Name: 線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶ線虫Caenorhabditis elegansを用いた真菌感染モデルによる宿主微生物相互作用のin vivo解析手法。病原体の毒性因子と宿主免疫応答を研究し、感染症治療薬の創出に貢献する実験系です。

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この作品は公演され、ウースター工科大学でサポートされています。

1。 線虫成長媒体の準備 (NGM) <ol><li>1 L メディアのため寒天 20 g、2.5 g 有機窒素源 (例えば、バクト ペプトン)、および 2 L フラスコの塩化ナトリウム 3 g を組み合わせます。975 mL の滅菌水を追加します。
	<ol>滅菌攪拌棒で <li>追加。15 分の自動メディアの注ぎ口、オートクレーブ チューブとメディアを使用している場合メディアする必要がありますのオートクレーブもはや高いボリュームを作った場合</li>。
	</ol></li> <li>撹拌プレートでメディアを設定し、冷却すること。
	<ol><li>メディアが無菌 (約 60 ° C) を触ると暖かく追加 1 M MgSO 4 の 1 mL &#9679; H 2 O、1 M CaCl 2 の 1 mL、KPO 4、25 mL、1 mL のエタノールで 0.5% コレステロール</li>。
		<li>メディア (手動で、または自動ポンプ) 流の下に入れて 35 × 10 mm 滅菌シャーレ。使用する前に 1-2 日のフードの下で乾かします 。
		注: プレートは汚染防止のための 4 ° C で保存する必要があります</li>。
	</ol></li></ol> 2。ワームのピックアップを作る <ol><li>アルミ線の 1.5 cm 部分をカットします。パスツール ピペットの先端に約 0.5 cm の長さを慎重に挿入します。
	<ol><li>炎のピペットにピペット チップの元の形状を損なうことがなくワイヤを安全に付着するまでゆっくりと回転してガラス ピペット チップを溶かすブンゼン バーナー、アルコール ランプを使用しています</li>。
	</ol></li></ol> 3。大腸菌 培養の準備 <ol><li>滅菌ループを使用して、大腸菌 OP50 ルリア スープ 200 mL に 単一コロニーを接種します。37 で揺れで一晩インキュベート ° C</li>
	<li>液体培養は使用次の日の準備ができて、使用しないときは 4 ° C で保存されるかもしれない 。
	注: OP50、エシェリヒア属大腸菌 株の食物源として使用されて 線虫。この文化に使用するかもしれないいくつかの 4 に格納されているときに数ヶ月まで ° c.</li>
</ol> 4。本質的な c. の elegans メンテナンス <ol><li>プレートの中央に準備された OP50 液体培養の約 50-100 μ L をスポッティングにより NGM 寒天で 大腸菌 を作製した種子</li>。
	<li>カバー プレート、および 24 時間室温で乾燥させます。一度乾燥し、急速な成長のために夜通しの 37 ° C でプレートを配置またはより遅い成長が必要な場合、室温で維持します</li>。
	<li>プレートにワームを追加いずれか &#34;、&#34; (プロトコル手順 5 を参照してください &#34; Chunking やピッキング ワーム &#34;)、ワームを個別に選択または直接プレート ワームの卵を配置すること (プロトコル手順 6 を参照してください &#34; 卵準備 &#34;).</li>
</ol> 5。Chunking やピッキング ワーム 注: &#34;、&#34; c. の elegans の保守に共通する方法を示します。これは、ワームを含む NGM 寒天プレート部を切り、新しい板にこの作品を転送するもプロセスのワームの大規模な数を転送するために含まれます。汚染は、この方法でプレートから切り出されることがあります。ワームを選ぶときは、寒天の穴にワームを失われることが寒天の整合性を維持するために重要です。さらに、寒天を溶解またはワームを燃焼を防ぐためにプレートに触れる前に冷却するための選択をできるようにすることが重要だ。
<ol>新しいプレートの上にワームの大量を迅速に転送するために <li>は、へらを使用して選択したワームを含む NGM 寒天の部分をカットしました。カットの部分を削除し、新しいプレートの OP50 の芝生の端に顔ダウン配置します</li>。
	<li>転送プロトコル手順 8.2 で下記のとおり個別にワーム &#34; 生存分析、&#34; ワームを使用してを選択します。それが赤になるまで炎ワームでワイヤーを選択します。炎から外し、数秒間冷却します</li>。
	<li>ピックにワイヤーをカバー、新しいプレート上に成長した OP50 文化の芝生をこすり、ピックにワイヤを使用して優しく</li>。
	<li>ワイヤの先端を覆う粘性の文化により、ワームの選択のヒントに固執する、こうして優しく強打する運動を使用して選択したワームをピックアップします</li>。
	<li>選択したワームが収集され、一度は優しく文化を寒天にスワイプによって新しいプレート上に配置します。ピックに残り文化を削除する炎にワイヤを配置します</li>。
</ol> 6。卵の準備 <ol><li>ピッキングまたはチャンキング プロトコル手順 5 で説明したように約 20 大人動物 (約 20 ° C で育てられたとき、孵化後 2-3 日) に配置 &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 50 シード プレートOP50 大腸菌株の μ L.</li>
	卵を収集し、10 mL の M9 バッファーとプレートの洪水の 1-2 日後に <li>。ガラス血清ピペットを使用すると、旋回し、振とう OP50 または大人動物にこだわった卵を解放する寒天プレート上のコンテンツ。成虫と卵を含むすべての液体を収集します</li>。
	<li>15 mL の円錐形に転送 M9 と OP50 ソリューション チューブ。遠心分離機の 2,100 x g で 2 分間で 15 mL の円錐管</li>
	<li>OP50 ペレットを乱すことがなく上澄みの約 9 mL を吸引します</li>。
	<li>2 mL の滅菌水、漂白剤 1 mL と 0.25 M NaOH の 1 mL にペレットを再懸濁します</li>。
	通常、卵はそのまま残りますこの短い漂白剤治療中に、シェルのため <li>はインバージョンによるを穏やかに混合し、大人動物の大半 (およそ 70%) が分離表示されるまでです。遠心分離機の 990 x g で 2 分間で円錐管</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。M9 バッファーの 10 mL にペレットを再停止します</li>。
	<li>は、不穏なペレットなし 2 分吸引上澄みの 990 x g で円錐形の管を遠心分離機します。M9 バッファーの 200 μ L でペレットを再停止します 。
	注: 卵の準備は、複数の試験を必要があります。彼らは長すぎるため漂白剤にさらされている場合、卵を破壊可能性があります。卵は孵化しない場合、漂白剤溶液中の濃度を減少または漂白剤への露出の期間が減少します</li>。
</ol> 7。感染症板セットアップ <ol><li>YPD 滅菌試験管に 3 ~ 5 mL を省略し、カンジダ ・ アルビカンス 滅菌ループを使用して単一コロニーで接種します。
	<ol><li>30 で約 16-18 時間回転ドラムにチューブを配置 ° C</li>
	</ol></li> <li>ラベル 1 つ 1.5 mL および microfuge チューブ c. アルビカンス、および別の OP50 を含むを格納します。それぞれの空の管の重量を記録。
	<ol><li>一晩チューブに C. albicans 文化の場所 500 μ L 標識 C. albicans と一晩 OP50 文化 (ステップ 3.1) からの 1,500 μ L OP50 というラベルの付いたチューブにします</li>。
		<li>G. 吸引清不穏なペレットなし x 16,100 で 10 分間遠心します</li>。
		<li>は再 500 μ L の滅菌水でペレットを中断します。16,100 x g. で 5 分間遠心</li>
		<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。Microfuge の管の最終的な重量を記録します</li>。<li>最終的な重量から microfuge の管の初期の重量を差し引くことによって各ペレットの重量を決定します</li>。
	</ol></li> <li>10 mg/ml、C. albicans ペレットと 200 mg/ml OP50 ペレット再中断 滅菌水を使用しています。ストレプトマイシンの 50 mg/mL の溶液を 10 μ l 添加、OP50 文化の 2.5 μ L、c. アルビカンス 文化の 0.5 μ L 7 μ L の滅菌水を組み合わせることによりミックス マスター感染を作る。
	<ol><li>制御板、C. albicans 文化のボリュームを滅菌水に置き換えることによりマスター ミックスを作成します。感染症のミックスやマイクロ ピペットを使用して NGM センター プレートに OP50 制御ソリューションの 20 μ L をシードします 。
		注: 分析中に統計的有意性を決定する約 100 のワームが必要です。この試金は 3 通で通常実行されます。したがって、感染ミックス x 3.2 と同様、制御ソリューション x 3.2 が行われます。これらのミックスは、完全 20 μ L のシードは、各プレート、エラーのための部屋を許可することを確保するため元 × 3 強に作られています。C. アルビカンス を消費する (L1 L3) 初期幼虫段階でワームの咽頭が小さすぎるために、このマスター ミックスが作成されます。フルコナゾール ( 図 3 b) などの薬剤への暴露, エージェントは感染症混合物に導入します。剤の濃度を経験的に決まります。たとえば、 図 3 b、50 μ M のフルコナゾールを表され、0、12.5、25、50、100 μ M フルコナゾールもいたが同じプロトコルを使用してテストします</li>。
	</ol></li></ol> 8。肛門領域の変形 (Dar) 表現型と生存の試金の分析 <ol><li>視覚化 Dar 表現型 注: L3 期とそれ以降に最適ダルな可視化します。Dar は、時間の経過とともに顕著となる ( 図 2 a)、ワームのポスト肛門領域に小さな突起として提示します。
	<ol><li>動物解剖顕微鏡のステージ上プレートをすばやくタップして Dar; Dar と動物がどちらかの必要になりますすぐに後方移動 Dar はなく動物を持っている場合確認繰り返し逆方向、または彼らにタップのラウンド全然しません</li>。
	</ol></li> <li>生存分析 <ol><li>プロトコル手順 6 で前述したように完全な卵の準備 &#34; 卵の準備 &#34;。郭清範囲の下で卵をカウントし、μ L あたり約 5-6 健康的な卵の濃度を達成するまでに M9 と卵ソリューションを希釈します。20 μ L の試料を細菌の培養とプレートの側面間の領域の準備の NGM プレート約 30 卵を分配、ピペットを使用して (卵とワームは、食品、OP50、2 つの個別の点では) です</li>。
		<li>48 h の 20 ° C に加温プレート。解剖顕微鏡の下で、各プレート上のライブと死んでいる大人のワームの数だけでなく、ダルでワームの数をカウントします。Dar と % を記録します</li>。
		<li>アルミ線またはプレートで軽くたたくことによって頭を叩かれてに応答しない場合に死んだ動物を考慮します</li>。
		<li>毎日、転送残り成虫ピッキングによってプロトコル手順 5 で説明したよう &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 新しい感染症やコントロール プレートに。この時点で、必要な場合は毎日ライブ、死者および行方不明の虫の数を追跡することによって生存分析を実行します 。
		注: このアッセイを卵の準備を始めて 2 週間、実行可能性があります。さらに、卵ソリューション ソリューションは、OP50 を殺すことができる漂白剤の痕跡を含む場合がありますので、細菌培養には調剤していないします。ソリューション必要があります卵寒天プレートの側面の間に挟まったように、プレートの端から約 0.5 cm を調剤します。さらに、ワームの急速な普及、により転送新しいプレートの上に大人は彼らの子孫とは異なる重要な</li>。
	</ol></li> <li>分析生存 <ol><li>生存曲線の解析ソフトウェアを用いた結果の分析 (資料の一覧を参照してください).</li>
		<li>比較生存曲線 Grehan ・ ブレスロウ Wilcoxon メソッドを使用して (初期の生存期間からデータが後の時代よりも正確、重量データに応じて) だけでなく、各統計ツール 45 。
		注: たとえば、 図 4 b に -C、同質遺伝子野生型コントロールや complementarystrains で治療にワーム変異体 C. albicans で治療の生存率を比較します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

別の病原体をテストするためについてはC. albicansに一生さらされる線虫感染症や生存を試金する方法を変更できます。別の細菌または菌の液体培養したし、同様の方法でc. の elegansを供給します。シリアルの感染可能性がありますさらに、試金する前述のように、まず 1 つの病原体に幼虫を公開し、成人期に達した後別の病原体を含む新しいプレート上に動物を移すことによって。
このアッセイを行いながらタイミングに細心の注意を払うことが重要です。まず、試金のための卵を収穫するために卵の準備を完了したときは、卵が漂白剤にさらされている時間の量を制限する重要です。卵を解放する漂白剤溶液で大人を溶解するために必要な時間が異なります。漂白剤溶液を管理するには、直後には、worm ソリューションを解剖顕微鏡の下で注意深く監視されなければなりません。ワームの約 70% が崩壊した後、ソリューションは遠心分離にする必要があります。卵の準備に実行可能な卵が得られない場合は、漂白剤の濃度または漂白剤への暴露の期間を減らします。この試金を完了するために重...

線虫は、50 年以上の強力なモデル有機体として使用されています。1960 年代、南アフリカ共和国の生物学者、シドニー ・ ブレナーは、線虫の細胞および動物の生物学の様々 な面を調査する科学者たちの長い系統の道を舗装神経の開発、研究にc. の elegansの使用を開拓しました。この系譜は、ノーベル賞受賞者クレイグ ・ メローとの RNAi の仕事1のアンドリュー ・ ファイアー、ロバート ・ ホロビッツ、ジョン ・ サルストン器官形成およびアポトーシス2,3,4、自分の仕事のため、マーティン ・ チャルフィー緑色蛍光タンパク質5彼の仕事。研究者が緑膿菌を含む様々 な人間の病原体の生物学を調査するためにc. の elegansを使用し始めているこのモデル有機体は、伝統的に過去の 15 年にわたって分子発生学を研究に使用されていますが緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、セラチア6,7,8,9,10。これらの研究は人間-病原体相互作用に関与するメカニズムの多くが保存されます明らかに線虫がまたこのモデル生物11,12に固有いくつかの免疫機構があります。自然の中でc. の elegansさまざまな土で現在の摂取された病原体からの脅威、これが進化し、腸管内の洗練された自然免疫系を維持する強力な選択圧を提供しています。遺伝子や腸管の保護に関与するメカニズムの多くが高い哺乳類11,13にも存在する非常に節約される要素によって調整されます。線虫は、したがって14サルモネラ、赤痢菌 boydii15、またはコレラ16のような消化管病原体を研究する素晴らしいモデルを表します。
ここで我々 は線虫のc. アルビカンスなど感染性病原体を研究するモデルのホストとしての驚くべき多様性を強調表示します。線虫モデルのホストとしては安価でカンジダ症42の研究に用いられるマウスのモデルよりも時間のかかる病原性の高スループット スクリーニングが可能です。
本研究では、このモデルと厚板の生存分析確実に使えるホスト生得免疫エフェクター ドライブの病原性病原体の決定要因、感染症に対抗する重要な留学を紹介し、薬理学的化合物のことができます。病因に介入します。前述の試金に異なる、このメソッドは、成人だけではなく、成人期、幼虫期から死43,44動物の生涯にわたって病原体への暴露を勉強するための手段を提供します。要約すると、我々 はc. の elegans - C. albicansモデルは、ドライブの感染・免疫遺伝的基盤を研究するだけでなく、治療的介入のための新しい化合物を識別するためにも使用できる汎用性と強力なツールです。

<table><tbody><tr><td>寒天(粒状、細菌学グレード)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウムワイヤー(95% Pt、32ゲージ)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss 倒立顕微鏡</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>CaenorhabditisGenetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール シグマグレード 99%以上</td><td>シグマ</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル培養チューブ (20 x 150 mm)</td><td>ブランド</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡 (NI-150 高輝度イルミネーター)</td><td>ニコンインスツルメント株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>野生型 C. アルビカンス SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>野生型 C. elegans</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なin vivoモデル

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

モデルのホストとして線虫を使用して微生物の相互作用を研究する手法を示す.微生物は、腸疾患の主な場所を作る食事を介して紹介しています。線虫の腸管構造的、機能的哺乳類の腸を模倣し、透明な植民地化の微視的研究に従うことです。病原体が病気や死を引き起こす可能性ことを示します。我々 は変更された病原性を示す微生物の突然変異を識別することができます。生物的ストレスに保存された生得的な応答は、宿主自然免疫の面を調査する優秀なシステムを線虫になります。デュアル酸化酵素遺伝子の変異を持つホスト反応酸素種を作り出すことができないし、微生物の侮辱に抵抗することができないことを示す.さらにそれが微生物の増殖阻害剤の効果を研究する使用することができますを示すにより提示された生存分析の汎用性を示します。この試金を使用して、さらに宿主微生物間相互作用を明らかにする機会を提供すると同様、新規抗真菌薬の開発のためのターゲットとして真菌病原因子を発見するも可能性があります。この試金のデザインによく適して高スループット全ゲノム スクリーン、将来使用するための低温保持するワームに能力になりますが勉強するコスト効果の高い魅力的な全体の動物モデル。

C. アルビカンスと線虫を使用して病因分析 (図 1) は、私たちラボ17,18して他ラボ19,20以前記載されています。線虫を使用してC. albicans細胞ワームがすぐに摂取が遅い歩行を引き起こす腸の内腔に蓄積されることを示すc. アルビカンスの病原性を研究するを示す変形アナル地域 (Dar) (図 2 a) は、(図 2 b) 外陰部の腫れ、膨満腸 (図 3 a) の致死率 (<strong class="x...

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト モデルとして線虫線虫を紹介します。

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

このアッセイの全体的な目標は、モデル生物C.Elegansにおける真菌感染の影響を観察することです。この方法は、病原体の病原性因子、宿主免疫エフェクター、創薬など、感染症の分野における主要なメカニズムの質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、宿主と病原体の相互作用を両方の観点から研究するための実験的に扱いやすいシステムであることです。これは、高速で、簡単で、費用対効果の高いシステムです。この特定の方法は、真菌病原体に関する洞察を提供することができますが、細菌や複数の生物などの他の感染性病原体にも適用して、生きた宿主の微生物相互作用を研究することもできます。ワームピックを作るには、1.5センチメートルのアルミニウムワイヤーをカットし、パスツールピペットの先端に約0.5センチメートルのワイヤーを慎重に挿入します。ブンゼンバーナーまたはアルコールランプを使用して、ピペットチップの元の形状を損なうことなく、ワイヤーがピペットにしっかりと接着されるまで、炎の中でガラスピペットチップをゆっくりと回転させて溶かします。最後に、鉗子を使用して、ワイヤーの端を慎重に曲げて小さなループを作成します。大量のワームを新しいプレートにすばやく移すには、選択したワームを含むNGM寒天をスパチュラで切断します。次に、カットピースを取り外し、新しいプレート上のOP50のパッチの端に伏せて置きます。ワームを個別に移すには、ワームピックでワイヤーを赤くなるまで炎にかけ、炎から取り出して数秒間冷まします。ピックのワイヤーを使用して、新しいプレートで成長したOP50培養物のパッチをそっとこすり、ピックのワイヤーを覆います。ワイヤーの先端を覆う粘性のある培養物は、ワームをピットの先端にくっつけます。したがって、スワイプ動作を使用して、選択したワームをそっと拾います。選択したワームが集まったら、寒天上で培養物を静かにスワイプして、新しいプレートに置きます。次に、ワイヤーを炎の中に入れて、ピックに残っている培養物を取り除きます。約20匹の成体動物を摘み取るか、50マイクロリットルの大腸菌OP50株を載せたプレートに重ねて置きます。1〜2日後に卵を集めるには、プレートに10ミリリットルのM9バッファーを浸します。次に、ガラス血清ピペットを使用して、寒天プレート上の内容物を渦巻き、穏やかに攪拌して、OP50に付着した成体動物または卵を放出します。卵と成虫を含むすべての液体を集めます。M9およびOP50溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。チューブを2,100 x gで2分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さずに約9ミリリットルの上清を吸引します。次に、2ミリリットルの滅菌水、1ミリリットルの漂白剤、1ミリリットルの0.25モルの水酸化ナトリウムを使用して、ペレットを再懸濁します。成体動物の約70%が溶解したように見えるまで、反転して穏やかに混合します。通常、卵は殻があるため、この短い漂白剤処理中も無傷のままです。このステップでは、漂白剤への曝露量を制限することが重要です。漂白剤に長時間さらされると、卵が破壊されます。卵の準備が失敗した場合は、漂白剤への曝露時間を制限するか、溶液を希釈してください。コニカルチューブを990 x gで2分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を吸引します。次に、ペレットを10ミリリットルのM9バッファーに再懸濁します。再度回転させ、ペレットを乱さずに上清を除去した後、200マイクロリットルのM9バッファーを使用してペレットを再懸濁します。3〜5ミリリットルのYPDを滅菌試験管に分注し、滅菌ループを使用してカンジダアルビカンスの単一のコロニーを接種します。チューブを摂氏30度の回転ドラムに約16〜18時間置きます。1.5ミリリットルのマイクロチューブにC.albicansを封じ込め、もう1本にOP50を封じ込めてラベルを貼り、空のチューブの重量を記録します。500マイクロリットルの一晩のC.albicans培養物をC.Albicansとラベル付けされたチューブに移します。そして、OP50とラベル付けされたチューブにOP50を一晩培養する1500マイクロリットル。チューブを16,100 x gで10分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を吸引します。500マイクロリットルの滅菌水を使用して、各ペレットを再懸濁します。次に、チューブを16,100 x gで5分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を吸引します。次に、マイクロフュージチューブの最終重量を記録します。最終重量からマイクロフュージチューブの初期重量を差し引いて、各ペレットの重量を決定します。滅菌水を使用して、C.albicansペレットを10ミリグラム/ミリリットルに、OP50ペレットを20ミリグラム/ミリリットルに再懸濁します。次に、ストレプトマイシンの50ミリグラム/ミリリットル溶液を10マイクロリットル、OP50培養液2.5マイクロリットル、C.Albicans培養液0.5マイクロリットル、滅菌水7マイクロリットルを組み合わせて、マスター感染ミックスを調製します。コントロールプレートの場合は、C.albicans培養液の量を滅菌水に置き換えてマスターミックスを作成します。次に、マイクロピペットを使用して、20マイクロリットルの感染ミックスまたはOP50制御溶液をNGMプレートの中央に播種します。このビデオの前半で示したように卵を準備した後、解剖スコープの下で卵を数えます。そして、M9を使用して卵液を希釈し、マイクロリットルあたり約5〜6個の健康な卵の濃度が達成されます。ピペットを使用して、約30個の卵を含む20マイクロリットルのサンプルを、細菌培養物とプレートの側面の間の領域に調製したNGMプレートに分注します。プレートを摂氏20度で48時間インキュベートします。次に、解剖顕微鏡下で、各プレート上の生きた成虫と死んだ成虫の数を数えます。アルミニウムワイヤーで頭を叩いたり、プレートを叩いたりしても反応しない場合は、動物が死んだと考えます。また、Darを持つ線虫の数を数え、動物がDarを持っているかどうかは、解剖顕微鏡のステージ上のプレートをすばやくタップして確認します。ダールを持たない動物はすぐに後退しますが、ダールを持つ動物は方向を逆にするために何度もタップする必要があるか、まったくタップしません。1日おきに、残っている成虫を新しい感染プレートまたはコントロールプレートに移します。この時点で、必要に応じて、毎日生きている線虫、死んでいる線虫、行方不明の線虫の数を追跡して、生存アッセイを行います。少なくとも1日おきにワームを移すことが重要です。これにより、このアッセイで採点される成虫が子孫で混同されることがなくなります。C.elegansは6日間にわたってC.albicansに曝露され、感染の兆候、疾患の進行、および死亡について観察されました。Darの表現型は、感染していない動物には見えない突出した肛門領域によって指摘されるように、生存アッセイの4日目までに最も顕著になります。C.albicansに感染した線虫は、外陰部に腫脹を示すことも知られています。どちらの場合も、ワームはこの段階に達した後、感染を取り除くことができません。腸管腔におけるC.albicansのコロニー形成を視覚化するために、RFPでタグ付けされた野生型C.albicansを線虫に与えました。これにより、コロニー形成領域が赤色に蛍光を発します。C.albicansは、アッセイの3日目までに腸管腔にコロニーを形成します。ここに示すように、感染した線虫は、感染していない対照群で観察されたよりも重度の腸内膨満を示しました。この実験では、猛毒のC.Albicansのefg1/efg1 cph1/cph1二重変異体によって引き起こされる感染を生き延びる線虫の能力がテストされました。二重変異体に感染した線虫は、対照群よりも統計的に有意に長生きします。これらの2つの遺伝子は、C.albicansのC.Elegansに対する病原性に必要であることを示唆しています。一度習得すると、このテクニックの各部分は、ワームの寿命の毎日1〜2時間で行うことができます。この手順を試みる際には、感染性病原体を使用している可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、適切なバイオセーフティ予防策を実践する必要があります。この基本的な手順には、生きた宿主の状況での微生物相互作用を研究するために追加の微生物剤を導入するなど、わずかな変更を加えることができます。この技術は、その開発後、感染症分野の研究者が微生物の病原性、宿主の自然免疫応答のメカニズム、および新規抗菌剤の発見を探求する道を開きました。このビデオを見れば、C.Elegansの維持と操作の方法、および生物を使用して分子レベルで宿主微生物の相互作用を研究する方法について十分に理解できるはずです。アジ化ナトリウムなどの微生物病原体や化学試薬を扱うことは危険であり、PPEや廃棄物処理方法などの適切な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

線虫を維持し、伝播の容易さ...

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線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫...

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

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SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。...

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

学ぶ線虫Caenorhabditis elegansを用いた真菌感染モデルによる宿主微生物相互作用のin vivo解析手法。病原体の毒性因子と宿主免疫応答を研究し、感染症治療薬の創出に貢献する実験系です。

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

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