Name: 胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶヒト絨毛細胞の原代培養法とTNFα処理による肥満関連炎症の遺伝子制御への影響測定法。このモデルは胎盤機能と母体代謝の関係解明に有用です。

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著者は、この研究のため、胎盤を寄付女性をありがとうございます。我々 も胎盤のコレクションを調整するため労働と配信部門大須母体と胎児の研究チームに感謝します。王博士は、エリックとケリー郭、MD にサポートに感謝して、実験方法と最適化を支援します。
NIH HD076259A (AM) によって資金が供給されたこの作品、AHA GRNT29960007 (AM)。

からインフォームド コンセントとオレゴン健康制度検討委員会とオレゴン州ポートランドの大学によって承認プロトコルの下で労働と大学病院でのデリバリー ユニットから胎盤を採取、患者。
 1。 コレクションの胎盤組織 <ol><li>準備 注: 組織が検出したすべての機器を滅菌する必要があります。
	<ol><li>121 で 60 分間オートクレーブによる解離性装置を殺菌 ° C</li>
		<li>個人保護用具 (PPE) を使用: ラボ コート/ガウン/ボディス クラブ、手袋、顔面シールドまたはゴーグルとマスクします</li>。
		<li>水バス、37 に設定オン ° C</li>
		<li>2 50 mL の円錐管、完全なメディア含む各 25 mL を暖める (Iscove &#39; s 修正ダルベッコ &#39; s 10 %fbs と 1% 培ペニシリン/ストレプトマイシン、表 3) 37 ° C の水浴中</li>。
		<li>情報に基づく患者の同意、帝王切開で配信の直後胎盤を取得します</li>。
		<li>の胎盤も精通します。臍帯が胎児側 (絨毛プレート) 挿入され、臍帯挿入部位から放射状に広がる血管を見ることができます。反対側は、母体側、または基底板です。脱落膜と子葉と呼ばれる容器の木を含む構造体が含まれています</li>。
	</ol></li> <li>絨毛組織サンプリング 注: できるだけ早く以下の配信、できれば 30 分以内胎盤絨毛組織をサンプリングします。
	<ol><li>絨毛のプレートと 2-3 全層セクション (約 2.5 cm × 2.5 cm サイズ) を消費税上向き、ランダムを使用して鉗子ではさみ ( 図 1 a) 胎盤の外周から 2-3 cm 。
		注: 胎盤の異常 (黒地に白の石灰化) が表示されるパーツを避ける</li>。
		<li>絨毛と基底板と、大きな血管をトリムします</li>。
		<li>温かみのある完全なメディアで結果絨毛組織 ( 図 1 b、合計約 80 ~ 120 g) を置き、サンプリングの 30 分以内の栄養膜分離を開始します 。
		注: いくつかのダウン ストリーム試金およびアプリケーションを配信、サンプリング、および胎盤絨毛細胞分離間の潜伏期間の長さによって受けます。可能と分離間で一貫して短いとしてこれらの期間を維持することをお勧めします</li>。
		<li>(センターを含む) 胎盤絨毛組織全体からの 5 つのランダムな 1 cm × 1 cm のセクションのサンプル手順 - 1.2.1、1.2.2 で説明した手法を使用しています</li>。
		<li>に 4-5 分割 (約 30 mg 各)、各 1 cm x 1 cm の絨毛組織サンプル 2 mL 遠心チューブに配置し、フラッシュ カットは、リキッド N 2 でフリーズします。後の分析で使用するため-80 ° c ストア</li>。
	</ol></li></ol> 2。絨毛組織から絨毛トロホブ ラスト分離 <ol><li>準備 注: 滅菌装置を使用し、層流フードのセルを伴う手順を実行します。
	<ol><li>雪解け 4 冷凍密度勾配 (表 1 必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照してください) 4 ° C、胎盤が到着する前に、の夜で 。
		注: または、密度勾配分離の日に行うことできます</li>。
		遠心分離機で 20 セット <li>ターン ° C 
		注: すべての遠心分離手順については、最大加速度と減速度指定しない限りします</li>。
		<li>X HEPES 緩衝塩類溶液 (HBSS) Ca +2 と Mg +2 (表 3) 補足の準備 1.</li>
		<li>暖かいトリプシン 37 ° C</li>
		<li>約 2720 kilounits/ml に滅菌希釈 DNase 補完 HBSS</li>。
		<li>新生子牛の血清 (NCS) 37 ° c の暖かい 50 mL</li>
		<li>37 に完全なメディアを暖かい ° C</li>
		<li>暖かい凍結メディア (90 %fbs、10 %dmso、表 3) 37 ° C 
		注意:DMSO は有毒である、手袋をはめて処理する必要があります</li>。
		<li>準備消化バッファー (表 2 および 3) の 308 の mL を混合することによって補われる HBSS、50 mL のトリプシン (3751.7 BAEE 単位/mL) と DNase の 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) 滅菌ボトルにします 。
		注: 絨毛組織から細胞を分離するおおよその所要時間は 7 h.</li>
	</ol></li> <li>絨毛組織を処理 <ol><li>リンス 50 mL の円錐管に絨毛組織の各部分に満ちて室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。繰り返し、余分な血液が削除されるまで、必要に応じて PBS を交換 (PBS リンスされる明るい赤またはピンク、組織は徹底的に洗浄).</li>
		<li>滅菌シャーレ内絨毛組織を置き、軽く削ってできるだけ多く血管オフ顕微鏡スライドを使用した血管から軟絨毛組織を削除します</li>。
		<li>はさみを使用して結果の絨毛組織を細かくミンチします</li>。
	</ol></li> <li>絨毛組織の消化とトロホブ粗分離 <ol><li>分解酵素トリプシンの特定のアクティビティに基づいて計算されたボリュームによると液と滅菌ボトルにみじん切りにした絨毛組織を転送DNase (165 mL、表 2).</li>
		70 回転/分 (rpm) で揺れを 37 ° C の水浴のインキュベーションの <li>後 35 分はその側に消化ボトルを傾けるし、ボトルの底で解決する組織の未消化の部分を許可します。慎重にまとまった組織を避け血清ピペットで上澄みを描画します</li>。
		<li>は 50 mL の円錐管に均等 100 μ m 携帯こし器を通って上澄みを調剤します 。
		注: 時間を節約するそれは 2 つ目を開始することをお勧め残り消化液 (110 mL、表 2) を追加することによって消化解決組織と 2.3.2 の手順で説明するように孵化を再開します</li>。
		<li>は、血清ピペット管の下部からゆっくりと調剤して緊張した上清の下に NCS の 3-5 mL を優しく層します。緊張した上清 (トロホブ含む) と NCS のメニスカスが表示されます ( 図 2 a) をする必要があります</li>。
		<li>遠心培養上清 NCS 上 20 ° C で 15 分間 1,250 × g結果として得られるペレット栄養膜細胞 ( 図 2 b) を含む白い層に続いて、最下位層で赤血球が含まれます</li>。
		<li>2.3.2 - 2.3.5 それぞれ (110 mL と 83.5 m それぞれ追加、組織、テーブル 2 のボトルに消化液の) 2 番目と 3 番目の消化力のための手順を繰り返します</li>。
		<li>すべての培養上清が遠心分離されて、温かみのある完全なメディアの 5 mL にペレットを再懸濁します、懸濁液を一緒に分かち合う</li>。
		<li>2 つの 50 mL の円錐管と 1,250 × g で遠心する 20 で 15 分の間で均等に細胞懸濁液を分割 ° C</li>
		<li>はそっと上澄みを除去し、暖かい compl の 6 mL で各細胞ペレットを再懸濁しますえてメディア</li>。
	</ol></li> <li>密度遠心分離 <ol><li>ゆっくりと慎重に重ねる、ピペットと密度勾配の上に細胞懸濁液によって 4 つの密度勾配 (3 mL) 間で均等に細胞懸濁液を分割します</li>。
		<li>では、最小の加速と減速を 20 ° C で 20 分間 1,250 x g で密度勾配遠心分離機します。これは沈殿細胞 (表 4) の区別可能なバンドを生成する必要があります</li>。
		<li>(DGM 35-50%) の間に絨毛細胞を含む不透明なバンド (表 4) に到達するまでゆっくりと慎重にトップ層の密度勾配メディア (DGM) を削除します</li>。
		<li>2 つの 50 mL の円錐管に絨毛バンドを転送し、温かみのある完全なメディアでいっぱい</li>。
		<li>ゆっくりをミックスし、20 時 15 分 1,250 × g で遠心管 3 - 6 回反転 ° C</li>
		<li>は、上澄みを除去し、温かみのある完全なメディアの 5 mL で各細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を組み合わせるし、検定とトリパン ブルー色素を使用して実行可能なセルを数える (または最寄りの細胞計数法).</li>
	</ol></li> <li>カウント細胞診断 <ol><li>優しく数回チューブを反転、上下血清ピペットでピペッティングにより細胞懸濁液をミックスします</li>。
		<li>別のチューブに細胞懸濁液とトリパン ブルー (各 20 μ すなわち) の等量を組み合わせて、軽く混ぜる</li>。
		<li>室温で 1-2 分間加温します</li>。
		<li>優しくセル トリパンの 15-20 μ L を分注、coverslip と、検定の間に混合物を青し、細胞は、毛管作用によってグリッド上で拡散する</li>。
		<li>は、タリー カウンターと 4 つの 4 x 4 象限のそれぞれで (死んだ細胞、ディープ ブルーが染色される) 実行可能なセルをカウントします。セルが複数回カウントされないようにカウントのシステムを採用 (すなわち下または左の境界に接するセルはカウントされません). 
		注: 各 4 × 4 象限は、50-150 セル間含める必要があります。数が少なすぎる、またはあまりにも多くのセルがオーバーまたは細胞数の過小評価につながることができます</li>。
		<li>各 4 × 4 象限の総細胞数の平均を掛ける 10 4、その mL あたりのセル数を計算する希釈倍率 (トリパン ブルーに細胞懸濁液) に掛けると</li>。
		<li>ML あたりのセル数合計セルの利回りを計算するセルを懸濁液の総量を掛けます 。
		注: 約 1 億電池は絨毛組織の 80 ~ 120 g から始まる分離から期待されています</li>。
	</ol></li> <li>めっきセル <ol><li>6 ウェル プレート (ウェルあたり懸濁液 2 mL) で 300 万細胞/ウェル (3.3 cm 2 ごとの 5 セル数 10 倍) をプレートし優しく前後し、セルを均等に配布する側に側します 。
		注: トロホブに正しく従う処理組織培養プレートが必要です。細胞の膜は syncytialization を促進するために必要です</li>。
		<li>セルに均等に配布、解決、インキュベーターに配置する前に、井戸の底に付着し始めるように約 30 分のための層流フードのめっきされたセルのままにします</li>。
		<li>5% CO 2 と 95% 湿度 37 ° C の定温器で (毎日メディア変更) で最大 72 時間培養細胞 。
		注: は、10-20 倍の文化のすべての 24 h で顕微鏡下でトロホブを調べます。トロホブ増殖しないと継代することはできません。文化の 72 時間にわたって、ラウンド個々 トロホブ ヒューズ ( 図 3 a と B) 合胞体を形成する</li>。
	</ol></li> <li>凍結細胞 <ol><li>20 で 10 分間 1,250 × g で遠心分離によって未使用のセルをペレット ° C</li>
		<li>ペレットからできるだけ多くのメディアを吸い出しなさい</li>。
		<li>メディア (表 3) を凍結でペレットを再懸濁します</li>。
		<li>は、-80 ° c 100% イソプロパノールでいっぱい冷凍コンテナーで因数を固定します。長期保管のため次の日リキッド N 2 冷凍の因数を転送します 。
		注: セルは凍結後培養することができます</li>。
	</ol></li> <li>融解細胞 <ol><li>凍結細胞の因数を外し、旋回しながら 37 ° C の水浴で解凍。それは完全に液体に解凍した直前に水浴から因数を削除します</li>。
		<li>はすぐに 15 ml の円錐管に解凍のセルを転送します。断続的な混合の完全なメディアの 10 mL を追加し最初に、減速を開始します</li>。
		<li>ミックスにチューブを数回反転します</li>。
		<li>20 ° c. で 10 分の 200 × g で遠心します。</li>
		<li>、上清を吸引し、温かみのある完全なメディアの 2-5 mL にペレットを再懸濁します</li>。
		<li>細胞と前述したようにプレートをカウントします</li>。
	</ol></li></ol> 3。Tnf α、セル Lysates コレクション西部にしみが付くこととプライマリ絨毛トロホブ ラスト治療 <ol><li>準備 <ol><li>37 に完全なメディアを暖かい ° C</li>
		<li>の使用のための準備ができるまで完全なメディア、-20 ° C で店で tnf α の 10 μ g/mL 在庫を作る</li>。
		<li>は、細胞を治療する準備ができたら、完全なメディアの 1 μ G/ml の tnf α の在庫を作る。シリアル希釈 10 4 pg/mL、10 3 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、および完全なメディアで 125 pg/mL に tnf α 在庫 。
		注: 10 4 pg/mL の tnf α 濃度は緩やかな細胞傷害性です。テスト tnf α 濃度の調整は、目的のダウン ストリーム アプリケーションの仕様に依存します</li>。
	</ol></li> <li>Tnf α とセルを扱う <ol><li>文化の 24 h 後細胞から培地を吸引であり、tnf α の 2 mL で置換補足 6 ウェル プレート治療と車両ごと (少なくとも 2 つの井戸の井戸あたりのメディアコントロール).</li>
		<li>後 24 h tnf α 露出 (文化の 48 h) の tnf α の補完メディア完全なメディアに置き換えます</li>。
	</ol></li> <li>細胞の収穫および総蛋白 <ol><li>文化 (24 h 過去の tnf α の除去) の 72 時間後メディアを吸引、室温、PBS のセルを優しく洗い、氷冷 Radioimmunoprecipitation 試金の 80 μ L を追加新鮮なを含むバッファー (RIPA) は、各ウェルに直接プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (表 3) を追加します</li>。
		<li>は、細胞スクレーパーとプレートからセルを削除します。治療グループ内の井戸をプーリング 1.5 mL 遠心チューブにセルを転送します</li>。
		<li>15 の少なくとも 3 つの間隔の高いチューブ ボルテックスによって細胞を溶解 s.</li>
		<li>インキュベート 15 分ロッキング 4 ° c セル 
		注: また後ステップ 3.3.3、チューブ、ボルテックス、またはをピペッティングしはフリックすることで断続的な撹拌で 15 分間氷の上セルを培養することができます。wn</li>。
		<li>手順を繰り返します 3.3.3</li>。
		<li>細胞の残骸をペレットへの 4 ° C で 5 分間 10,000 x g でチューブを遠心します</li>。
		<li>新しい 1.5 mL 容マイクロ チューブや-80 で店へ転送清 (含む細胞タンパク質) ° C 
		注: プロトコルがここで停止し、後で再開しました。それは複数の凍結融解サイクルを避けるために細胞蛋白質のサンプルのいくつかの因数を作ることをお勧めします</li>。
		<li>ビシンコニン酸アッセイ等の優先の方法で総蛋白濃度を決定する (BCA は、必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照してください).</li>
	</ol></li> <li>SDS のページおよびウエスタンブロット ルビコンまたは興味の蛋白質の 注: に従って西部のしみが付くプロトコルをメーカーによると &#39; 最寄りのラボ システムを使用しての指示。
	<ol><li>ロード サンプル バッファー (表 3) 12% アクリルアミド ウェルあたりの総蛋白質の 20-40 μ g の間ゲル。バッファー (表 3) を実行している別の SDS-PAGE によるタンパク質</li>。
		<li>ウェット転送メーカーによるとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜にゲルからタンパク質 &#39; の転送バッファー (表 3) の指示</li>。
		<li>Tris-Buffered 生理食塩水で 0.1% と 5% 粉ミルクで膜をインキュベート トゥイーン 20 (TBST、表 3) ロッキング室温で少なくとも 1 時間</li>。
		<li>ルビコン一次抗体で膜をインキュベート (必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照) ロッキング 4 ° C で一晩 TBST で 1% ミルク パウダーで 1: 500 にします</li>。
		<li>ロッキング室温で TBS で膜 TBST で 1 × 5 分の 3 × 5 分は水洗いします</li>。
		<li>インキュベート集 - 1: 5000 の二次抗体の膜 (HRP リンクまたは最寄りの表示共役必需品、試薬、装置、補足資料の表を参照) に室温で少なくとも 1 h の TBST で 5% ミルク パウダーでロッキングします</li>。
		<li>3.4.5 手順に示した洗浄手順を繰り返し、イメージング システムの適切な可視化 (すなわち化学ルミネセンス) 基板を用いたしみを視覚化します</li>。
		<li>3.4.5 手順に示した洗浄手順を繰り返し、β-アクチンまたはメーカーによると最寄りのロード コントロールの膜をプローブ &#39; s 指示します</li>。
		<li>最寄りの画像解析ソフトで分析式吸光度 (バンド強度) の手動の定量化によるルビコンのバック グラウンドの吸光度と対応する荷重を正規化の減算はバンド強度を制御します。タンパク質レベルの統計的に有意な変化をテストする適切な統計解析を実行します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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胎盤は、胎児の成長を調整する責任は、肥満環境6で侵害された関数を展示します。絨毛トロホブ ラスト高の代謝要求にもかかわらず母性的な肥満と胎盤の機能不全のミトコンドリア呼吸6,19 を展示します。胎盤の代謝の変化合併症と肥満妊娠3,6,7で観察された胎児副作用の発生率の増加に貢献するかもしれない。オートファジーは、母性的な肥満と胎盤でも妥協しました。肥満妊娠男性胎児から胎盤は、オートファゴソーム13の蓄積によって証明されるよう機能不全 autophagic フラックスを表示します。生体のホメオスタシスの重要な最適 autophagic フラックスを維持は、母性的な肥満と胎盤における欠陥オートファジーは肥満妊娠に関連付けられている副作用を調停する...

肥満は、余分な脂肪と栄養アベイラビリティから生じる慢性的な軽度の炎症によって特徴付けられる炎症性状態です。肥満の循環で全身だけでなく、新陳代謝のティッシュの炎症性サイトカインが昇格されます。証拠の堅牢なボディは、tnf α は大幅上昇肥満の設定で意味を持つインスリン抵抗性と代謝不全1を示しています。Tnf α の活性化は、癌や自己免疫疾患、それに魅力的な治療上のターゲット2で病気の発症にもつながります。
妊娠、また炎症状態3,4によって肥満で炎症は悪化します。それは以前胎盤の tnf α のコンテンツがメスの胎児との妊娠の母体肥満と増加する示されています。さらに、tnf α の治療は、tnf α が性的に二形の方法5で胎盤の代謝の調節に関与していることを示唆している女性が、男性ではない栄養膜細胞のミトコンドリアの呼吸を阻害します。母性的な肥満は妊娠中、最も影響を受けやすい3,6,7,8 をされている男性の胎児の死産を含む様々 な合併症の発生率の増加に関連付けられています。.母体胎児のインターフェイスで、その重要な役割のため炎症性シグナル伝達への応答で肥満の子宮内環境で胎盤の機能の変化が肥満妊娠の結果を調停する際に重要な役割を再生可能性があります。
よくおよび胎盤の絨毛組織の syncytiotrophoblasts 内分泌シグナリングと母と発展途上の胎児9間栄養と酸素交換のため重要です。(以下、トロホブ) 絨毛よりよくの機能容量で中断が胎児の健康と開発を危険にさらします。このプロトコルでは、一次電池文化の絨毛トロホブ ラストの分離の最適化プロシージャと共に絨毛基底板を離れて解剖によるひと満期胎盤絨毛組織のサンプリング方法について説明します。このプロトコルはトロホブ10、を分離する差動密度遠心分離によって続いて細胞外マトリックスから細胞を解放する絨毛組織の酵素消化を含む確立された方法論から派生した11,12。このプロトコルの詳細は無駄のない妊娠から胎盤からプライマリ トロホブを扱われる炎症性の環境の 1 つのコンポーネントをシミュレートする tnf α を添加した培地でのアプローチは、母性的な肥満に関連付けられています。最後に、遺伝子発現の変化を検出するウエスタンブロット続いて tnf α 処理トロホブからの合計のセル lysates を収穫するための簡単な手順を説明します。
このモデルはそっくりそのまま子宮内環境 obesogenic を要約するだろうではない、tnf α を介した炎症トロホブの応答の個々 の貢献を解析することができます制御システムを提供します母性的な肥満。このモデルを発見したり、tnf α シグナル トロホブによる直接規制されている分子標的を確認、両方の機会を与えるだけでなく体内の母体と胎盤の遺伝子発現パターンの変化をテストすることができます。肥満では tnf α を介した炎症の可能性があります。
ここで説明している方法は、ひと培養トロホブ ラストにおけるオートファジーの調節における tnf α を介した炎症の影響をテストする実装されました。オスの胎児の展示と肥満妊娠からトロホブ中断オートファジーの回転、またはオートファゴソーム成熟13。ルビコン (実行ドメイン蛋白質相互作用の Beclin1 およびシステイン豊富なを含む)、後期エンドソーム、リソソームにローカライズされて、最近に記載されている「ブレーキ」として autophagic 回転プロセスに否定的なので、それと呼ばれるタンパク質オートファゴソーム成熟14,15のレギュレータ。実際には、ルビコン、貴重な治療上のターゲットとなるオートファジーを抑制するタンパク質のまれな例です。微生物16,17と心筋保護18に生得の免疫反応における役割を除いて、ルビコンの病態生理学的意義については、非常に小さな情報があり。ここで説明されているプロトコルを使用して、それはルビコンである tnf α の最大 250 pg/mL の濃度の増加と治療への反応で女性のプライマリ トロホブで亢進が見つかった。ルビコンの規制が役割を果たす女子胎児運賃に妊娠で男性より母性的な肥満と。肥満におけるクリティカルパスの導入規制子宮内環境の影響を検討するためのプラットフォームを提供します外因性 tnf α にひと培養トロホブ ラストを公開することによって前のヴィヴォ母性的な肥満に関連付けられている炎症をさたトロホブと胎盤の機能拡張。

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (無水)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (無水)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>ヘップ</td><td>スフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ギブコ</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>ワージントン バイオケミカル コーポレーション</td><td></td><td></td>LS002139</tr><tr><td>プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88668</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP166-600</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム。</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ックAAJ6228822</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブs 変性ダルベッコ's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal Calf Serum (NCS)</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-427-098</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3177-50UG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>K2EDTA vacutainer blood collection tubes</td><td>BD</td><td>366450</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL、天然</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658033</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast アクリルアミドキット、12%</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610175</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン 3 マルチキャスティングチャンバー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1654112</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli サンプルバッファー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>インスタント無脂肪ドライミルク</td><td>カーネーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ルビコン(D9F7)ウサギmAb</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>8465S</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗β;-マウスで産生されたアクチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228-100UL</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG、HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG、HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学発光基質</td><td>Thermo Scientific</td><td>34578</td><td></td></tr></tbody></table>

胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

母性的な肥満では、オートファジーの調節不全に起因する妥協の胎盤機能によって仲介される可能性の高い周産期副作用のリスクの増加に関連付けられます。肥満妊娠から胎盤におけるオートファジー因子の発現の異常な変化は、肥満や妊娠に関連付けられている炎症性プロセスによって規制される可能性があります。ここで説明した絨毛組織のサンプリングの一次電池文化期のひと胎盤から絨毛よりよくの隔離のためのプロトコルです。腫瘍壊死因子アルファ (tnf α)、肥満と高架は炎症性サイトカインと無駄のない妊娠からプライマリ トロホブを扱うことによって肥満の子宮内環境で炎症性の環境をシミュレートするためのメソッドが続きます妊娠。ここで説明されているプロトコルの実装、外因性への曝露が分られる tnf α は、ルビコン、メスの胎児で無駄のない妊娠からトロホブにおけるオートファジーの負の調節因子の発現を調節します。肥満の子宮内環境の生物学的要因の様々 な維持トロホブで重要な経路を調節する可能性、この前のヴィヴォシステムは表現パターンを生体内で観察された場合を決定するために特に便利ひと胎盤母性的な肥満では、tnf α シグナルの直接の結果です。最終的には、このアプローチはオートファジーと他細胞クリティカルパスに影響を与える可能性のあるトロホブの母性的な肥満に関連付けられている炎症の規制および分子の影響を解析する機会を与える胎盤がある機能。

言葉のリーンから人間の胎盤 (妊娠前ボディマス指数 (BMI) &lt; 25) 女性の子孫を運ぶ合併症妊娠と母親が収集し、帝王 (労働の禁止) でサンプル配信から 15 分以内。石灰化の典型的な開発の不在のため、胎盤を調べた: 丸型の形状、径 15-25 cm と臍帯の中間に挿入削除薄膜とへその緒で 300-600 g の重さがあって、胎盤。絨毛組織は主栄養膜分離の出発材料として絨毛組織の約 100 グラムが得られる (図 1)、胎盤全体から 2-3 サンプルの基底部および絨毛プレートから解剖されました。前述のプライマリ トロホブを特定する手順が開始されたサンプリング絨毛組織の 20 分以内 0.8 - の間ここで、降伏 1 x 10 の8の実行可能なセル。3 × 106 (3.3 cm2ごとの5セル数 10 倍) の密度で 6 ウェル培養皿の細胞を播種されました。文化の 24 h 後添付の顕微鏡下で細胞を調べたし、適切な絨...

ここで紹介は一次電池文化のよりよくの分離に続いてひと胎盤絨毛組織のサンプリングのためのプロトコルです。Tnf α と絨毛トロホブ ラストの治療肥満の子宮内環境で炎症を繰り返すし、母性的な肥満と胎盤の炎症によって調整される分子標的の探索が容易になります。

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

この栄養膜細胞培養モデルの全体的な目標は、栄養膜のクリティカルパスの調節に対する肥満関連炎症の影響を測定することです。この制御システムの主な利点は、TNFαを介した炎症と、母体肥満の文脈における胎盤の遺伝子調節との関係を確立することです。この実験システムの主な利点は、TNF-αを介した炎症と、母親の肥満の文脈における胎盤の遺伝子調節との関係を確立することです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるBailey SimonとMatt Bucherです。絨毛組織は、送達後できるだけ早く、できれば30分以内に胎盤からサンプリングする必要があります。.絨毛板を上に向けて、鉗子とハサミを使用して、胎盤の周囲から2〜3センチメートルのところにある2〜3つの全層セクションをランダムに切除します。異常に見える胎盤の部分は避けてください。絨毛膜板と基底板、および大きな血管を切り取ります。得られた絨毛組織を温かく完全な培地に置きます。絨毛組織サンプリングから30分以内に、栄養膜の分離を開始します。絨毛組織の各片を室温PBSで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、穏やかに攪拌して組織内の余分な血液を放出します。PBSをデカントし、新しいPBSと交換します。余分な血液のほとんどが除去されるまで、PBSリンスを繰り返します。PBSリンスは、ティッシュを十分にすすぐと、淡い赤またはピンクになります。絨毛組織を滅菌ペトリ皿に入れ、顕微鏡スライドを使用して血管から柔らかい絨毛組織を優しくこすり落とすことにより、できるだけ多くの血管を取り除きます。はさみを使用して、得られた絨毛組織を細かく刻みます。細かく刻んだ絨毛組織を、トリプシンとDNaseの比活性に基づいて計算された量に従って消化溶液を入れた滅菌ボトルに移します。.消化ボトルを摂氏37度の水浴中で、70rpmで35分間振とうしながらインキュベートします。35分後、消化ボトルを横に傾け、未消化の組織片をボトルの底に沈殿させます。血清学的ピペットで上清を慎重に引き上げ、沈殿した組織を避けます。上清を100ミクロンのセルストレーナーを通して、50ミリリットルの円錐管の間に均等に分配します。残りの沈殿した組織に消化溶液を加え、ボトルを摂氏37度の水浴でインキュベートすることにより、2回目の消化を開始します。最初の消化で緊張した上清の下に、チューブの底にある血清ピペットからゆっくりと分注することにより、3〜5ミリリットルの新生仔牛血清(NCS)を穏やかに重ねます。栄養膜を含む緊張した上清とNCSの間の半月板が見えるはずです。NCS上で上清を1.250倍、摂氏20度で15分間遠心分離します。得られたペレットには、最下層に赤血球が含まれ、続いて栄養膜細胞を含む白い層が含まれます。同様に、2回目と3回目の消化から上清を濾します。濾した上清の下にNCSを敷き詰め、20°Cでgの1,250倍を15分間遠心分離する。すべての上清を遠心分離し、NCSと上清層を除去したら、各ペレットを5ミリリットルの温かい完全培地に再懸濁し、懸濁液をプールします。細胞懸濁液を2本の50ミリリットル円錐管に均等に分割し、20°Cで1,250倍gで15分間遠心分離する。上清を静かに取り除き、各細胞ペレットを6ミリリットルの温かい完全な培地に再懸濁します。この手順を開始するには、トランスファーピペットを使用して細胞懸濁液を密度勾配の上にゆっくりと慎重に重ねることにより、細胞懸濁液を4つの密度勾配に均等に分割します。密度勾配を1、250倍g、摂氏20度で20分間遠心分離し、加速と減速を最小限に抑えます。これにより、沈殿した細胞の識別可能なバンドが生成されます。栄養膜細胞を含む不透明なバンドに到達するまで、密度勾配培地の最上層をゆっくりと慎重に除去します。栄養膜バンドを2本の50ミリリットルの円錐形チューブに移し、温かみのある完全な培地で満たします。チューブを3〜6回静かに反転させて混合し、摂氏20度で1、250倍のgで15分間遠心分離します。上清を取り除き、各細胞ペレットを5ミリリットルの温かい完全な培地に再懸濁します。細胞懸濁液を組み合わせ、血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞をカウントします。細胞計数後の次のステップは、細胞をプレートすることです。各6ウェルプレートにウェルあたり300万個の細胞をプレート化します。プレートを前後左右に静かに揺らして、細胞を均等に分散させます。めっきされたセルを層流ベントに約30分間放置して、セルが均一に分布し、沈殿し、ウェルの底に付着し始めるようにします。30分後、プレートを5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度のインキュベーターに置きます。培養後24時間後に栄養膜を顕微鏡で観察し、付着と適切な栄養膜の形態を確認します。細胞は、培養の24時間後に処理することができます。細胞から培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルのTNFアルファ補充培地と交換します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。TNFアルファ曝露の24時間後、TNFアルファサプリメント培地を完全な培地と交換します。さらに24時間インキュベートします。TNFアルファの除去から24時間後、培地を吸引し、室温PBSで細胞を穏やかにすすいでください。新たに添加したプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む80マイクロリットルの氷冷放射性免疫沈降アッセイバッファーを各ウェルに直接添加します。セルスクレーパーでプレートからセルを取り出します。細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、治療グループ内にウェルをプールします。チューブを高でボルテックスして、15秒の間隔を少なくとも3回空けて細胞を氷結させます。細胞を摂氏4度で15分間揺さぶりながらインキュベートします。チューブを再び高いところで渦巻きます。細胞の破片をペレット化するために、摂氏4度で5分間、10, 000倍gで遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞タンパク質サンプルを摂氏80度で保存し、目的のタンパク質をウェスタンブロッティングで分析します。培養の72時間後、初代栄養膜におけるサイトケラチン7(赤)の免疫細胞化学的分析により、細胞が多核細胞塊の存在によって証明される合胞体化を受けたことが確認されました。さらに、ビメンチンの免疫細胞化学的分析では、同じく赤色で、汚染された線維芽細胞はほとんど見つかりませんでした。核対比染色は、両方の画像で青色で示されています。ミリリットルあたり最大250ピコグラムのTNFアルファによる治療は、ルビコン発現をアップレギュレートします。TNFα濃度がミリリットルあたり250ピコグラムを超えると、ルビコンの発現レベルはベースラインに向かって減少し、さらにそれ以下まで減少しました。同様に、ルビコンは、女性胎児の肥満妊娠からの胎盤からの瞬間凍結絨毛組織生検において、リーンコントロールと比較して大幅にアップレギュレーションされます。一度習得すると、絨毛組織からの栄養膜の分離は、適切に実施されれば6〜7時間で行うことができます。この手順を試行する際は、意図的かつ効率的に作業できるように、事前に材料と試薬を準備することが重要です。この手順に続いて、細胞の生体エネルギーを測定するアッセイなどの他のアッセイを実行して、肥満の子宮内環境での炎症が栄養膜の代謝能力に影響を与えるかなどの追加の質問に答えることができますか?この開発方法により、胎盤研究者が母体環境が栄養膜機能に及ぼす影響を確立する道が開かれました。このビデオを見れば、細胞培養実験のために絨毛組織から栄養膜を単離する方法や、栄養膜の重要経路の調節におけるTNFα媒介性炎症の影響を判断する方法について、十分に理解することができます。ヒト組織、培養細胞、DMSO、アクリルアミド、還元試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、適切なPPEの着用や無菌技術の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

a-primary-human-trophoblast-model-to-study-effect-inflammation

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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