ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

ドットアッセイの全体的な目標は、微小環境の手がかりに応答して、付着した凝集性細胞シートの遊走表現型を評価することです。この方法は、サイトカインや成長因子が腫瘍細胞の運動性をどのように変化させるかなど、がん領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。ドットアッセイの主な利点は、簡単に実行でき、再現性のある結果が得られることです。

この方法は細胞の運動性に関する洞察を提供するだけでなく、成長コロニーの形態や細胞散乱を評価するための細胞の染色、免疫染色、タンパク質やDNAまたはRNAの分析、動物への細胞の注入など、その後のさまざまなアッセイにも役立ちます。まず、マウスのコラーゲン4を氷上で解凍し、50マイクロモルのHCLで希釈して、10マイクログラム/ミリリットルのコラーゲン4溶液を3ミリリットル調製します。250マイクロリットルのコラーゲン4溶液を12ウェルガラス底プレートのウェルに加え、適切なサイズのしっかりと閉まるプラスチックボックスに入れます。

濡れたペーパータオルをプレートの上と周りに置いて湿ったチャンバーを作成し、ボックスを閉じます。次に、プレートを室温で一晩インキュベートします。翌朝、非吸収コラーゲンとバッファーを移動するには、脱イオン水を使用してプレートを2回すすぎ、エッジの底とカバースリップによって形成されるエッジではなく、プレートのエッジに水を向けます。

プレートを層流フードで風乾し、すぐに使用するか、摂氏4度で最大5日間保管します。細胞懸濁液を調製するには、DMEMF12培地の60mm組織培養皿で増殖させた細胞を使用し、5%ウマ血清を80%コンフルエンスまで補充します。カルシウムおよびマグネシウムフリーのDPBSを使用して細胞を一度すすぎ、次に500マイクロリットルの室温トリプシンEDTAを追加し、加湿雰囲気で5%CO2中の細胞を摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。

分離した細胞を4.5ミリリットルの培養培地に懸濁してトリプシン活性を停止し、血球計算盤を使用して細胞懸濁液の20マイクロリットルのアリコートをカウントします。50ミリリットルの円錐管に残った細胞を、重力200倍で3分間遠心分離して引き抜きます。次いで、上清を吸引し、細胞を培養液中の細胞を10mLあたり6細胞の3倍に再懸濁する。

コラーゲン4コーティングされた12ウェルガラス底プレートの各カバースリップの中央に細胞をプレートするには、コーティングに触れたり傷をつけたりしないように注意しながら、10マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下します。非円形の液滴をめっきしても円形の細胞シートは得られず、コーティングに触れたり傷がついたりすると、細胞がうまく付着しなくなります。プレートを摂氏37度で加湿雰囲気中で30分間インキュベートし、細胞が付着するのを待ちます。

その後、倒立顕微鏡で取り付けを確認します。1ミリリットルの培地で、ウェルを2回優しく洗浄して付着していない細胞を取り除き、各ウェルに1ミリリットルの培地を追加します。倒立顕微鏡で浮遊細胞が残っていないことを確認し、そうでない場合はウェルを再度洗浄します。

加湿雰囲気下で細胞を摂氏37度、5%CO2中で一晩インキュベートし、明確に定義された細胞シートを得る。倒立顕微鏡を使用して、すべてのウェルをチェックし、細胞コロニーが適切に成長したことを確認します。必要に応じて、不適切な井戸に印を付けて使用しないでください。

プレートの各ウェルには、調査した各条件に適切にラベルを付けます。各条件を重複または三重に実行します。細胞が刺激される3時間前に、0.1%ウマ血清を含むDMEMF12の細胞を飢餓状態にするように培地を変更します。

次に、EGFまたは他の目的のメディエーターを追加して細胞を刺激します。1マイクロリットルのピペッターを使用するか、プレートを静かに回転させて培地を混合します。プレートを1〜4日間インキュベートして、エッジの変位とエッジの輪郭を観察します。

H染色とE染色を行うには、細胞をPBSで2回洗浄し、約2分間固定します。ヘマトキシリンを約2分間添加して核を染色します。核が青くなるまで、細胞を水道水で5〜10分間洗浄します。

次に、細胞質をエオシンで2分間染色してから、脱イオン水で細胞をすすぎます。プレートを風乾してから裏返し、定規を使用してドットの直径を測定します。または、カメラでプレートの写真を撮り、ImageJを使用してドットの直径を分析します。

タイムラプス顕微鏡検査を行うには、インキュベーター顕微鏡のスイッチを入れ、温度を摂氏37度に調整します。加湿器にDH2Oを充填し、CO2を5%に調整しますインキュベーターチャンバーが加湿され、電動ステージが自由に動くことができることを確認します。次に、インキュベーターチャンバーを閉じ、顕微鏡を摂氏37度に調整します。

プレートをインキュベーター顕微鏡のステージに置き、ステージリストを設定してから、2つの対向するエッジと各細胞ドットの中心を画像化します。10倍の対物レンズを使用して、15〜24時間、3分ごとに画像を撮ります。データをダウンロードし、Matlabなどの選択したプログラムで画像解析を続行します。

最初に、細胞ドットの位相コントラストイメージングにより、浸潤性の肺コロニー形成乳がん細胞がEGFによる刺激後に間葉系表現型を維持することが明らかになりました。しかし、シートを離れる単一細胞は、EGF刺激細胞ドットでより頻繁に観察されます。EGFに対する肺コロニー形成乳がん細胞の応答は、EGFで4日間刺激された培養物のH染色およびE染色によってさらに評価されました。

実際、EGF刺激はコロニー径の増加をもたらし、EGF刺激細胞の遊走が変化する可能性があることを示しています。このドットアッセイでは、EGFによるコロニー形成乳がん細胞の刺激後、シートエッジの細胞を9時間イメージングしました。PIVは、EGFが制御細胞の細胞速度を毎分0.45マイクロメートルから毎分0.63マイクロメートルに増加させることを明らかにしました。

さらに、EGFは、細胞の方向性の変動性、つまり角度拡散を、対照培養の0.95からEGF刺激培養の0.79に減少させました。さらに、4日後のH染色およびE染色で観察されたように、EGFは9時間で上皮縁の半径方向の変位を257マイクロメートルから356マイクロメートルに増加させました。一度マスターすると、このテクニックの実践的な時間は数時間です。

この手順に続いて、タイムラプスイメージング、免疫染色、DNAおよびRNA分析などの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。例えば、高速に移動する細胞と遅い細胞でタンパク質が異なる発現をしているかどうか、または細胞が周囲の環境に移動するタイミングを解析するために使用できます。このビデオを見れば、ドットアッセイの設定方法と、微小環境の手がかりに応答して付着した凝集性細胞シートの遊走性表現型を評価する方法について十分に理解できるはずです。