4.8: 細胞表面ビオチン化アッセイ

ビオチンによる細胞表面タンパク質の標識は、膜タンパク質の調節に関与する細胞輸送経路を研究するための強力なツールとなります。細胞は、表面で厳密に制御された一連のタンパク質を維持しているため、いくつかのシグナル伝達経路を介して細胞外情報を受け取り、応答することができます。エンドサイトーシスは、飲み込むプロセスであり、これらの細胞表面タンパク質の内在化を引き起こすことにより、これらの細胞表面タンパク質の調節に関与していることが示唆されています。したがって、これらのタンパク質をエンドサイトーシスする前にビオチンなどの薬剤で標識することで、科学者はそれらの内在化を定量化し、細胞経路での役割を研究するのに役立ちます。

このビデオでは、細胞表面ビオチン化アッセイの原理と方法論について説明し、科学者が今日この方法を適応させているいくつかの方法を探ります。

まず、細胞表面ビオチン化アッセイの原理についておさらいしましょう。

前述のように、細胞はエンドサイトーシス経路を使用して、表面タンパク質の時空間密度と分布を調節します。取り込まれたタンパク質は、特定の細胞経路を通じて輸送され、その後、リソソームにシャントされて分解されるか、細胞表面にリサイクルされて活性が継続されます。細胞表面ビオチン化は、これらのプロセスを測定するように設計されています。

このアッセイで使用されるタグであるビオチンは、ビタミンHとも呼ばれ、小さな水溶性分子です。表面標識実験に一般的に使用されるビオチンの誘導体は、スルホ基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ジスルフィド結合、そしてもちろんビオチンからなるスルホ-NHS-SS-ビオチンです。ビオチンを文字「B」に置き換えることで、この巨大な構造を単純化しましょう。

この構造のスルホ基は、この形態のビオチン膜を不透過性にする強い電荷を与えます。細胞表面タンパク質の標識は、エンドサイトーシスに制限的な温度に維持された細胞にスルホ-NHS-SS-ビオチンを添加することによって行われます。NHSグループは、表面タンパク質上の第一級アミンと反応し、共有結合を形成します。

次に、標識された細胞はエンドサイトーシスに許容される温度に移動され、その間に標識されたタンパク質の一部が内在化されます。最後に、細胞を制限温度に戻してエンドサイトーシスを停止します。内在化タンパク質を特異的に定量するために、L-グルタチオンのような親水性で膜を通さない還元剤を添加します。これは、非エンドサイトーシスのスルホ-NHS-SSビオチン上のジスルフィド結合と反応し、ビオチン基を切断します。この時点で、残っているビオチン化タンパク質は、以前に内在化されていたために標識が還元剤から保護されていたタンパク質です。

次に、細胞を溶解し、エンドサイトーシスしたビオチン化タンパク質を単離して定量します。単離は通常、ストレプトアビジンでコーティングされた合成ビーズに細胞溶解物を添加することによって行われます。ストレプトアビジンはビオチンに対して非常に高い親和性を持つため、ビオチン化タンパク質は被覆ビーズに付着します。コンタミネーションタンパク質を除去するための一連の洗浄ステップ、そして最後に結合タンパク質を放出するための溶出ステップが行われます。その後、標的タンパク質はウェスタンブロッティングなどの技術で分析できます。

ビオチン化アッセイの背後にある概念を理解したところで、表面タンパク質のエンドサイトーシスを測定するためのこの手順の実行方法を示す一般化されたプロトコルを見てみましょう。

4°Cに冷却した培養細胞から始め、エンドサイトーシスを制限する温度を維持するために氷の上に置きます。次に、膜不透過性のスルホ-NHS-SS-ビオチン試薬を添加し、細胞を暗所で約30分間インキュベートします。これにより、ビオチン標識が表面タンパク質に共有結合するのに十分な時間を確保できます。その後、細胞を氷から取り出し、37歳でインキュベートします。Cを約30分間。この温度では、ビオチン化表面タンパク質がエンドサイトーシスされます。インキュベーション後、細胞は4に冷却されますか?C、およびL-グルタチオンのような親水性還元剤が添加されます。これはジスルフィド結合と反応し、標識された非エンドサイトーシスタンパク質からビオチン基を放出します。

次に、細胞を遠心分離によって溶解し、細胞膜を破壊し、ビオチン化タンパク質を露出させます。その後、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズにライセートを添加し、ビオチン化タンパク質を結合させます。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、界面活性剤と還元剤を含む緩衝液で溶出します。これらの試薬は、ビーズから結合したタンパク質を変性させ、溶出液中での回復を可能にします。溶出液中のタンパク質は、ゲル電気泳動によりその分子量に基づいて分離されます。最後に、ウェスタンブロッティングとタンパク質特異的抗体によるブロットのプローブにより、標的タンパク質の可視化が可能になります。エンドサイトーシスされたタンパク質の割合は、結果として得られるバンド密度から定量化できます。

細胞ビオチン化の方法論を理解したところで、具体的な実験でビオチン化がどのように使用されているかを見てみましょう。

このビオチン化プロトコルの最も一般的な用途は、特定の細胞表面タンパク質のエンドサイトーシス速度を測定することです。ここで、科学者たちはドーパミントランスポーターまたはDATの内在化を評価することに興味を持っていました。標準的なプロトコルに従うことで、科学者はエンドサイトーシスされたDATの割合を測定することができました。これは、レーンTを示す代表的なイムノブロットであり、「total?」内在化前のタンパク質の量、レーンSは「剥ぎ取られた」ためのものですか?細胞がエンドサイトーシスを進行することを許されなかったが、還元剤で処理されたサンプル、およびレーンIは「内在化」の結果を表していますか?タンパク質。

科学者たちは、表面タンパク質のエンドサイトーシスを測定するだけでなく、このプロセスに対する薬物の影響も調べています。この研究では、研究者は、DATの内部化を誘導することが示唆されているプロテインキナーゼC(PKC)の活性化剤による処理に応答するDATの表面密度を評価しました。科学者たちは、in vitroビオチン化プロトコルをマウス脳組織のex vivoアッセイに適合させることで、このことを確認しました。このデータにより、PKCの活性化に応答して、細胞膜からDATが約30%失われることが明らかになりました。

最後に、ビオチン化アッセイを微調整することで、科学者は膜タンパク質のリサイクルも測定できます。ここでは、研究者たちは、塩化物イオンの伝導に関与する表面チャネルタンパク質であるCFTRを調査していました。リサイクルを評価するために、研究者は1つの細胞グループで標準的なビオチン化プロトコルを実行し、2番目のグループでは、非エンドサイトーシス表面タンパク質からビオチンを切断した後にステップを追加することでプロトコルを変更しました。これらの追加手順には、温度を37度に戻すことが含まれていましたか?Cは、内在化されたビオチンタグ付き受容体タンパク質の一部をリサイクルできるようにします。リサイクルが行われる前と後で内在化したタンパク質の差を計算することにより、これらの科学者は、膜にリサイクルされたCFTRの割合を定量化することができました。

JoVEの細胞表面ビオチン化アッセイの紹介をご覧になりました。このビデオでは、このアッセイの手順を説明し、各ステップで発生する反応について説明しました。最後に、この方法の適用性を実証したいくつかの実験例を検討しました。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!