Name: 試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学ぶMDCK-SIAT1細胞を用いた微小中和試験法で、H3N2インフルエンザウイルスに対するヒト血清中の中和抗体価を測定する方法です。ワクチン効果評価や免疫応答の解析に応用できます。

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この原稿の準備で博士 Xiuhua Lu、リュー風水とその批判的検討と支援の CDC のインフルエンザ部門からさんアシュリー ・ バロウズに感謝します図 3のグラフィックスを準備することの彼の援助の CDC のインフルエンザ部門から博士エイドリアン ・ レーバーに感謝いたします。最後に、博士 M. Matrosovich、マールブルク、ドイツ SIAT1 MDCK 細胞を提供するために感謝いたします。

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</ol>

利害の衝突を報告しません。調査結果と本書の結論のこれらの者は、疾病や予防、資金提供機関のためにセンターのビューを必ずしも表さない。

MN アッセイは、インフルエンザ血清インフルエンザ感染またはワクチン接種後抗体を検出するために使用する主な試金のひとつです。ミネソタの試金から生成された抗体は多くのインフルエンザおこなえる研究の主な成果として使われます。ミネソタの試金は、血清診断とワクチンの免疫原性の評価にも広く使用されます。MN アッセイ複数研究所14の実行を比較する国際間研究を行った。
こんにちと対照をなして MN アッセイは、培養細胞でのウイルス感染を中和することができる機能性抗体を直接測定するため設計されています。フィールド研究所世界中で使用されるミネソタの試金の様々 な形態があります。試金 (すなわち, 中和抗体の存在下でのウイルス感染の減少) の読み出しはウイルス NP 抗体の ELISA 定量 HA 定量化のウイルス、または各ウェルでウイルスのプラークの免疫染色に基づくことが抗体と細胞文化14,15インキュベーション存在...

インフルエンザ ウイルスは、人間の人口毎年の罹患率と死亡率を引き起こし続けます。HA は、インフルエンザ ウイルスの主要な表面の糖蛋白。HA を対象と中和抗体は、インフルエンザ感染1,2の保護に関係する主な免疫メカニズムです。赤血球凝集抑制 (HI) アッセイ MN アッセイは、インフルエンザ感染症や予防接種3後血清抗体を測定に広く用いられる 2 つの方法。こんにちはアッセイは赤血球凝集抑制抗体を測定し、サロゲートの試金であります。こんにちとは異なり MN の試金は直接細胞培養のインフルエンザ感染を中和するヒトの血清中の抗体のレベルを測定できます。MDCK 細胞、インフルエンザ ウイルス分離に使われます、MN4の試金。
インフルエンザ ウイルスは、抗原ドリフトとウイルスの受容体結合特異性を変えることができる HA 蛋白の変異を取得し、shift キーを常に受けます。2014 年以来 a (h3n2) ウイルスの新しいクラスターが登場し、現在のシーズンまで循環し続けた。これらのウイルスのほとんどは、遺伝的グループ 3C.2a と HA タンパク質の系統解析に基づく 3C.3a に属します。循環の 3C.2a ウイルスの多くは赤血球を hemagglutinate する能力を減少していた、こんにちは試金5特徴ことはできません。中和の試金は6を hemagglutinate いないこれらのウイルスの抗体を測定するために使わなければなりません。また、研究によるとこれら現代の a (h3n2) ウイルスが以前 a (h3n2) のウイルスと比較して受容体結合特性を変更しているし、文化適応変異と多型生体外細胞で継代されたときに蓄積する傾向があります。文化7,8,9。従来の MDCK 細胞と比べて、MDCK SIAT1 は Matrosovichらによって開発された細胞株です。を通じて人間 α 2, 6-sialtransferase (SIAT1) の cDNA を用いた MDCK 細胞のトランスフェクションを安定。この細胞株は、α 2, 6 シアル ガラクトースと親 MDCK 細胞10より 3 シアル酸部分の α 2、量も減るの増加量を表しています。SIAT1 MDCK 細胞は MDCK 細胞11と比較して a (h3n2) ウイルスの分離率を改善するために示されています。最近では、林ら新たに出現した 3C.2a および 3C.3a 人間 a (h3n2) インフルエンザ ウイルスのより忠実なウイルス複製よりウイルス感染であったウイルスが MDCK 細胞7と比較して SIAT1 MDCK 細胞の培養が報告。したがって、a (h3n2) ウイルスの最近のクラスター抗体反応を特徴付けるミネソタの試金は SIAT1 MDCK 細胞が適しています。
ここ現代 3C.2a とひと血清中の 3C.3a a (h3n2) ウイルスに抗体を測定する SIAT1 MDCK 細胞を用いた MN の試金を記述します。卵の細胞成長のウイルスは、この試金で使用できます。熱不活化血清中和抗体を含むは希釈した直列ではまず、100 TCID50/インフルエンザ a (h3n2) ウイルスにバインドする血清中の抗体を許可するのも、培養しました。SIAT1 MDCK 細胞はウイルス抗体の混合物に追加し、37 ° c、a (h3n2) ウイルス SIAT1 MDCK 細胞に感染し、複製を許可する 5% CO2 18 20 時間培養します。一晩インキュベートした後、プレート固定、抗インフルエンザ A NP モノクローナル抗体を用いた elisa 法による各ウェルのウイルスの量を定量化します。NP の検出は、ウイルス感染の有無と中和抗体の有無を示します。中和抗体は、ウイルスの感染性の ≥ 50% 阻害を提供します最高血清希釈の逆数として定義されます。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ高グルコースのModified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Life Science</td><td>11965</td><td>A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Science</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ライフサイエンス</td><td>11360-070</td><td></td></tr>ジェ<tr><td>ネティクスG-418二硫酸塩&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A1720-5G&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ライフサイエンス</td><td>15630-080</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンス</td><td>15140-122</td><td></td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>VWR</td><td>67-64-180</td><td>%濃度の</td></tr><tr><td>リン酸塩-クエン酸緩衝液と過ホウ酸ナトリウムで使用&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-フェニレンジアミン二塩酸塩錠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBQ1086V</td><td>細胞培養グレードの水100mlあたり1錠</td></tr><tr><td>硫酸フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A510-P500</td><td>使用済み 0.5M 最終濃度</td></tr><tr><td>エタノール、変性、4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>70%濃度で使用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ライフサイエンス</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>デンカ Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>抗NPマウスモノクローナルAb</td><td>ミリポアプール</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

試金を使用して siat1 mdck 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン (HA) に対する中和抗体は、インフルエンザ感染症のための保護に関係する主な免疫機構と見なされます。中和 (MN) の試金はインフルエンザ予防接種や感染症後ひと血清中の中和抗体を測定するために使われます。Madine ダービー犬腎臓 (MDCK) 細胞は、MN の試金のための一般的に使用されるセル基板です。しかし、受容体結合特異性を変更現在循環 3C.2a と 3C.3a の a (h3n2) インフルエンザ ウイルスが取得しています。表面に増加 α 2, 6 シアル ガラクトース防 MDCK SIAT1 細胞株は、これら現代の a (h3n2) ウイルスの改良された感染性と従来の MDCK 細胞よりもより忠実な複製を提供するために証明されています。ここでは、これら現代の a (h3n2) ウイルス中和抗体を定量化するために最適化された SIAT1 MDCK 細胞を用いた MN アッセイについて述べる。このプロトコルでは熱不活化血清中和抗体を含む最初連続希釈されて、次いで, 100 TCID50/インフルエンザ a (h3n2) ウイルスにバインドする血清中の抗体をできるようにするのも。SIAT1 MDCK 細胞はウイルス抗体の混合物に追加し、37 ° c、a (h3n2) ウイルス SIAT1 MDCK 細胞に感染するを許可するように 5% CO2 18 20 時間培養します。一晩インキュベートした後板が固定されており、それぞれのウイルスの量も抗インフルエンザ ウイルスを用いた酵素免疫測定法 (ELISA) による定量化は np モノクローナル抗体。中和抗体は、ウイルスの感染性の: 50% 阻害を提供します最高血清希釈の逆数として定義されます。

ウイルス株の感染性の決定は、MN の試金の最初のステップです。図 2は、ウイルス株の TCID50を決定するプレート レイアウトを示しています。不明な感染力を持つウイルス株ウイルス ウイルスの感染性を計算する最高の滴定曲線をキャプチャするためにから複数の前希釈、たとえば 10-2と 10-3、滴定することができます。ミネソタの試金で使用されるウイルス量は 100 TCID50/well (50 μ L) を標準化しなければなりません。100 TCID50を達成/まあウイルス株の最小希釈は 1: 100 です。
 図 3では、SIAT1 MDCK 細胞を用いた MN 測定の重要なステップについて説明します。熱非動化血清はシ...

インフルエンザ中和抗体は、インフルエンザ感染症の保護と関連付けてください。中和血清中和抗体価の測定し、インフルエンザのひと血清にしばしば使用します。次のインフルエンザの予防接種や感染症現代 3C.2a 3C.3a a (h3n2) ウイルス中和抗体価を測定する SIAT1 MDCK 細胞を用いた中和試験について述べる。

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

このマイクロニュートラルアッセイの全体的な目標は、MDCK-SIAT1細胞を使用して、ヒト血清中の最新のH3N2インフルエンザウイルスに対する中和抗体応答を測定することです。この方法は、インフルエンザの免疫を評価するための重要な質問に答えるために使用できます。例えば、インフルエンザワクチン接種が、流行しているH3N2ウイルスに対して感染を予防するのに十分な中和抗体応答を誘導するかどうかを判断できます。この技術の主な利点は、MDCK-SIAT1細胞とマイクロ中和アッセイを利用して、H3N2インフルエンザウイルスのリセット抗原クラスターに対する抗体応答を検出することです。ウイルスストックは、マイクロニュートラル化アッセイで使用する前に、感染力価の高い値まで増殖させる必要があります。この手順は、テキストプロトコルに詳述されているように、MDCK-SIAT1細胞でのAH3N2ウイルスの増殖から開始します。初日には、ウイルスのバイアルを室温で解凍し、すぐにウイルスを氷の上に置きます。2つの異なる開始希釈液でウイルスをテストするには、まず100マイクロリットルのウイルスを99ミリリットルのウイルス希釈剤に加えて、10:2の予備希釈液にします。次に、10:2の予備希釈液1ミリリットルを9ミリリットルのウイルス希釈液に加えて、10:3の予備希釈液にします。2枚のマイクロタイタープレートを使用して、96ウェルマイクロタイタープレートの1列目を除くすべてのウェルに100マイクロリットルのマイクロ希釈液を添加します。次に、半log 10希釈を行います。希釈開始のウイルス146マイクロリットルをカラム1のすべてのウェルに加え、カラム1からカラム11まで46マイクロリットルを連続して移します。カラム間のピペットチップを交換します。カラム11を混合した後、46マイクロリットルの希釈でチップを廃棄します。カラム12は、ウイルス希釈剤のみを含む細胞コントロールとして使用します。次に、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。テキストプロトコルで説明されているように、MDCK-SIAT1細胞を準備します。希釈した細胞を100マイクロリットルをマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。そして、プレートを覆います。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で18〜20時間インキュベートします。2日目に、最初にマイクロタイタープレートから培地を取り出してELISAを実行します。各ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄した後、各ウェルに300マイクロリットルの冷たい80%アセトンを追加します。そして、室温で10分間インキュベートします。次に、固定剤を取り除きます。そして、プレートを風乾させます。次に、抗インフルエンザA核タンパク質モノクローナル抗体を抗体希釈液中の目標濃度に希釈する。プレートを300マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。次に、希釈した一次抗体100マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートを室温で1時間インキュベートします。二次抗体の添加には、HRP抗体に結合したヤギ抗マウスIgGを抗体希釈液中の標的濃度に希釈します。プレートを300マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。希釈した二次抗体を100 μLずつ各ウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。次に、300マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。そして、糸くずの出ないワイプをタップします。各ウェルに100マイクロリットルの新しく調製した基質を追加します。そして、発色が飽和し、細胞制御ウェルの光学密度またはODが0.2未満になるまで、室温でインキュベートします。次に、100マイクロリットルの停止溶液をすべてのウェルに加えます。マイクロプレート分光光度計を使用して、490ナノメートルの井戸の外径を読み取ります。テキストプロトコルで説明されているように、Reed-Muench法を使用してウイルスのTCID50を計算します。MNアッセイの初日に、37°Cの水浴で血清を解凍し、解凍後すぐに取り出します。テキストプロトコルに記載されているように、ヒト血清を摂氏56度の水浴中で30分間加熱し、活性化します。次に、血清を氷の上に置き、ウイルス希釈剤を血清に加えて、1:10の事前希釈を達成します。1 つのウイルスでテストするには、列 11 と 12 を除く行 B から H に 50 マイクロリットルのウイルス希釈剤を追加します。次に、1:10希釈した血清100マイクロリットルをカラムA1〜A10に加えます。行AからH.Andの最後の50マイクロリットルを行H.Forウイルス制御のために、ウイルス希釈液の50マイクロリットルをウェルA12、B12、C12およびD12に加える行AからH.Andの2倍の段階希釈を行います。細胞制御のために、ウェルE12、F12、G12、H12に100マイクロリットルのウイルス希釈液を添加します。コントロール血清については、100マイクロリットルの希釈したコントロール血清をウェルAカラム11に加える。そして、50マイクロリットルのウイルス希釈剤をウェルB11からH11に加えます。連続希釈に進みます。プレートを覆い、ウイルスの追加準備ができるまで、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。ウイルスを添加する場合は、ウイルス希釈剤を使用してウイルスを50マイクロリットルで100TCID50に希釈します。バック滴定プレートのカラム11とすべてのプレートの細胞コントロールウェルE12、F12、G12、H12を除くすべてのウェルに、希釈したウイルスを50マイクロリットル加えます。カラム 11 のすべてのウェルに 50 マイクロリットルのウイルス希釈液を添加します。次に、50マイクロリットルのウイルスを50マイクロリットルで100TCID50で最初のウェルに追加します。次に、50マイクロリットルを混合して連続するウェルに移し、2倍の段階希釈を行います。ウェル間でピペットチップを交換して、ウイルスのキャリーオーバーを防ぎます。井戸H50から11マイクロリットルを捨てます。次に、50マイクロリットルのウイルス希釈液をカラム11に追加して、最終容量を100マイクロリットルにします。プレートをタップして混ぜます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートした後、前回と同様に1日目にMDCK細胞の添加を行い、2日目にELISAを行います。一次抗体と二次抗体を添加した後、テキストプロトコルに記載されているように、基質添加とプレート読み取りを行います。300マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを5回洗い、糸くずの出ないワイプを軽くたたきます。調製したばかりのOPD基質100マイクロリットルを各ウェルに加えます。次に、ウイルスコントロールウェルが0.8〜3の490ナノメートルの光学密度に達するまでプレートを室温でインキュベートし、細胞コントロールは0.2未満の低バックグラウンドODで行います。次に、100マイクロリットルのストップ溶液をすべてのウェルに加えます。マイクロプレート分光光度計を使用して、490ナノメートルの井戸の外径を読み取ります。最後に、テキストプロトコールに記載されているように、各血清サンプルの中和抗体価を決定します。マイクロニュートラル化アッセイの代表的な結果をここに示します。各ウェルのODは、中和抗体を含む段階希釈血清の存在下でのMDCK-SIAT1細胞におけるウイルス感染および複製の量を表しています。50%中和カットオフは、ウイルスコントロールウェルの外径中央値と細胞コントロールウェルの外径中央値を2で割ったものとして定義され、50%以上の中和を達成した最高血清希釈値の逆数が血清サンプルの抗体価と見なされます。この例では、2人の患者からインフルエンザワクチン接種前後に採取したペアの血清を、2016年から2017年のインフルエンザシーズン中にワクチンに使用されたH3N2ウイルスに対して試験した。患者 1 のワクチン接種前の血清では、血清希釈液はいずれもウイルス感染を阻害しなかったため、陰性と見なされます。ワクチン接種後、この患者の血清は中和を示しました。この血清からの 3 回目の希釈は、50% カットオフを下回る最高希釈であるため、この患者のワクチン接種後の力価は 40 です。これに対し、2回目の患者によるワクチン接種前の血清には、力価320の既存の中和抗体が含まれています。ワクチン接種後、力価は1280以上に増加しました。この場合、血清の1:10の事前希釈では、抗体の終末力価は達成されませんでした。血清は、最終力価を達成するために、より高い事前希釈で再試験することができます。MDCK-SIAT1細胞を用いたマイクロ中和アッセイは、最近のH3N2インフルエンザウイルスの抗原性クラスターに対する中和抗体応答の検出において、高感度、特異性、堅牢性を備えています。この手順は、通常のMDCK細胞を使用することにより、H3N2ウイルスの他の株やインフルエンザウイルスの他の亜型に対する抗体応答を検出し、インフルエンザに対する防御免疫を評価するためにも使用できます。

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