胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル

この栄養膜細胞培養モデルの全体的な目標は、栄養膜のクリティカルパスの調節に対する肥満関連炎症の影響を測定することです。この制御システムの主な利点は、TNFαを介した炎症と、母体肥満の文脈における胎盤の遺伝子調節との関係を確立することです。この実験システムの主な利点は、TNF-αを介した炎症と、母親の肥満の文脈における胎盤の遺伝子調節との関係を確立することです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるBailey SimonとMatt Bucherです。絨毛組織は、送達後できるだけ早く、できれば30分以内に胎盤からサンプリングする必要があります。.絨毛板を上に向けて、鉗子とハサミを使用して、胎盤の周囲から2〜3センチメートルのところにある2〜3つの全層セクションをランダムに切除します。

異常に見える胎盤の部分は避けてください。絨毛膜板と基底板、および大きな血管を切り取ります。得られた絨毛組織を温かく完全な培地に置きます。

絨毛組織サンプリングから30分以内に、栄養膜の分離を開始します。絨毛組織の各片を室温PBSで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、穏やかに攪拌して組織内の余分な血液を放出します。PBSをデカントし、新しいPBSと交換します。

余分な血液のほとんどが除去されるまで、PBSリンスを繰り返します。PBSリンスは、ティッシュを十分にすすぐと、淡い赤またはピンクになります。絨毛組織を滅菌ペトリ皿に入れ、顕微鏡スライドを使用して血管から柔らかい絨毛組織を優しくこすり落とすことにより、できるだけ多くの血管を取り除きます。

はさみを使用して、得られた絨毛組織を細かく刻みます。細かく刻んだ絨毛組織を、トリプシンとDNaseの比活性に基づいて計算された量に従って消化溶液を入れた滅菌ボトルに移します。.消化ボトルを摂氏37度の水浴中で、70rpmで35分間振とうしながらインキュベー

35分後、消化ボトルを横に傾け、未消化の組織片をボトルの底に沈殿させます。血清学的ピペットで上清を慎重に引き上げ、沈殿した組織を避けます。上清を100ミクロンのセルストレーナーを通して、50ミリリットルの円錐管の間に均等に分配します。

残りの沈殿した組織に消化溶液を加え、ボトルを摂氏37度の水浴でインキュベートすることにより、2回目の消化を開始します。最初の消化で緊張した上清の下に、チューブの底にある血清ピペットからゆっくりと分注することにより、3〜5ミリリットルの新生仔牛血清(NCS)を穏やかに重ねます。栄養膜を含む緊張した上清とNCSの間の半月板が見えるはずです。

NCS上で上清を1.250倍、摂氏20度で15分間遠心分離します。得られたペレットには、最下層に赤血球が含まれ、続いて栄養膜細胞を含む白い層が含まれます。同様に、2回目と3回目の消化から上清を濾します。

濾した上清の下にNCSを敷き詰め、20°Cでgの1,250倍を15分間遠心分離する。すべての上清を遠心分離し、NCSと上清層を除去したら、各ペレットを5ミリリットルの温かい完全培地に再懸濁し、懸濁液をプールします。細胞懸濁液を2本の50ミリリットル円錐管に均等に分割し、20°Cで1,250倍gで15分間遠心分離する。

上清を静かに取り除き、各細胞ペレットを6ミリリットルの温かい完全な培地に再懸濁します。この手順を開始するには、トランスファーピペットを使用して細胞懸濁液を密度勾配の上にゆっくりと慎重に重ねることにより、細胞懸濁液を4つの密度勾配に均等に分割します。密度勾配を1、250倍g、摂氏20度で20分間遠心分離し、加速と減速を最小限に抑えます。

これにより、沈殿した細胞の識別可能なバンドが生成されます。栄養膜細胞を含む不透明なバンドに到達するまで、密度勾配培地の最上層をゆっくりと慎重に除去します。栄養膜バンドを2本の50ミリリットルの円錐形チューブに移し、温かみのある完全な培地で満たします。

チューブを3〜6回静かに反転させて混合し、摂氏20度で1、250倍のgで15分間遠心分離します。上清を取り除き、各細胞ペレットを5ミリリットルの温かい完全な培地に再懸濁します。細胞懸濁液を組み合わせ、血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞をカウントします。

細胞計数後の次のステップは、細胞をプレートすることです。各6ウェルプレートにウェルあたり300万個の細胞をプレート化します。プレートを前後左右に静かに揺らして、細胞を均等に分散させます。

めっきされたセルを層流ベントに約30分間放置して、セルが均一に分布し、沈殿し、ウェルの底に付着し始めるようにします。30分後、プレートを5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度のインキュベーターに置きます。培養後24時間後に栄養膜を顕微鏡で観察し、付着と適切な栄養膜の形態を確認します。

細胞は、培養の24時間後に処理することができます。細胞から培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルのTNFアルファ補充培地と交換します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。

TNFアルファ曝露の24時間後、TNFアルファサプリメント培地を完全な培地と交換します。さらに24時間インキュベートします。TNFアルファの除去から24時間後、培地を吸引し、室温PBSで細胞を穏やかにすすいでください。

新たに添加したプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む80マイクロリットルの氷冷放射性免疫沈降アッセイバッファーを各ウェルに直接添加します。セルスクレーパーでプレートからセルを取り出します。細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、治療グループ内にウェルをプールします。

チューブを高でボルテックスして、15秒の間隔を少なくとも3回空けて細胞を氷結させます。細胞を摂氏4度で15分間揺さぶりながらインキュベートします。チューブを再び高いところで渦巻きます。

の破片をペレット化するために、摂氏4度で5分間、10, 000倍gで遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞タンパク質サンプルを摂氏80度で保存し、目的のタンパク質をウェスタンブロッティングで分析します。

培養の72時間後、初代栄養膜におけるサイトケラチン7(赤)の免疫細胞化学的分析により、細胞が多核細胞塊の存在によって証明される合胞体化を受けたことが確認されました。さらに、ビメンチンの免疫細胞化学的分析では、同じく赤色で、汚染された線維芽細胞はほとんど見つかりませんでした。核対比染色は、両方の画像で青色で示されています。

ミリリットルあたり最大250ピコグラムのTNFアルファによる治療は、ルビコン発現をアップレギュレートします。TNFα濃度がミリリットルあたり250ピコグラムを超えると、ルビコンの発現レベルはベースラインに向かって減少し、さらにそれ以下まで減少しました。同様に、ルビコンは、女性胎児の肥満妊娠からの胎盤からの瞬間凍結絨毛組織生検において、リーンコントロールと比較して大幅にアップレギュレーションされます。

一度習得すると、絨毛組織からの栄養膜の分離は、適切に実施されれば6〜7時間で行うことができます。この手順を試行する際は、意図的かつ効率的に作業できるように、事前に材料と試薬を準備することが重要です。この手順に続いて、細胞の生体エネルギーを測定するアッセイなどの他のアッセイを実行して、肥満の子宮内環境での炎症が栄養膜の代謝能力に影響を与えるかなどの追加の質問に答えることができますか?

この開発方法により、胎盤研究者が母体環境が栄養膜機能に及ぼす影響を確立する道が開かれました。このビデオを見れば、細胞培養実験のために絨毛組織から栄養膜を単離する方法や、栄養膜の重要経路の調節におけるTNFα媒介性炎症の影響を判断する方法について、十分に理解することができます。ヒト組織、培養細胞、DMSO、アクリルアミド、還元試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切なPPEの着用や無菌技術の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。