Name: 機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶC57BL/6マウスにおける実験的自己免疫性ニューロパチー（EAN）誘導法。P0ペプチドと完全フロイント佐剤を用いた皮下接種により、末梢神経障害の機能評価と神経病理学的解析を行う再現性の高いプロトコルを確立する。

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武神は NHMRC ピートドハーティと多発性硬化症研究オーストラリア (MSRA) 初期キャリアの仲間です。JLF は、MSRA ポスドク研究員プログラムによってサポートされます。この仕事に支えられたオーストラリアの国民健康と医学研究評議会 (NHMRC) プロジェクトは JX に #APP1058647 を与えます。

ここで説明したすべての手順 Florey 研究所神経科学と精神的健康 (メルボルン脳中心部) 動物倫理委員会で承認されて、科学的研究の動物の使用のためオーストラリアのコード練習に従う目的.
 1。 EAN 誘導 注: EAN は 6-8 週間の間高齢者男性の c57bl/6 マウスで正常に誘起すること。誘導のプロトコルは、合計 9 日間です。0 日は、最初の予防接種の日を指します。このプロトコルのため麻酔注射を行った (1.1.2 以下の手順を参照してください).
<ol><li>日-1: <ol><li>百日咳毒素を準備 1.6 μ g/mL 滅菌 0.1 M マウス等張性リン酸を使用して (材料の表 を参照) 溶液緩衝生理食塩水 (MT PBS).</li>
		<li>とイソフルレン anesthetization: <ol><li>anesthetization 室でマウス (C57BL/6、男性、6-8 週間) を置き 1 L/分に酸素の流れを調整</li>
			<li>イソフルラン気化器をオン、anesthetization、および呼吸モニターの 2.5% にそれを調整し、待機、2 分間またはプライマリ反射 (角膜と後肢骨格筋) までは、もはや応答</li></ol>
		</li> <li>Anesthetization 室からマウスを削除し、250 μ L の 30 1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して腹腔注射を介して上記の百日咳毒素ソリューションを管理します</li>。
		<li>予防接種の注射接種の準備: <ol><li>準備 ソリューション A P0 180 199 ペプチドの 2 mg/mL の溶液を使用する (と &#62; 98% の高純度、シーケンス S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 生理食塩水中で</li>。
			<li>準備 ソリューション B 結核 菌 20 mg/mL の溶液を使用して (材料の表 を参照してください) フロイントの &#39; s 完全アジュバント (FCA で構成される: 15% mannide monoolate + パラフィン オイルと 0.5 mg/mL の 85%乾燥殺され、乾燥した 酪酸菌結核菌 M) の</li>。
			<li>、注入するため最終接種するビード ・ ビーターでソリューション A と B の等しいボリューム部分を組み合わせるし、室温で 1 分最大速度でそれらをミックスします 。
			注: A と B のソリューションことがあります在庫として保管 1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存、マウス注入の日に結合された最終的な接種をたて準備しなければなりません</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>0 の日に管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射器 23 G 針を使用して経由でマウスにします 。
	注: 注射に使用される肩甲骨の間または後肢と尾の間尾背</li>。
	<li>日 1 には (MT-PBS) 内 1.2 μ g/mL の百日咳毒素ソリューションを行い 30 1/2 G 針で 0.5 mL シリンジを使用して i. p. 注入を介してマウスに 250 μ L を管理します</li>。
	<li>の日 3、繰り返しステップ上記 1.3. 
	注: 在庫ソリューション A と B が成って、1 ヶ月の最大のための 4 ° C で保存します。ただし、在庫ソリューション A と B を組み合わせることによって生成された最終の注射接種は注射の日に行う必要があります</li>。
	<li>8 日管理 50 μ L 接種 (準備手順 1.1.4 に示した) の皮下注射を介してマウスに (上記 1.2 のステップを参照)、ステップ 1.2 (動物) と同様に同じ注射部位の</li></ol>
 2 臨床得点 <ol><li>毎日開始 0 日目にうちの臨床スコアを実行します。</li>。
	<li>は、各マウスに 0、1、2、3、または 4 基準によると 4 のスコアを与えます。EAN 臨床スコアの 表 1 を参照してください 。
	注: 一貫性を保つのための努力すべきである同時にマウスをスコアに毎日同じ研究者によってします</li>。
</ol> 3。関数評価をモーター 注: 動物の同じコホート臨床スコアと並行して運動のパフォーマンスを評価します。運動機能評価装置は、歩行機能のイメージング システム (材料の表 を参照してください) がインストールいることコンピューターに接続する必要があります。評価されるすべてのマウスに EAN 誘導する前に実行中のタスクに慣れる必要があることをお勧めします。これを行うには、練習走行 (マウスあたり 2 テスト実行) 疾患誘導 (日-3) の前に 3 日間実行します。
<ol><li>運動機能評価装置と光ボタンのスイッチをオンにします</li>。
	<li>首筋マウスしっかりとしっぽを押しながら赤インクを入れた容器にそれを下げることによってその足をインクと 。
	注: この手順は C57BL/6 株、白衣の色を持つマウス株が使用されている場合はスキップできます</li>。
	<li>ウォーキングのコンパートメントにマウスを置きますと 15 cm でトレッドミルの速度を設定/秒</li>
	<li>トレッドミルとクリックをオン、&#34; 記録 &#34; イメージング システム歩行機能を使用してマウスの実行中の動きをキャプチャするボタン (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>タイマーを使用し、36 の各実行を測定 s。36 s があり、録音を停止、停止、トレッドミル後 。
	注: この 36 秒間隔の実行中のタスクを正常に完了できないマウス失敗したと見なされます</li>。
	<li>指定したフォルダーにビデオ ファイルを保存します</li>。
	<li>は、評価される各マウスの上記手順を繰り返します。ごとに 3 日間同じの実行中のタスクにマウスをテストします</li>。
	<li>歩行関数パラメーター (材料の表 を参照) のソフトウェアを使用して編集されたビデオ ファイルを分析します 。
	メモ: 異なる運動パラメーターを分析する方法の詳細について異なるソフトウェア間でだから、製造元を参照してください &#39; 解析の前に s 命令。軸索の組織学的証拠を得るために、免疫組織化学または電子顕微鏡、動物、任意段階ポスト運動機能評価における特定の目的に応じて研究組織を取ることができるのいずれかを介して髄損傷</li>。
</ol>

<ol><li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li>
<li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li>
<li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li>
<li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li>
<li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%3A+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+treatment+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li>
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<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li>
<li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li>
<li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li>
<li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0%28106-125%29+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li>
<li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+motor+axonal+neuropathy%3A+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li>
</ol>

著者はこの作品について利益相反があります。

このレポートでは、誘発 EAN c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた、EAN がマウスのキー神経病理学的および機能欠損の定量化を可能にする簡単な方法について説明します。ここで記述されている EAN 誘導プロトコルは予防接種の注射を実行しながら麻酔の使用異なるです。イソフルラン麻酔の使用は、接種量が最小限のエラーと、動物へのストレスを目的の場所に皮下に注射されるように能力を大きく高めます。
マウスは、六つの dpi4 EAN 誘導のこのメソッドを使用してから病気の臨床徴候を表示する開始されます。ただし、発症の臨床スコアによって測定される以前 〜 10 dpi9,10から発生する報告されています。この病気発症の臨床スコアによって決定されるの違いは、さまざまな臨床スコア基準により部分的になる可能性が、というよりも EAN 誘導のため接種の異なるアジュバントの使用によって説明されま...

末梢神経障害は起源で遺伝的または後天的のいずれかをすることができます取得したニューロパシー、どちらの代謝、虚血、炎症、または有毒な沈殿を持ちます。これらの疾患も便利、軸索または起源の demyelinative のいずれかに分類されます。最も一般的な脱髄性末梢神経障害、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (AIDP、ギランバレー症候群、ギランバレー症候群とも呼ばれます) を取得し、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (CIDP)1,2,3,4;両方は pathogenetically、末梢神経の脱髄を引き起こす、髄鞘に対する自己免疫反応によって特徴付けられます。これらの疾患における活性化 T 細胞は血液神経関門を通過し、PNS 内免疫反応を生成します。神経内マクロファージの活性化、貪食攻撃を介して直接、または麻痺など感覚機能障害5臨床的障害の結果分泌の炎症性メディエーターを介して間接的に脱髄を引き起こします。脱髄軸索は、remyelinated 次の脱髄をする能力を保持しながら検査がよく遅れているまたは恒久的な臨床の主な原因である不完全な不可逆的な損傷は、裸の軸索の感受性の結果障害者。現在、最も効果的な治療法は、免疫調節、しかし多くの場合その有効性にもかかわらず、回復はしばしば遅いと 〜 25% の患者は彼らの生活の質の6を大幅に削減残留の機能的障害を経験 7。
EAN は、貴重な洞察を病態と新規治療薬4を評価する手段を提供している末梢神経障害を脱髄の広く使用されている動物モデルです。このモデルは、種、ウサギなどに誘起することラット、マウス、モルモット、および神経因性抗原接種によって誘導されます。しかし、最終的に成功の EAN 誘導が発生する病気のための適切な免疫反応に依存します。免疫機能で種・種間・ひずみの変化を考えると、抗原とアジュバントの複数の組み合わせは、EAN を正常に誘導するために開発されています。マウスの遺伝学的ツールに関して C57BL/6 は最も広く使用されています。しかし、伝統的な P2 タンパク質ペプチド 57-81 (P257 81) SJL マウスひずみ8の影響を受けやすい病気の結果は、C57BL/6 株の機能障害につながる違法な病因にはできません。幸いにも、感作性パラダイム P0106 125または P0180 199ペプチドを使用して配信補助療法併用百日咳の注入と毒素に活用される高度な遺伝的ツールを有効にするこの障壁を克服することができます、EAN マウスモデル。
ここでは、簡便な c57bl/6 マウスに EAN の誘導が表示されます。さらに、病気に関連付けられている機能と神経病理学的赤字を評価する包括的な詳細なアプローチを提供しています。P0180-199ペプチド9は、P057 81代替10優先して選ばれました。P0180-199モデル P057 81代替10と比較して少ない重度の臨床症状を生成する記載されている、したがって潜在的の導入に耐えられる可能性は劇物の遺伝的摂動 (浸透圧ポンプ注入) などの手術から回復、トレッドミル歩行機能4のテストを受けやすいです。ただし、トレッドミル歩行機能検査と組織のプロトコルがここで説明した簡単に適用でした P057 81誘起変形の疾患を勉強しています。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6、男性、6-8週齢</td><td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>リスト Biological Laboratories, Inc., CA, USA#</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M マウス等張リン酸緩衝生理食塩水 (MT-PBS)</td><td></td><td></td><td>Laboratoriesは独自のプロトコルを持っています。</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachem, QLD, Australia</td><td></td><td>Laboratories は、独自の投与プロトコルを持っています。</td></tr><tr><td>P0180&ndash;199 peptide</td><td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td><td></td><td>P0180&ndash;199、シーケンスS&ndash;S&ndash;K&ndash;R&ndash;G&ndash;R&ndash;Q&ndash;T&ndash;P&ndash;V&ndash;L&ndash;Y&ndash;A&ndash;M&ndash;L&ndash;D&ndash;H&ndash;S&ndash;R&ndash;S</td></tr><tr><td>Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)</td><td>Difco, MI, USA#</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Freund's complete adjuvant (FCA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#263910</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>#15710</td><td>組織採取の日に 4% PFA に希釈します。</td></tr><tr><td>25% glutaraldheyde</td><td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia</td><td>#11-30-8</td><td>2.5% グルタルアルデヒドに希釈 固定日。</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td><td>SL189</td><td>0.1M MT-PBSで10%(w/v)の株式を作成します。0.03%(v / v)で使用してください。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Chem-Supply Pty Ltd、SA、オーストラリア</td><td>SA03030303030</td><td>%(w / v)で使用します。</td></tr><tr><td>最適な切断温度 (OCT) 培地</td><td>Sakura Finetek, CA, USA</td><td>#4583</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Merck Millipore, MA, USA</td> <td>#S30-100</td><td>抗体希釈剤として、10%(v/v)または自社の研究室で決定された他の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma Aldrich, MI, USA</td> <td>#90o2-31-1</td><td>0.3% (v/v) または自社の研究室で測定された他の濃度の抗体希釈液で使用します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗アミロイド前駆体タンパク質(APP)</td><td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td><td>S12700</td><td>1:400で使用するか、自分の研究室で滴定します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗接触性関連タンパク質-1(Caspr)</td><td>イスラエルのWiezmann Institute of ScienceのElior Peles教授からの贈り物</td><td>1:500で使用するか、</td><td></td>自分の研究室で滴定します。</tr><tr><td>適切なAlexa Fluor標識二次抗体</td><td>Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA</td><td>1</td><td>:200で様々な使用または自身の研究室で滴定します。抗体が産生された分子種の選択とAlexa Fluorの選択は、各研究室の裁量に委</td></tr>ねられています。<tr><td>水性マウント液</td><td>Dako (Agilent), CA, USA</td><td></td> #S3023 <td>各研究室には好みがあります。</td></tr><tr><td>名義</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Equipment0.5</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mLシリンジ、301/2g針</td>BD<td>#</td><td>326105</td><td></td></tr><tr><td>23g針</td><td>BD</td><td>#305143</td><td></td></tr><tr><td>赤いインクパッド</td><td></td><td></td><td>動物の足に印を付けるために、任意の赤いインクパッドまたは赤い食用染料を使用できます。</td></tr><tr><td>DigiGate装置(トレッドミルを含む)</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGate Imaging System</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストップウォッチ</td><td></td><td></td><td>任意のタイマーを使用できます。</td></tr><tr><td>DigiGait 8 Software</td><td>eMouse Specifics Inc. マサチューセッツ州</td><td></td><td></td>フラミンガム</tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td> 適切な<td>解剖顕微鏡を使用することができます。</td></tr><tr><td>チャージスライド</td><td>スーパーフロストプラス、ロムサイエンティフィック社</td><td>SF41296SP</td><td></td></tr><tr><td>Cyrostat</td><td>Leica</td><td></td><td>任意の適切なサイロスタットを使用することができます。</td></tr><tr><td>灌流装置と解剖機器</td><td></td><td></td><td>ラボには、独自の灌流プロトクトールがあります。</td></tr><tr><td>不透明な腐植チャンバー</td><td></td><td></td><td>ラボは、不透明なプラスチック容器を使用して独自のものを作成する場合があります。</td></tr><tr><td>PAPペネ</td><td>、GeneTex(米国)</td><td></td><td>ワックスペンシル、または表面張力を使用して、組織切片の周囲にウェルを作成することもできます。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeis LSM780</td><td></td><td>適切なレーザーラインを備えた任意の共焦点顕微鏡を使用することができます。</td></tr><tr><td>FIJI/Image J</td><td>National Institutees of Health</td><td></td><td>www.fiji.sc から入手可能</td></tr></tbody></table>

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

実験的自己免疫性視神経炎 (EAN) は自己免疫性末梢脱髄性疾患の実験モデルの当然です。EAN 病による神経因性ペプチドを持つマウスを免疫末梢神経系 (PNS) のコンポーネントに向かって炎症性攻撃を指示します。最近の進歩は、ミエリン蛋白ゼロ (P0)106 125や P0180 199ペプチド百日咳毒素の注入と組み合わせる補助で配信を使用して比較的耐性の C57BL/6 マウス ラインで EAN の誘導を可能にしました。C57BL/6 株に EAN を誘導する能力により、このマウスの背景に存在する多数の遺伝的ツールの使用とように洗練された病因学とで治療のメカニズムのアクションの尋問形質との組み合わせ。本研究では、c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた EAN を正常に誘導する単純なアプローチを示しています。我々 はまた、このモデルでは、神経病理学的機能の配列を伴って発生する機能的障害の評価のためのプロトコルを概説します。したがって、このモデルは強力な実験的モデル人間の末梢脱髄性ニューロパチーの病態を研究し、目的を髄修復を促進し、自己免疫の神経損傷に対する保護潜在的な療法の有効性を判断炎。

P0180 199ペプチド誘導 EAN C57BL/6 マウスつながる相性疾患臨床スコア 25 dpi から最初の予防接種 (dpi)、および最大スコアの重大度を観察 6 日後から発症後いくつかの臨床スコア 40 dpi から改善期間 (図 1)4,9。歩行機能面でマウスは 6 dpi として早めに単純な実行中のタスクに失敗して 35 dpi のマウスでタスクを実行する単純なトレッドミルを完了する少し容量を持ってし始めるし、能力でも 55 dpi4 (図 1) を実行しているが改善しません。マウスは徐々 に時間をかけて実行中のタスクを実行する能力の低下した EAN が誘導。タスクの失敗を実行するトレッドミル走病4の期間にわ...

このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN の発生病理の程度を正確に評価することができる洗練されたパラダイムを提案します。

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

この手順の全体的な目標は、疾患プロセスの機能的および病理学的分析のために、マウスモデルで実験的自己免疫性神経炎またはEANを成功裏に誘導することです。EANモデルは、末梢神経障害に関連する主要な問題に対処するために使用できます。また、新規治療薬の有効性を調査する可能性のある素晴らしいモデルでもあります。このアプローチの主な利点は、マウスでEANモデルを使用するときに適用できるシンプルで客観的な機能テストパラダイムを提供することです。今日、私と一緒に手順を実演しているのは、メルボルン大学のニューロトロフィンおよびミエリン生物学研究室の学部生であるSang Won Yooです。病気の誘発の3日前に、運動機能評価装置の電源を入れ、ライトボタンのスイッチを入れてください。マウスを手に取り、赤い食用色素の容器に降ろします。マウスを歩行コンパートメントに置き、トレッドミルの速度を毎秒15センチメートルに設定します。トレッドミルの電源を入れ、[記録]をクリックして、歩行機能イメージングシステムを使用して、マウスの走行動作を36秒間キャプチャします。36秒後、録画とトレッドミルを停止し、練習走行の練習走行動画 file 指定されたフォルダに保存します。最初の予防接種の1日前に、30-1 / 2ゲージ針を備えた0.5ミリリットルの注射器を使用して、250マイクロリットルのマウス等張性PBS IPに百日咳毒素1.6マイクログラム/1.6マイクログラムを投与し、6〜8週齢の男性C57BL / 6マウスに麻酔をかけます。.次に、表に従ってマウスにEANの臨床徴候を0から4のスケールで採点し、示したように運動機能評価を実行します。翌日、0.9%生理食塩水に同量のペプチド溶液を、結核菌1ミリリットルあたり20ミリグラムをビーズで混合し、室温で1分間最高速度で溶液を混合します。23ゲージの針を備えたシリンジに接種材料をセットし、シリンジを反転させて振とうしてから、シリンジシャフト内の空気を排出します。接種物を送達する前に、肩甲骨の間の正中線のすぐ外側の髪を取り除き、露出した皮膚を70%エタノールで消毒します。.次に、Adson鉗子のペアを使用して皮膚をつかみ、皮下注射を介して百日咳毒素を注入したマウスに50マイクロリットルの溶液を送達します。翌朝、ちょうど示したように、250マイクロリットルのPBS IPに百日咳毒素1.2マイクログラム/ミリリットルの百日咳毒素を48時間後に注入します。3回目の百日咳注射の3日後、以前と同じ注射部位にさらに50マイクロリットルの新しく調製した接種物を投与し、実験が終了するまで週に2回、動物の臨床スコアと運動機能を監視します。C57BL/6マウスにおけるP0 180-199ペプチド誘導EANは、初回免疫後6日目から臨床スコアが発現し、初回免疫後25日目にスコアの重症度が最大となり、初回免疫後40日目に臨床スコアが若干改善する単相性疾患を引き起こします。マウスは、初回免疫後6日という早い時期に単純なランニングタスクで失敗し始め、単純なトレッドミルランニングタスクを免疫後35日までに完了する能力はほとんどなく、初回免疫後55日でランニング能力が向上しません。ペプチド誘発EANマウスの坐骨神経の半薄切片の検査により、年齢が一致した健康な対照群の坐骨神経と比較して、脱髄の領域が明らかになります。高出力透過型電子顕微鏡画像は、脱髄、ミエリンラメラの損傷、ミトコンドリアの腫脹などの軸索ストレスの兆候など、特定の神経病理学的特徴の同定を可能にします。これらの動物は、年齢が一致した健康な対照組織では観察されない坐骨神経での外傷性上昇ベータアミロイド前駆体タンパク質発現によって証明されるように、急性軸索損傷も示します。ノードの幅が広がり、パラノードが分断されることも観察されます。一度習得すると、皮下注射はマウスあたり約5〜10分以内に行うことができ、注射エラーの可能性は最小限に抑えられます。この手順を試みるときは、注射部位を観察して、すべての接種物が注射部位内に残り、そのどれもが漏れていないことを確認することが非常に重要です。トレッドミル歩行のビデオキャプチャは、遊脚相や歩幅などの他のパラメータを計算できるため、非常に優れており、これらの測定値は新しい治療法の有効性をテストする際に重要になる可能性があります。このビデオを見た後、C57BL/6雄マウスでEANを誘導する方法を本当によく理解しているはずです。さらに、注射エラーがないように、安全かつ正確に皮下注射を行う方法について、非常によく理解している必要があります。針や接種物を使用すると、特に鋭利物を使用すると怪我をする可能性があることを忘れないでください。ですから、怪我をする可能性を避けるために、常に鉗子を使用し、皮膚や組織を手でつかまないようにし、使い捨ての注射器を使用して、その過程で決して再キャップしないことは本当に良い考えです。

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このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

このビデオは、百日咳毒素とミエリン模倣ペプチドおよびアジュバントを含む接種物の投与を通じてマウスモデルの運動機能障害を評価するプロセスを示しています。その後、運動機能を評価するためのトレッドミルテストを行い、免疫活性化と脱髄による神経損傷を評価します。...

実験的自己免疫性神経炎マウスモデルにおける運動機能の評価

神経幹/前駆細胞（NPCの）の移植は、再生神経学に大きな約束を保持している。のNPCの全身送達は、脳および中枢神経系の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に幹細胞を提供するために効果的な、侵襲的な低、かつ治療に非常に効果的なプロトコルになっています。...

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

この原稿は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの誘導と採点の方法、およびさまざまな疾患段階におけるフローサイトメトリーと定量的PCRをそれぞれ使用して、リンパ節、脾臓、血液、脊髄の免疫細胞分布とmRNAサイトカインレベルの評価を説明しています。...

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が免疫細胞の浸潤を抑制した結果として中枢神経系の防御を示すか、または免疫細胞の浸潤の猛攻撃中に神経保護的であるかを決定する方法を説明しています。...

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原/アジュバントエマルジョンを調製するための迅速、簡便、標準化されたホモジナイズ法

学ぶC57BL/6マウスにおける実験的自己免疫性ニューロパチー（EAN）誘導法。P0ペプチドと完全フロイント佐剤を用いた皮下接種により、末梢神経障害の機能評価と神経病理学的解析を行う再現性の高いプロトコルを確立する。

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

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