ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用
January 16th, 2018
最近我々 は様々 なタンパク質の一次線毛による生細胞内透過輸送ルートの三次元 (3 D) 空間の場所を割り当てられます。ここで実験のセットアップ、生体試料のプロセスおよびアプローチを新しくイメージング 3 D 超解像蛍光のデータ解析の適用と課題については、一次繊毛を住んでいます。
この実験の全体的な目標は、一次繊毛のタンパク質輸送経路を特定することです。この方法は、正常な繊毛と機能不全の繊毛におけるタンパク質輸送経路の違いなど、繊毛分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生細胞の回折タンパク質の輸送経路を見るのに十分な高い分解能を備えていることです。
まず、NIH-3T3細胞の特別に設計された冷凍ストックを摂氏37度で解凍し、実験の1週間半前に解凍します。解凍した細胞を、3ミリリットルの予熱培地が入った25cm四方の細胞培養フラスコに移します。細胞を5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度に維持します。
細胞が80%のコンフルエント度に達するまで細胞を培養し、その後、細胞を分割します。細胞を分割するために、0.25%トリプシンで摂氏37度で2分間トリプシン化します。短時間のインキュベーション後、トリプシンを吸引し、2ミリリットルの予熱培地と交換します。
培地をピペットで動かして細胞クラスターを分断し、フラスコから細胞の75%を取り出し、培地の総量を最大3ミリリットルに戻します。実験の前に少なくとも3回細胞を分割して、細胞周期の均一性を確保します。実験の2日前に、細胞を分割し、同じ培地1.5ミリリットルを含む35ミリメートルのガラス底板に60〜70%のコンフルエントにプレートします。
次に、実験の1日前に、目的のプラスミドを細胞に化学的にトランスフェクションします。500〜1000ナノグラムのプラスミドをトランスフェクション試薬と0.25ミリリットルの還元血清培地と1対2.5の比率で30分間混合します。トランスフェクション複合体が形成されたら、35 mmのガラス底皿から培地を吸引し、0.25 mmのトランスフェクション混合物と抗生物質を含まない追加の1.25 mmの還元血清培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。
外部標識SSTR3コンストラクトを有する細胞の場合、実験の1時間前にガラス底皿から培地を取り出します。細胞を1ミリリットルのPBSで5回洗浄し、1ミリリットルの還元血清培地に1マイクロモルのAlexa 647標識ストレプトアビジンを添加します。実験の15分以内に、ガラス底皿から培地を取り出し、1ミリリットルのPBSで細胞を5回洗浄します。
次に、1ミリリットルのイメージングバッファーをガラス底皿に加えます。ガラス底板を顕微鏡のステージに取り付けます。GFPフィルターセットを使用してGFP express細胞を見つけ、一次繊毛でSSTR3-GFPを適切に発現している細胞を見つけます。
適切な細胞が見つかったら、一次繊毛の基部にあるNPHP4-mCherryスポットを、レーザーの一点照明に対応するイメージング平面上の位置に合わせます。スナップ機能を使用して、フォーカスコントロールウィンドウのカメラタブで、緑色の蛍光タンパク質でタグ付けされたNPHP4-mCherryおよびSSTR3タンパク質の落射蛍光画像をキャプチャします。参照画像が得られたら、1ミリワットのレーザー照明で遷移帯を20秒間光退色することにより、標識された単一分子の濃度を局所的に減らします。
単一分子のトラッキングに備えるには、Alexa 647で標識された分子のレーザー照射出力を0.5ミリワットに下げます。ゲインとインテンシフィケーションを最大に設定し、フレーム レートを 2 ミリ秒に設定します。次に、フォーカスコントロールウィンドウのカメラタブにあるストリームボタンをクリックし、適切な照明レーザーを作動させます。
光退色されていない標識単分子が遷移ゾーンの光退色領域を通って輸送されるときに記録します。また、毛様体ドリフトの影響を避けるために、ビデオを2分以内に録画することを忘れないでください。単一分子をキャプチャした後、Gelles ラボの Glimpse などの 2D ガウス近似アルゴリズムを使用してビデオを処理し、各分子の励起点、拡散関数、および対象領域の重心を正確に特定します。
最後に、10ナノメートルを超える精度ですべての単一分子位置を選択し、2Dガウス関数で適合した単一分子位置の分布に基づいて繊毛の中心を補正します。このビデオで説明されているように、シングルポイント照明を使用して、NPHP4-mCherryでマークされた遷移ゾーンを通じてAF647タグ付きSSTR3分子を追跡できます。データ解析の前に、広視野照明に単一分子ビデオを重ね合わせることは、レーザーが適切に位置合わせされていること、および適切な信号対雑音比があることを確認するための有用な検証ステップです。
ここで画像に示されているのは、染色によって同定された一次繊毛を持つ細胞です。IFT20は、Arl13b-mCherryでマークされた一次繊毛内の微小管に沿って貨物を運ぶ鞭毛内輸送複合体の構成要素です。同定されたら、速度顕微鏡法を使用して個々のIFT20-GFPタンパク質を追跡します。
次に、2Dから3Dへの変換アルゴリズムを使用して、一次繊毛内のタンパク質の空間確率密度分布を1次元に沿って生成します。この高密度領域は、鞭毛内輸送経路の既知の位置と一致して、軸索微小管と共局在している可能性があります。この手順を試行する際は、システマティックエラーを最小限に抑えるために、サンプルをレーザーに正確に位置合わせすることが重要です。
このビデオを見れば、速度顕微鏡による単一分子トラッキングの方法や、一次繊毛の単一分子輸送経路の取得方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、超解像度蛍光イメージングを用いて一次繊毛におけるタンパク質輸送経路の三次元（3D）空間位置をマッピングすることに焦点を当てています。実験のセットアップとデータ分析の詳細が提供され、生きた細胞におけるタンパク質輸送に関する洞察が得られます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光イメージング
背景
- 一次繊毛は細胞内シグナリングにおいて重要な役割を果たします。
- タンパク質輸送経路を理解することで、正常および機能不全の繊毛の違いを明らかにすることができます。
- これらのプロセスを生きた細胞で研究するには、高解像度のイメージング技術が不可欠です。
- この研究は、繊毛の機能と機能不全のより広範な理解に貢献します。
研究の目的
- 一次繊毛におけるタンパク質輸送経路を特定すること。
- 正常および機能不全の繊毛間の輸送経路の違いを調査すること。
- 生きた細胞研究のための解像度の向上された新しいイメージング技術を適用すること。
使用された方法
- 3D 超解像度蛍光イメージング。
- 生きたイメージングのための NIH-3T3 細胞の準備。
- 制御された条件下での細胞の解凍と培養。
- タンパク質輸送経路をマッピングするためのデータ分析。
主要な結果
- 生きた一次繊毛におけるタンパク質輸送経路のマッピングに成功。
- 様々な条件下での輸送経路の重要な違いの特定。
- イメージング技術の効果の実証。
- 繊毛におけるタンパク質輸送のダイナミクスに関する洞察。
結論
- この研究は、一次繊毛におけるタンパク質輸送に関する新しい視点を提供します。
- 高解像度イメージングは、繊毛の機能に関する重要な洞察を明らかにすることができます。
- 将来の研究は、これらの発見を基に繊毛機能不全を探求することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
