機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ
2017年11月9日
このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN の発生病理の程度を正確に評価することができる洗練されたパラダイムを提案します。
この手順の全体的な目標は、疾患プロセスの機能的および病理学的分析のために、マウスモデルで実験的自己免疫性神経炎またはEANを成功裏に誘導することです。EANモデルは、末梢神経障害に関連する主要な問題に対処するために使用できます。また、新規治療薬の有効性を調査する可能性のある素晴らしいモデルでもあります。
このアプローチの主な利点は、マウスでEANモデルを使用するときに適用できるシンプルで客観的な機能テストパラダイムを提供することです。今日、私と一緒に手順を実演しているのは、メルボルン大学のニューロトロフィンおよびミエリン生物学研究室の学部生であるSang Won Yooです。病気の誘発の3日前に、運動機能評価装置の電源を入れ、ライトボタンのスイッチを入れてください。
マウスを手に取り、赤い食用色素の容器に降ろします。マウスを歩行コンパートメントに置き、トレッドミルの速度を毎秒15センチメートルに設定します。トレッドミルの電源を入れ、[記録]をクリックして、歩行機能イメージングシステムを使用して、マウスの走行動作を36秒間キャプチャします。
36秒後、録画とトレッドミルを停止し、練習走行の練習走行動画 file 指定されたフォルダに保存します。最初の予防接種の1日前に、30-1 / 2ゲージ針を備えた0.5ミリリットルの注射器を使用して、250マイクロリットルのマウス等張性PBS IPに百日咳毒素1.6マイクログラム/1.6マイクログラムを投与し、6〜8週齢の男性C57BL / 6マウスに麻酔をかけます。.次に、表に従ってマウスにEANの臨床徴候を0から4のスケールで採点し、示したように運動機能評価を実行します。
翌日、0.9%生理食塩水に同量のペプチド溶液を、結核菌1ミリリットルあたり20ミリグラムをビーズで混合し、室温で1分間最高速度で溶液を混合します。23ゲージの針を備えたシリンジに接種材料をセットし、シリンジを反転させて振とうしてから、シリンジシャフト内の空気を排出します。接種物を送達する前に、肩甲骨の間の正中線のすぐ外側の髪を取り除き、露出した皮膚を70%エタノールで消毒します。.
次に、Adson鉗子のペアを使用して皮膚をつかみ、皮下注射を介して百日咳毒素を注入したマウスに50マイクロリットルの溶液を送達します。翌朝、ちょうど示したように、250マイクロリットルのPBS IPに百日咳毒素1.2マイクログラム/ミリリットルの百日咳毒素を48時間後に注入します。3回目の百日咳注射の3日後、以前と同じ注射部位にさらに50マイクロリットルの新しく調製した接種物を投与し、実験が終了するまで週に2回、動物の臨床スコアと運動機能を監視します。
C57BL/6マウスにおけるP0 180-199ペプチド誘導EANは、初回免疫後6日目から臨床スコアが発現し、初回免疫後25日目にスコアの重症度が最大となり、初回免疫後40日目に臨床スコアが若干改善する単相性疾患を引き起こします。マウスは、初回免疫後6日という早い時期に単純なランニングタスクで失敗し始め、単純なトレッドミルランニングタスクを免疫後35日までに完了する能力はほとんどなく、初回免疫後55日でランニング能力が向上しません。ペプチド誘発EANマウスの坐骨神経の半薄切片の検査により、年齢が一致した健康な対照群の坐骨神経と比較して、脱髄の領域が明らかになります。
高出力透過型電子顕微鏡画像は、脱髄、ミエリンラメラの損傷、ミトコンドリアの腫脹などの軸索ストレスの兆候など、特定の神経病理学的特徴の同定を可能にします。これらの動物は、年齢が一致した健康な対照組織では観察されない坐骨神経での外傷性上昇ベータアミロイド前駆体タンパク質発現によって証明されるように、急性軸索損傷も示します。ノードの幅が広がり、パラノードが分断されることも観察されます。
一度習得すると、皮下注射はマウスあたり約5〜10分以内に行うことができ、注射エラーの可能性は最小限に抑えられます。この手順を試みるときは、注射部位を観察して、すべての接種物が注射部位内に残り、そのどれもが漏れていないことを確認することが非常に重要です。トレッドミル歩行のビデオキャプチャは、遊脚相や歩幅などの他のパラメータを計算できるため、非常に優れており、これらの測定値は新しい治療法の有効性をテストする際に重要になる可能性があります。
このビデオを見た後、C57BL/6雄マウスでEANを誘導する方法を本当によく理解しているはずです。さらに、注射エラーがないように、安全かつ正確に皮下注射を行う方法について、非常によく理解している必要があります。針や接種物を使用すると、特に鋭利物を使用すると怪我をする可能性があることを忘れないでください。
ですから、怪我をする可能性を避けるために、常に鉗子を使用し、皮膚や組織を手でつかまないようにし、使い捨ての注射器を使用して、その過程で決して再キャップしないことは本当に良い考えです。
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概要
本研究では、ミエリンタンパク質ゼロ（P0）180-199ペプチドを用い、フロイント完全アジュバントおよび百日咳毒素を併用して、マウスモデルに実験的自己免疫性神経炎（EAN）を誘発させる手法を提示します。その目的は、末梢神経障害の機能的および病理学的解析を容易にし、疾患プロセスと潜在的な治療法に関する知見を提供することにあります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 自己免疫疾患
- 末梢神経障害
背景
- 実験的自己免疫性神経炎（EAN）は、末梢神経障害を研究するためのモデルです。
- このモデルは、新規治療薬の評価に実用的です。
- 研究期間中の機能試験を行うことで、客観的な評価が可能になります。
- 主要な行動評価には、運動機能と臨床スコアリングが含まれます。
研究目的
- 研究目的でC57BL/6マウスにEANを効率的に誘発させる。
- 機能欠損および神経病理の程度を解析する。
- 末梢神経障害に関する今後の研究に向けた再現性のあるプロトコルを確立する。
使用した手法
- 本プラットフォームでは、機能評価のためにトレッドミルと歩行機能イメージングシステムを使用します。
- 本モデルでは、EAN誘発プロセスに雄のC57BL/6マウスを用います。
- 本研究において、マルチオミクスのワークフローは言及されていません。
- プロトコールには、免疫化後の指定された間隔でのさまざまな皮下注射が含まれています。
- 疾患の進行をモニタリングするため、研究期間中に複数回の運動機能評価が行われます。
主な結果
- 本研究により、免疫後25日目に臨床症状がピークに達する単相性の疾患経過が確認された。
- 6日目から35日目にかけて、運動タスクのパフォーマンスにおける有意な機能低下が観察された。
- 神経病理学的解析の結果、対照群と比較して処置群のマウスに脱髄と軸索損傷が認められた。
- βアミロイド前駆体タンパク質の発現上昇は、急性の軸索損傷を示している。
結論
- 本研究は、EANを誘導するための明確かつ効率的なプロトコルを提供し、神経病理学の理解を促進します。
- 疾患プロセスの知見は、末梢神経障害の潜在的な治療法に関する今後の研究を支援します。
- これらの知見は、末梢神経系に影響を与える自己免疫メカニズムの理解を深めます。
よくある質問
産業上の実用性
本プロトコルでは、遺伝学的なツールが幅広く利用可能な系統であるC57BL/6マウスにおいて、実験的自己免疫性神経炎を誘導する方法を解説します。これにより、末梢神経の脱髄を標的とした治療候補薬のメカニズム的なリスク低減が可能となります。本モデルは、定量的かつ機能的な評価および神経病理学的なリードアウトを提供し、髄鞘修復や神経保護戦略の前臨床評価における予測精度を高めます。その再現性とトランスジェニックアプローチへの適合性により、自己免疫性末梢ニューロパチー研究における標的バリデーションのためのトランスレーショナルツールとして活用できます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：遺伝的に操作可能なホストにおいて、誘導性ペプチド駆動の免疫活性化を通じて、自己免疫性末梢神経障害の病態機序の解析を可能にする。
- 運用的価値：C57BL/6背景を利用しており、ノックアウト、ノックイン、およびレポーターモデルとの統合が可能であるため、原因標的のリスク低減（de-risking）に寄与する。
- 予測的価値：免疫介在性の神経損傷経路に関する仮説検証をサポートし、免疫調節剤や再髄鞘化候補薬剤の早期のgo/no-go判断を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：トレッドミル歩行解析により定量可能な機能低下を導き出し、運動機能欠損の縦断的モニタリングを薬力学的バイオマーカーとして可能にする。
- 運用の価値：標準化された臨床スコアリング（0〜4段階スケール）とタイミングを合わせた免疫化により、研究コホート間での再現性のある疾患誘導をサポートする。
- アッセイの準備状況：神経保護化合物の標的結合を検証するための、セミシン sectioning および電子顕微鏡観察を含む盲検化された神経病理学的評価と互換性がある。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： beta-amyloid precursor proteinの上昇によって証明される軸索損傷を含む、ヒト末梢脱髄の主要な神経病理学的特徴を再現しており、メカニズム的な妥当性を裏付けている。
- トランスレーショナルな連続性： 発症期（6日目）からピーク期（25日目）、回復期（40日目）に至るまでの疾患の各段階における治療候補物質の評価が可能であり、投与量および投与タイミングの最適化に寄与する。
- リスク調整済み進展： ミエリン修復および神経保護の有効性評価を容易にし、IND申請に向けた準備研究（IND-enabling studies）前の生物学的不確実性を低減させる。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定、そして前臨床有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、特に自己免疫反応の調節や末梢神経 neuropathy における軸索の完全性維持を目的としたバイオ医薬品または低分子化合物に有用である。
- 創薬生物学： PNS特異的な自己免疫の制御された誘導を可能にすることで、免疫と神経の相互作用に関与するターゲットの検証を行い、メカニズム上のリスク軽減を支援します。
- スクリーニング： 運動機能および神経病理への化合物の影響を評価するための標準化されたプラットフォームを提供し、ハイコンテンツイメージングおよびスコアリングによる出力に対応します。
- アナリティクス： 治療群間の比較分析のため、縦断的な機能データ（歩行パラメータ、ストライド長、遊脚相）およびエンドポイントの組織病理学的指標を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトの末梢神経障害に関連する慢性再発性の特徴および軸索病理をモデル化することで、前臨床検証との整合性を図ります。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトにわたる治療仮説の反復的な検証が可能な、再利用可能な免疫学・神経生物学プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 免疫介在性の脱髄および軸索ストレスを精密かつ再現性高く誘導することを可能にし、末梢神経障害モデルにおけるメカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用の価値： 定義された免疫およびブースター投与スケジュールを標準化された機能試験と組み合わせることで、ラボ間の再現性を高め、ばらつきを低減します。
- 戦略的価値： 疾患に関連するシステムにおいて、標的変調の早期かつ定量可能なエビデンスを提供することで、go/no-go判断の信頼性を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 機能的転帰と神経病理学的エンドポイントの両方に効果を示す候補薬の、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の考慮事項
- マウスの取り扱い、皮下注射の手技、および神経病理学的解析のための灌流固定に関する専門知識が必要です。
- トレッドミル歩行イメージングシステム、およびセミシン切片作成および電子顕微鏡観察のための装置へのアクセスが必要です。
- オペレーター間でのデータの整合性を確保するため、臨床スコアリングおよび盲検評価に関する標準化されたトレーニングが必要です。
- 免疫応答性が異なるため、他のマウス系統に適用する場合は、ペプチド濃度およびアジュバント処方の調整が必要です。
- 単相性の疾患経過に限定されており、プロトコルを変更しない限り、再発緩解型または慢性進行型の末梢神経障害をモデル化できない可能性があります。
