マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

この方法の全体的な目標は、心臓器官形成中の心前駆細胞の局在と分布を定量的に評価することです。この方法は、正常な胚発生中の心前駆細胞集団の局在を観察することを可能にすることにより、心臓発生分野における重要な答えに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、体積画像から組織レベルのダイナミクスに関する定量的情報が得られることと、解析パイプラインを自動化して再現性を向上させることができることです。

この方法は初期の心臓器官形成に関する情報を提供しますが、初期胚形成の一般的な研究や、関心のある他の臓器の形態形成にも適用できます。胚の8日目の朝、妊娠中のマウス腹部を70%エタノールで消毒し、皮膚と体壁の両方から腹部を切開します。1つの卵管の上から始めて、子宮の側面に沿って子宮頸部まで脂肪を慎重に解剖します。

子宮頸部を切開し、もう一方の卵管切断の上端まで続けて子宮全体を解放します。新鮮なPBSを含む10センチメートルの皿で子宮から余分な血液を洗い流し、各脱離膜の間のメソメトリウムを切断します。解剖顕微鏡で新鮮なPBSが入った6センチメートルの皿に胚を移し、5番の細い鉗子を使用して脱落膜組織から子宮組織を切除します。

次に、脱落膜の胚の半分の先端を慎重にスライスして胚を露出させ、脱落膜をつまんで最初の胚を慎重に押したり引き出したりします。動物の形態を損なうことなく、できるだけ多くの余分な胚組織を解剖し、トランスファーピペットを使用して、氷上の新鮮なPBSが入った1.5ミリリットルのチューブに胚を入れます。すべての胚が採取されたら、各チューブからPBSを吸引し、新しいPBSで胚をすすぎます。

各チューブからPBSを完全に吸引した後、胚を4%パラホルムアルデヒドに室温で1時間固定し、続いて新鮮なPBSで3回洗浄した後、胚を摂氏4度で保存します。まず、PBSを1ミリリットルのブロッキングバッファーに交換し、室温で4時間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、ブロッキングバッファーを適切な一次抗体混合物と希釈したブロッキングバッファーと交換し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。

翌朝、過剰な抗体を吸引し、PBS中の0.1%Tritonで1回の洗浄につき1時間、胚を3回洗浄します。3回目の洗浄後、適切な二次抗体混合物を胚に加え、室温で3時間のインキュベーションを行い、その後、先ほど示したように3回の洗浄を行います。次に、PBS中のDAPIで胚を10分間対比染色し、続いて5分間の洗浄を2回行い、その後、胚を退色防止封入剤にゆっくりと懸濁し、定期的に穏やかにフリックしながら胚を少なくとも1時間平衡化させ、標本が溶液に落ちるのを助けます。

胚をマウントする前に、胚ごとに1つの顕微鏡スライド上に15〜20ミリメートル間隔で5〜6層のダブルスティックテープを2つの平行に積み重ね、テープスタック間の各スライドに15マイクロリットルの退色防止培地を滴下します。1つの胚を各滴に慎重に移し、解剖顕微鏡と細かい鉗子を使用して、胚の前面がスライドから離れるように、体の軸がスライドの長軸と一致するように胚を配置します。カバースリップを配置するには、まずガラスの片側をダブルスティックテープの1つのスタックに置き、鉗子を使用してカバースリップを他のテープスタックに接触するまで静かに下げます。

胚を慎重に配置してマウントすることは特に重要です。正しく配置されていない胚は、イメージングがはるかに困難になり、定量化可能なデータを得るために追加の処理が必要になる場合があります。ピペットを使用してスライドとカバーガラスの間に退色防止媒体を追加し、イメージング中にサンプルが乾燥するのを防ぎ、心臓の三日月領域全体を1つの視野でキャプチャできる最高の倍率の対物レンズを選択します。

次に、標準的なイメージングのベストプラクティスを使用してイメージングパラメータを設定し、ナイキストサンプリングレートを使用して各胚のXYZボクセル寸法を決定します。胚画像を解析するには、生の画像データセットを適切な画像解析ソフトウェアにロードし、surpassビューで最初のファイルを開きます。データは、最大強度投影モードの3Dビューにロードされます。

表示調整ウィンドウを開き、参照チャンネルのみを選択します。必要に応じて、画像のしきい値を調整します。S/N比がセグメンテーションに対して低すぎる場合は、ガンマを調整します。

画像取得中のベストプラクティスに従うことは、適切なデータを取得するために重要であり、使用する特定の顕微鏡セットアップによって異なります。ガンマの調整が必要な場合、これらの画像を蛍光強度の比較に使用しないでください。サーフェスアルゴリズムダイアログを使用して、参照チャネルの新しいサーフェスを作成し、[対象のセグメントのみの原点]チェックボックスをオンにします。

バウンディングボックスの領域を調整して、参照染色で描かれた関心領域が含まれるようにし、ソースチャネルのドロップダウンメニューから参照チャネルを選択します。スムージングをZボクセルサイズの半分に設定し、しきい値スライダーを使用して下限を絶対強度に調整し、サーフェスがチャネル信号を超えて伸びないようにします。ボクセル数またはボリュームでオブジェクトをフィルタリングし、アルゴリズムが生成した可能性のある背景オブジェクトを拒否し、アルゴリズムを終了します。

次に、新しく作成したサーフェスを選択し、編集ウィンドウからマスクセット機能を選択します。「マスクを適用する前に重複するチャンネル」チェックボックスが選択されていることに注意して、目的の実験チャンネルを選択し、ディスプレイ調整ウィンドウでのみマスクチャンネルを選択します。次に、先ほど示したように新しいサーフェスを作成します。

各サーフェスを選択した状態で体積データを取得するには、統計タブの[詳細]サブタブを開き、ドロップダウンメニューから平均値を選択します。サーフェスの合計体積は、生成されたテーブルのsum列にあります。ここでは、ちょうど実証されたように抗心臓三日月抗体で標識されたGFP陽性の心室心血管前駆細胞を有する胚性8.25日目のマウス胚が示されています。

染色した組織の参照チャンネルを選択した後、サーフェス作成アルゴリズムを開始する前に強度とガンマを調整します。対象領域が選択され、サーフェスの詳細レベルが選択されます。初期サーフェスは、サーフェス内のすべての真の信号を含むようにしきい値が設定されます。

次に、フィルタリングを実行して小さな背景フラグメントを除去し、最終的な参照面を生成します。参照サーフェスを選択することで、比較チャネルを複製してマスクすることができます。このチャネルの強度とガンマは、同じ一連のステップで 2 番目のサーフェスを生成する前に調整されます。

その後、各表面の総体積が自動的に計算され、定量的および視覚的に比較できます。この手順を試行する際には、解剖した胚の品質、抗体効率、マウントの向き、イメージングのセットアップなど、すべてが最終データの品質に影響を与えることを覚えておくことが重要です。この定量分析パイプラインに加えて、デコンボリューションなどの他の方法を実行して、追加の定性的データを得ることができます。

開発後、この技術は、心臓発生の研究者が初期胚形成における新しい心前駆細胞集団のダイナミクスを探求する道を開きました。