ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

この実験の全体的な目標は、一次繊毛のタンパク質輸送経路を特定することです。この方法は、正常な繊毛と機能不全の繊毛におけるタンパク質輸送経路の違いなど、繊毛分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生細胞の回折タンパク質の輸送経路を見るのに十分な高い分解能を備えていることです。

まず、NIH-3T3細胞の特別に設計された冷凍ストックを摂氏37度で解凍し、実験の1週間半前に解凍します。解凍した細胞を、3ミリリットルの予熱培地が入った25cm四方の細胞培養フラスコに移します。細胞を5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度に維持します。

細胞が80%のコンフルエント度に達するまで細胞を培養し、その後、細胞を分割します。細胞を分割するために、0.25%トリプシンで摂氏37度で2分間トリプシン化します。短時間のインキュベーション後、トリプシンを吸引し、2ミリリットルの予熱培地と交換します。

培地をピペットで動かして細胞クラスターを分断し、フラスコから細胞の75%を取り出し、培地の総量を最大3ミリリットルに戻します。実験の前に少なくとも3回細胞を分割して、細胞周期の均一性を確保します。実験の2日前に、細胞を分割し、同じ培地1.5ミリリットルを含む35ミリメートルのガラス底板に60〜70%のコンフルエントにプレートします。

次に、実験の1日前に、目的のプラスミドを細胞に化学的にトランスフェクションします。500〜1000ナノグラムのプラスミドをトランスフェクション試薬と0.25ミリリットルの還元血清培地と1対2.5の比率で30分間混合します。トランスフェクション複合体が形成されたら、35 mmのガラス底皿から培地を吸引し、0.25 mmのトランスフェクション混合物と抗生物質を含まない追加の1.25 mmの還元血清培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。

外部標識SSTR3コンストラクトを有する細胞の場合、実験の1時間前にガラス底皿から培地を取り出します。細胞を1ミリリットルのPBSで5回洗浄し、1ミリリットルの還元血清培地に1マイクロモルのAlexa 647標識ストレプトアビジンを添加します。実験の15分以内に、ガラス底皿から培地を取り出し、1ミリリットルのPBSで細胞を5回洗浄します。

次に、1ミリリットルのイメージングバッファーをガラス底皿に加えます。ガラス底板を顕微鏡のステージに取り付けます。GFPフィルターセットを使用してGFP express細胞を見つけ、一次繊毛でSSTR3-GFPを適切に発現している細胞を見つけます。

適切な細胞が見つかったら、一次繊毛の基部にあるNPHP4-mCherryスポットを、レーザーの一点照明に対応するイメージング平面上の位置に合わせます。スナップ機能を使用して、フォーカスコントロールウィンドウのカメラタブで、緑色の蛍光タンパク質でタグ付けされたNPHP4-mCherryおよびSSTR3タンパク質の落射蛍光画像をキャプチャします。参照画像が得られたら、1ミリワットのレーザー照明で遷移帯を20秒間光退色することにより、標識された単一分子の濃度を局所的に減らします。

単一分子のトラッキングに備えるには、Alexa 647で標識された分子のレーザー照射出力を0.5ミリワットに下げます。ゲインとインテンシフィケーションを最大に設定し、フレーム レートを 2 ミリ秒に設定します。次に、フォーカスコントロールウィンドウのカメラタブにあるストリームボタンをクリックし、適切な照明レーザーを作動させます。

光退色されていない標識単分子が遷移ゾーンの光退色領域を通って輸送されるときに記録します。また、毛様体ドリフトの影響を避けるために、ビデオを2分以内に録画することを忘れないでください。単一分子をキャプチャした後、Gelles ラボの Glimpse などの 2D ガウス近似アルゴリズムを使用してビデオを処理し、各分子の励起点、拡散関数、および対象領域の重心を正確に特定します。

最後に、10ナノメートルを超える精度ですべての単一分子位置を選択し、2Dガウス関数で適合した単一分子位置の分布に基づいて繊毛の中心を補正します。このビデオで説明されているように、シングルポイント照明を使用して、NPHP4-mCherryでマークされた遷移ゾーンを通じてAF647タグ付きSSTR3分子を追跡できます。データ解析の前に、広視野照明に単一分子ビデオを重ね合わせることは、レーザーが適切に位置合わせされていること、および適切な信号対雑音比があることを確認するための有用な検証ステップです。

ここで画像に示されているのは、染色によって同定された一次繊毛を持つ細胞です。IFT20は、Arl13b-mCherryでマークされた一次繊毛内の微小管に沿って貨物を運ぶ鞭毛内輸送複合体の構成要素です。同定されたら、速度顕微鏡法を使用して個々のIFT20-GFPタンパク質を追跡します。

次に、2Dから3Dへの変換アルゴリズムを使用して、一次繊毛内のタンパク質の空間確率密度分布を1次元に沿って生成します。この高密度領域は、鞭毛内輸送経路の既知の位置と一致して、軸索微小管と共局在している可能性があります。この手順を試行する際は、システマティックエラーを最小限に抑えるために、サンプルをレーザーに正確に位置合わせすることが重要です。

このビデオを見れば、速度顕微鏡による単一分子トラッキングの方法や、一次繊毛の単一分子輸送経路の取得方法について十分に理解できるはずです。