細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

この手順の全体的な目標は、細胞内の状況でタンパク質間相互作用を研究することです。これは、ビオチン-アビジンプルダウンシステムと自己透過性配列を組み合わせることで実現され、標的配列での生細胞とのインキュベーションが可能になります。この方法は、特定のシグナルを取得するための生体分子間の迅速かつ動的な相互作用など、細胞シグナル伝達分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、分子間相互作用が細胞内の状況で起こることです。この研究では、テキスト プロトコルで説明されているように、150 平方センチメートルの 4 つのフラスコでヒト G166 神経膠腫幹細胞または GSC をプレート化します。コンフルエンスに達したら細胞を処理します。

150平方センチメートルのフラスコに500万個のG166細胞を播種すると、播種から2日後に処理されます。凍結乾燥ビオチン化細胞透過性ペプチドを含むバイアルを8,200倍gで30秒間回転させ、蓋に粉末の一部が残らないようにします。制御されたBCPPを含めて、検出された相互作用がターゲット配列に特異的であることを確認します。

次に、対応する培地のBCPPをメーカーが指定したストック溶液に溶解します。GSCを処理するためにBCPP1ミリリットルあたり2ミリグラムのストック溶液を得るには、1ミリグラムのBCPPを含む1バイアルに0.5ミリリットルのGSC培地を追加します。バイアルをボルテックスし、ペプチドが十分に溶解していることを確認します。

プルダウンアッセイの条件ごとに少なくとも1.5ミリリットルのチューブを12本準備します。条件ごとに最初の3つのチューブをマークします。それらは細胞溶解物の総量を有するであろう。

次に、条件ごとに3つのチューブにAをマークします。これらのチューブには、細胞溶解物を溶解して回転させた後に得られる最初の上清があります。次に、条件ごとに3つのチューブにBをマークします。

これらのチューブには、ウェスタンブロットサンプルの最初の上清の小さな分注があります。最後に、条件ごとに3つのチューブにCをマークします。これらのチューブには、ニュートラアビジンによるプルダウン後に得られる上清があります。

細胞から培地を吸引した後、インキュベーション時間に応じて可能な限り小さい量の培地でBCPPをインキュベートするために必要な対応する量の新鮮な培地と交換します。いずれにせよ、媒体がフラスコの全表面を完全に覆うことが非常に重要です。BCPPのストック溶液の量を細胞培養物に加えて、有効性が証明されている濃度に到達します。

したがって、TAT−コネキシン43 266-283ビオチン/ミリリットル当たり2ミリグラム/ミリリットルの92.8マイクロリットルを培養培地1ミリリットル当たり加える。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに30分間置き、BCPPとその細胞内パートナーとの間の相互作用が起こることを確認します。タンパク質抽出を行うには、まず培地を完全に吸引し、次に自己剥離を避けるために、150cmあたり10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を非常に慎重に洗浄します。

細胞溶解物を得るためには、150平方センチメートルフラスコあたり3ミリリットルの溶解緩衝液を添加し、細胞スクレーパーを用いて表面を徹底的に削り取ります。フラスコを約45度に傾けると、細胞ライセートを対応するチューブに集めやすくなります。チューブごとに1ミリリットルの細胞ライセートを、条件ごとにマークされた3本の1.5ミリリットルのチューブに注ぎます。

プルダウンには、1.5ミリリットルのチューブを11, 000倍gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清をAとラベル付けされた新しいチューブに移します条件ごとに上清のアリコートをBとラベル付けされた別のチューブに移します次に、50マイクロリットルの溶解液に対して16.6マイクロリットルの4x Laemmli bufferを追加し、摂氏マイナス20度で凍結します。次に、ニュートラビジンアガロースを穏やかに振とうして非常によく均質化します。

ピペットチップの先端をカットして直径を大きくし、ビーズのピペッティングを改善します。次に、Aチューブ内の細胞溶解物1ミリリットルあたり50マイクロリットルのニュートラアビジンアガロースを添加します。細胞ライセートを摂氏4度で一晩インキュベートし、非常に穏やかに振とうして、NeutrAvidinが細胞内パートナーに結合したBCPPと相互作用できるようにします。

次に、摂氏4度で1分間3, 000倍gで遠心分離し、ニュートラアビジンとタンパク質との複合体を収集します。上清を慎重に取り除き、C.プルダウンが成功しなかった場合に備えて使用するために保管しておくと、Cとラベル付けされたきれいなチューブに移します。ニュートラアビジンの複合体をタンパク質で洗浄するには、Aチューブのペレットに新鮮な溶解バッファーを添加します。

反転してペレットを再懸濁し、遠心分離を繰り返します。この洗浄をさらに5回繰り返します。これらの上清はすべて捨てることができます。

次に、コンフルエントセルの150平方センチメートルフラスコから得られたペレット用に、1.5ミリリットルのチューブあたり40マイクロリットルの2x Laemmli bufferを追加します。その後、摂氏100度で5分間溶出して、タンパク質間の相互作用を解離します。溶出後、8.200倍gで30秒間遠心分離し、NeutrAvidinビーズをペレット化します。

解離したタンパク質を含む上清を毛細血管先端で新しいチューブに移しますD.これらの上清は、テキストプロトコルに記載されているようにウェスタンブロットにロードする準備ができているか、摂氏マイナス20度で凍結することができます。ここに示されているのは、ビオチンとTAT-コネキシンの融合43 266-283が神経膠腫幹細胞の形態に対する細胞浸透性ペプチドの影響を変化させないことを示す免疫細胞化学の画像です。BCPPまたはCPPで処理したGSCのMTT解析では、ビオチンとTAT-コネキシン43 266-283の融合は、GSCに対するTAT-コネキシン43 266-283の抗増殖効果を変化させないことが示されています。

BCPPプルダウンとそれに続くウェスタンブロットの代表的な結果をここに示します。ウェスタンブロットは、TATと相互作用すると記載されているタンパク質、例えばCav-1が両方の条件で現れることを示しています。Cx43と相互作用することが記載されているタンパク質、例えば、c-SrcおよびPTENは、TAT−コネキシン43 266-283プルダウンの直後に現れるが、一方、Cx43またはTATと直接相互作用しないタンパク質、例えばFAKは存在しない。

共焦点顕微鏡画像は、BCPPと見られる細胞内相互作用を確認します。この画像は、G166 GSCの細胞内共局在とc-SrcとC-SrcのG166 GSCの細胞内共局在を示しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2日で習得できます。

この手順を試行する際は、ペプチドを添加する前に、試薬と遠心分離機の温度、および細胞の合流を確認することが重要です。このビデオを見れば、ビオチン化細胞透過性ペプチドを用いた細胞内タンパク質間相互作用の研究方法について十分に理解できるはずです。この技術の開発後、この技術は、培養細胞、器官型培養、さらにはin vivoモデルにおける細胞内分子メカニズムとその系統特異的経路を探求するための細胞シグナル伝達分野の研究への道を開きます。

この手順に従うと、RNA配列、ナノ粒子、ウイルス、または細胞透過性ペプチドを輸血し、融合してTATをプルダウンできる他の分子などの他の生理活性カーゴを使用して、それらの細胞内作用機序を研究することができます。このプロトコルには極端に危険な物質は含まれていませんが、この手順を実行するときは手袋と白衣を忘れずに