; 分割オブジェクトに触れる &#34; さらに背景からあなたの信号を分けるためのアルゴリズム</li>。
		<li>はボクセルの数やボリュームによってオブジェクトをフィルター処理し、アルゴリズム生成可能性のあるバック グラウンド (小さいまたは Nkx2 5 エリア外で見つかった) オブジェクトを拒否します。アルゴリズムを完了します</li>。
	</ol></li> <li>実験水路のマスク チャネルを作成新しく作成されたサーフェスの使用します。
	<ol><li>加工するサーフェスを選択、選択、&#34; マスク Sel... ͟ &#34; 編集ウィンドウから関数</li>。
		<li>は、対象 (すなわち YFP) 実験的チャネルを選択します。確認、&#34; マスクを適用する前にチャンネルを複製 &#34; チェック ボックスを選択します</li>。
	</ol></li> <li>表示調整の] ウィンドウ選択マスクのチャンネルのみ。次でマスクされたチャネル手順 5.3 5.3.5 新しいサーフェスを作成します 。
	注: この時点で、ように 3 D モデルの可視化を容易にするために各マスクの外観を調整する: 各サーフェスを選択し、必要に応じて、カラー タブ調整基本色と透明度を選択します。オーバー ラップ表面色は統合されません</li>。
	選択した各サーフェス体積データを取得する <li>は、[統計] タブを選択します。&#34; 詳細 &#34; サブ] タブで、選択 &#34; 平均値 &#34; ドロップ ダウン メニューから。表面の合計量は、生成された表の合計欄に見つけることができます 。
	注: 生成されたサーフェスには、誤ったフラグメント (つまり バック グラウンド信号から除外されていない分割またはメイン サーフェスから不連続領域中にフラグメント) が含まれている場合、必要があります合計ボリュームを手動で計算するかボリュームまたはボクセルの数によって表面をフィルターし、信号セグメントだけが計算に含まれていることを確認します。表面の各部分のボリュームを選択することによって見つけることができます &#34; すべての値 &#34; ドロップ ダウン メニューから。それぞれの値を選択すると、対応する領域が黄色、除外する値を決定する際に補助を表示します</li>。
</ol>

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</ol>

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上記のプロトコルでは、着床後胚の高品質全台紙の蛍光画像から定量的なデータを取得するための戦略について説明します。正しく実行されると、これらの手順によって生成される 3 D ボリューム データが交差形の比較分析および胚内の複数のドメインの使用できます。老舗参照構造と比較して新規な細胞集団を調査するとき説明するアプローチをマスキング面の信号、特定使用されます。
このアプローチが既存のアプローチ上の明確な利点を提供することと考えています。広視野イメージングと全体のマウントを蛍光抗体法は、携帯電話の解像度が欠けているが、組織レベルの情報を提供できます。逆に、連続切片の免疫組織はこれらのデータ不足全台紙画像の三次元の利点の詳細な細胞レベルの解像度を与えることができます。三次元共焦点イメージング プログラムはこれらの欠点が、このデータの定量の可能性をいくつか利用、ことを願っております私達のプロトコルより研究者から収集したデータを最大限に活用できるようになります。
ここでは、マーカー Nkx2 5 を使用して心臓の三日月を描くし、そのドメイ...

器官形成の研究は、発育中の胚の形態形成イベントの観測に頼っている長い。これらの研究は、よく定義された参照集団の付け蛍光染料やリネージュ トレース記者の組み合わせでの使用に依存します。1これらのラベルの相対的な位置を比較すると、情報は起源、動き、または興味の人口の究極の貢献に収集することができます。移植と運命マッピング実験開発の胚への貢献が検査されます、興味のセルの開始点を定義するのに形態学的ランドマークまたは非運動性系統に染料の注入のいずれかを使用します。2,3,4,5遺伝の系譜トレース実験は、実験操作せずラベル細胞集団に使用する明確に定義されたレポーター遺伝子と同じ概念を使用します。これらのアプローチの鍵は、高空間分解能、実験の場所の参照ラベルと判断することです。これらのアプローチは、着床前の開発の顕著な進展が得られているし、器官形成研究を外植体します。6,7,8,9
心臓形態の根底にある発達のイベントは近年ますますよく説明されています。10研究のこの分野での主要な発見の 1 つは、ユニークなマーカーの発現によって区別することができます前駆細胞集団の数の説明です。11これらの集団を含める最初と心の 2 番目のフィールド (急性肝不全と SHF) 日 (E) 8.25 マウス開発の胚の前方側に心臓三日月内で存在しています。12これらの人口は頻繁に検査広視野顕微鏡、蛍光アッセイを組織レベルの情報、およびシリアル断面を提供、高い携帯電話の解像度だけを提供するの組み合わせによって二次元空間情報。13したがって、これらの研究が大きく進歩した心臓の開発の私達の理解、利用可能なメソッドが限られている形態の深さ定量分析における調べるアプローチの必要性を作成するこれらの段階の間に、全体生物レベルでこれらの集団の組織。
最近、比較的簡単に細胞や構造の場で高解像度と高速アルゴリズム復元を可能にする共焦点顕微鏡と 3 D 画像解析の進歩従って複合体の詳細な研究の道を舗装細胞の構造。14計算力の増加と大きなデータ管理アルゴリズム、イメージング、データ セットのサイズの指数関数的増加に対処する開発分析今完全に自動化できます。15イメージング データ セットの自動解析は、公平であることの利点、それは入力データセットの品質と信頼性その後、ベスト ・ プラクティスを使用取得と画像の前処理中に最高の品質、公平な分析を確保することが不可欠です。16プロトコルは完全に自動化された、再現性の共有をすることができ、独自のソフトウェアによって使用されるアルゴリズムは、容易に独自の現代の知識を持った科学者が使用するライブラリで利用可能なまたはオープン ソース開発者向けツール。17
次のプロトコルでは、器官形成、心臓の開発中に心臓の三日月形の形成の 1 つのよく定義されたモデルのような分析を実行に必要な手順について説明します。具体的には、このプロトコルは、(1) 収穫する方法をについて説明しますと心臓の三日月形段階の胚を解剖、(2) 参照 (Nkx2 5) の全台紙の蛍光を実行と実験 (Foxa2Cre:YFP18,19) マーカー、(3)準備し、共焦点顕微鏡を用いた胚をイメージ、最後に (4) を分析し、高度な 3次元アプローチを使用して結果の画像を定量化します。心臓の三日月は適切な変更でここでは、例として使用される体節の段階の初期胚に原腸胚における複数系統の分析のためこのプロトコルを使用することがあります。

<table><tbody><tr><td>鈍いプローブ</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>トリトン</td><td>RPI</td><td>A4490</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ反Nkx2-5</td>サンタ<td>クルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-8697</td><td>1:100-1:500で使用</td></tr><tr><td>チキン反GFP</td><td></td><td>abcam ab13970</td><td>1:500で使用</td></tr><tr><td>ウサギ反Islet1</td><td>abcam</td><td>ab109517</td><td>1:100で使用</td></tr><tr><td>ウサギ反HCN4</td><td>ミリポア</td><td>AB5808</td><td>1:100で使用</td></tr><tr><td>488 アンチチキン</td><td>ジャクソンImmunoresearch</td><td>703-546-155</td><td>水に再溶解し、-20°Cで保存。最終濃度50%グリセロールのC。1:500で使用。</td></tr><tr><td>555 抗ヤギ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21432</td><td>1:500 で使用</td></tr><tr><td>647 抗ウサギ</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-606-152</td><td>水に再構成され、-20°Cで保存。最終濃度50%グリセロールのC。1:500で使用。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>n-ガレートプロピルシ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>2370</td><td>ストック溶液は、DMSOで20%w / vです。10x PBS1部と100%グリセロール9部を混合し、0.1部のストック溶液をゆっくりと加えて調製した作業溶液。</td></tr><tr><td>Superfrost Plus顕微鏡スライドVWR</td><td>サイエンティフィック</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mmカバースリップVWR</td><td>サイエンティフィック</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>イマリス8.4.1</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

日進月歩のイメージング技術の使用は、萌芽期の開発の高められた理解に広く貢献しています。着床前開発と器官形成は、着床前胚を画像から直接または生体内臓器 ex に取得することができますデータの高品質のため、これらの進歩から大いに恩恵を受けている研究の 2 つの領域です。着床前胚には、特に高空間分解能データが得られている、後期三次元再構成より影響を受けやすいされている.運命マッピングまたはトレースする遺伝的血統との組み合わせで知られている萌芽期の構造の高品質 3 D または体積データを取得に胚発生中に場所を取って形成イベントのより包括的な分析になります。
このプロトコルでは、キーの構造体は、心の発育中に形成のラベリング、視覚化、および開発心臓三日月内前駆細胞集団の定量化できるホール マウント免疫組織アプローチについて説明します。アプローチの設計のような細胞レベルおよび組織レベルの情報の両方を得ることができる方法。このプロトコルにより、ローカリゼーションとの間に特定の前駆細胞集団の組織を分析する機能を実現、心臓三日月の三次元空間再構成用共焦点顕微鏡と画像処理を使用して、この重要な心の開発の段階。重要なは、心臓の三日月の連続的マスキングと三日月内領域の後続の定量的測定では、参照抗体の使用もできます。このプロトコルのみ初期心開発の詳細な検査を行うことはできませんが、適応を持つ原腸胚初期の体節期マウス胚にほとんどの器官システムに適用する必要があります。

最終的なデータと分析の品質は (1) 整合性と切り裂かれた胚 (2) 高い特異性抗体の使用、撮像パラメーター (3) 適切なセットアップの形態に大きく依存します。破損した胚は面生成過程を混同し、定量分析を妨げます。正常解剖と段階的な胚の例を図 2 bに示します。胚は、抗体は非具体的によくバインドが卵黄嚢を外してさらに解剖することができます。ただし、卵黄嚢除去がように胚、堅牢性の低い下流処理中に注意が必要があります。
高品質の抗体とイメージングの適切な設定の組み合わせが高い信号対雑音比の画像を達成するために重要です。図 2A表示ラベル参照マーカーとして Nkx2 5 に対する抗体を用いて例画像心臓三日月と GFP の系譜トレースの人口のラベルに関心 (Foxa2Cre:YFP 心室の心臓血管前駆細胞) (補足参照画像やデータの raw ...

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

この方法の全体的な目標は、心臓器官形成中の心前駆細胞の局在と分布を定量的に評価することです。この方法は、正常な胚発生中の心前駆細胞集団の局在を観察することを可能にすることにより、心臓発生分野における重要な答えに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、体積画像から組織レベルのダイナミクスに関する定量的情報が得られることと、解析パイプラインを自動化して再現性を向上させることができることです。この方法は初期の心臓器官形成に関する情報を提供しますが、初期胚形成の一般的な研究や、関心のある他の臓器の形態形成にも適用できます。胚の8日目の朝、妊娠中のマウス腹部を70%エタノールで消毒し、皮膚と体壁の両方から腹部を切開します。1つの卵管の上から始めて、子宮の側面に沿って子宮頸部まで脂肪を慎重に解剖します。子宮頸部を切開し、もう一方の卵管切断の上端まで続けて子宮全体を解放します。新鮮なPBSを含む10センチメートルの皿で子宮から余分な血液を洗い流し、各脱離膜の間のメソメトリウムを切断します。解剖顕微鏡で新鮮なPBSが入った6センチメートルの皿に胚を移し、5番の細い鉗子を使用して脱落膜組織から子宮組織を切除します。次に、脱落膜の胚の半分の先端を慎重にスライスして胚を露出させ、脱落膜をつまんで最初の胚を慎重に押したり引き出したりします。動物の形態を損なうことなく、できるだけ多くの余分な胚組織を解剖し、トランスファーピペットを使用して、氷上の新鮮なPBSが入った1.5ミリリットルのチューブに胚を入れます。すべての胚が採取されたら、各チューブからPBSを吸引し、新しいPBSで胚をすすぎます。各チューブからPBSを完全に吸引した後、胚を4%パラホルムアルデヒドに室温で1時間固定し、続いて新鮮なPBSで3回洗浄した後、胚を摂氏4度で保存します。まず、PBSを1ミリリットルのブロッキングバッファーに交換し、室温で4時間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、ブロッキングバッファーを適切な一次抗体混合物と希釈したブロッキングバッファーと交換し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、過剰な抗体を吸引し、PBS中の0.1%Tritonで1回の洗浄につき1時間、胚を3回洗浄します。3回目の洗浄後、適切な二次抗体混合物を胚に加え、室温で3時間のインキュベーションを行い、その後、先ほど示したように3回の洗浄を行います。次に、PBS中のDAPIで胚を10分間対比染色し、続いて5分間の洗浄を2回行い、その後、胚を退色防止封入剤にゆっくりと懸濁し、定期的に穏やかにフリックしながら胚を少なくとも1時間平衡化させ、標本が溶液に落ちるのを助けます。胚をマウントする前に、胚ごとに1つの顕微鏡スライド上に15〜20ミリメートル間隔で5〜6層のダブルスティックテープを2つの平行に積み重ね、テープスタック間の各スライドに15マイクロリットルの退色防止培地を滴下します。1つの胚を各滴に慎重に移し、解剖顕微鏡と細かい鉗子を使用して、胚の前面がスライドから離れるように、体の軸がスライドの長軸と一致するように胚を配置します。カバースリップを配置するには、まずガラスの片側をダブルスティックテープの1つのスタックに置き、鉗子を使用してカバースリップを他のテープスタックに接触するまで静かに下げます。胚を慎重に配置してマウントすることは特に重要です。正しく配置されていない胚は、イメージングがはるかに困難になり、定量化可能なデータを得るために追加の処理が必要になる場合があります。ピペットを使用してスライドとカバーガラスの間に退色防止媒体を追加し、イメージング中にサンプルが乾燥するのを防ぎ、心臓の三日月領域全体を1つの視野でキャプチャできる最高の倍率の対物レンズを選択します。次に、標準的なイメージングのベストプラクティスを使用してイメージングパラメータを設定し、ナイキストサンプリングレートを使用して各胚のXYZボクセル寸法を決定します。胚画像を解析するには、生の画像データセットを適切な画像解析ソフトウェアにロードし、surpassビューで最初のファイルを開きます。データは、最大強度投影モードの3Dビューにロードされます。表示調整ウィンドウを開き、参照チャンネルのみを選択します。必要に応じて、画像のしきい値を調整します。S/N比がセグメンテーションに対して低すぎる場合は、ガンマを調整します。画像取得中のベストプラクティスに従うことは、適切なデータを取得するために重要であり、使用する特定の顕微鏡セットアップによって異なります。ガンマの調整が必要な場合、これらの画像を蛍光強度の比較に使用しないでください。サーフェスアルゴリズムダイアログを使用して、参照チャネルの新しいサーフェスを作成し、[対象のセグメントのみの原点]チェックボックスをオンにします。バウンディングボックスの領域を調整して、参照染色で描かれた関心領域が含まれるようにし、ソースチャネルのドロップダウンメニューから参照チャネルを選択します。スムージングをZボクセルサイズの半分に設定し、しきい値スライダーを使用して下限を絶対強度に調整し、サーフェスがチャネル信号を超えて伸びないようにします。ボクセル数またはボリュームでオブジェクトをフィルタリングし、アルゴリズムが生成した可能性のある背景オブジェクトを拒否し、アルゴリズムを終了します。次に、新しく作成したサーフェスを選択し、編集ウィンドウからマスクセット機能を選択します。「マスクを適用する前に重複するチャンネル」チェックボックスが選択されていることに注意して、目的の実験チャンネルを選択し、ディスプレイ調整ウィンドウでのみマスクチャンネルを選択します。次に、先ほど示したように新しいサーフェスを作成します。各サーフェスを選択した状態で体積データを取得するには、統計タブの[詳細]サブタブを開き、ドロップダウンメニューから平均値を選択します。サーフェスの合計体積は、生成されたテーブルのsum列にあります。ここでは、ちょうど実証されたように抗心臓三日月抗体で標識されたGFP陽性の心室心血管前駆細胞を有する胚性8.25日目のマウス胚が示されています。染色した組織の参照チャンネルを選択した後、サーフェス作成アルゴリズムを開始する前に強度とガンマを調整します。対象領域が選択され、サーフェスの詳細レベルが選択されます。初期サーフェスは、サーフェス内のすべての真の信号を含むようにしきい値が設定されます。次に、フィルタリングを実行して小さな背景フラグメントを除去し、最終的な参照面を生成します。参照サーフェスを選択することで、比較チャネルを複製してマスクすることができます。このチャネルの強度とガンマは、同じ一連のステップで 2 番目のサーフェスを生成する前に調整されます。その後、各表面の総体積が自動的に計算され、定量的および視覚的に比較できます。この手順を試行する際には、解剖した胚の品質、抗体効率、マウントの向き、イメージングのセットアップなど、すべてが最終データの品質に影響を与えることを覚えておくことが重要です。この定量分析パイプラインに加えて、デコンボリューションなどの他の方法を実行して、追加の定性的データを得ることができます。開発後、この技術は、心臓発生の研究者が初期胚形成における新しい心前駆細胞集団のダイナミクスを探求する道を開きました。

quantitative-whole-mount-immunofluorescence-analysis-cardiac

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。...

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。...

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

この方法では胚の心臓組織は外科的 microdissected、解離、蛍光標識、そして宿主胚性組織に注入です。これは個人または組織レベル発達組織下異所性血行力学的条件、および/またはパラクリン/juxtacrine...

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent...

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。...

マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

マウスの心筋梗塞部位周辺の超音波ガイド下細胞送達は、安全で効果的で便利な細胞移植方法です。...

心筋梗塞マウスにおける超音波ガイド下多能性幹細胞由来心筋細胞移植術

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

学ぶマウス胚の心臓前駆細胞集団の定量的ホールマウント免疫染色解析法。E8期の胚を用いて組織動態の定量的情報を得られ、再現性の向上した自動解析パイプラインで心臓発生を研究できます。

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホールマウント免疫染色解析

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