線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

このアッセイの全体的な目標は、モデル生物C.Elegansにおける真菌感染の影響を観察することです。この方法は、病原体の病原性因子、宿主免疫エフェクター、創薬など、感染症の分野における主要なメカニズムの質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、宿主と病原体の相互作用を両方の観点から研究するための実験的に扱いやすいシステムであることです。

これは、高速で、簡単で、費用対効果の高いシステムです。この特定の方法は、真菌病原体に関する洞察を提供することができますが、細菌や複数の生物などの他の感染性病原体にも適用して、生きた宿主の微生物相互作用を研究することもできます。ワームピックを作るには、1.5センチメートルのアルミニウムワイヤーをカットし、パスツールピペットの先端に約0.5センチメートルのワイヤーを慎重に挿入します。

ブンゼンバーナーまたはアルコールランプを使用して、ピペットチップの元の形状を損なうことなく、ワイヤーがピペットにしっかりと接着されるまで、炎の中でガラスピペットチップをゆっくりと回転させて溶かします。最後に、鉗子を使用して、ワイヤーの端を慎重に曲げて小さなループを作成します。大量のワームを新しいプレートにすばやく移すには、選択したワームを含むNGM寒天をスパチュラで切断します。

次に、カットピースを取り外し、新しいプレート上のOP50のパッチの端に伏せて置きます。ワームを個別に移すには、ワームピックでワイヤーを赤くなるまで炎にかけ、炎から取り出して数秒間冷まします。ピックのワイヤーを使用して、新しいプレートで成長したOP50培養物のパッチをそっとこすり、ピックのワイヤーを覆います。

ワイヤーの先端を覆う粘性のある培養物は、ワームをピットの先端にくっつけます。したがって、スワイプ動作を使用して、選択したワームをそっと拾います。選択したワームが集まったら、寒天上で培養物を静かにスワイプして、新しいプレートに置きます。

次に、ワイヤーを炎の中に入れて、ピックに残っている培養物を取り除きます。約20匹の成体動物を摘み取るか、50マイクロリットルの大腸菌OP50株を載せたプレートに重ねて置きます。1〜2日後に卵を集めるには、プレートに10ミリリットルのM9バッファーを浸します。

次に、ガラス血清ピペットを使用して、寒天プレート上の内容物を渦巻き、穏やかに攪拌して、OP50に付着した成体動物または卵を放出します。卵と成虫を含むすべての液体を集めます。M9およびOP50溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。

チューブを2,100 x gで2分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さずに約9ミリリットルの上清を吸引します。次に、2ミリリットルの滅菌水、1ミリリットルの漂白剤、1ミリリットルの0.25モルの水酸化ナトリウムを使用して、ペレットを再懸濁します。

成体動物の約70%が溶解したように見えるまで、反転して穏やかに混合します。通常、卵は殻があるため、この短い漂白剤処理中も無傷のままです。このステップでは、漂白剤への曝露量を制限することが重要です。

漂白剤に長時間さらされると、卵が破壊されます。卵の準備が失敗した場合は、漂白剤への曝露時間を制限するか、溶液を希釈してください。コニカルチューブを990 x gで2分間遠心分離します。

ペレットを乱さずに上清を吸引します。次に、ペレットを10ミリリットルのM9バッファーに再懸濁します。再度回転させ、ペレットを乱さずに上清を除去した後、200マイクロリットルのM9バッファーを使用してペレットを再懸濁します。

3〜5ミリリットルのYPDを滅菌試験管に分注し、滅菌ループを使用してカンジダアルビカンスの単一のコロニーを接種します。チューブを摂氏30度の回転ドラムに約16〜18時間置きます。1.5ミリリットルのマイクロチューブにC.albicansを封じ込め、もう1本にOP50を封じ込めてラベルを貼り、空のチューブの重量を記録します。

500マイクロリットルの一晩のC.albicans培養物をC.Albicansとラベル付けされたチューブに移します。そして、OP50とラベル付けされたチューブにOP50を一晩培養する1500マイクロリットル。チューブを16,100 x gで10分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を吸引します。

500マイクロリットルの滅菌水を使用して、各ペレットを再懸濁します。次に、チューブを16,100 x gで5分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上清を吸引します。

次に、マイクロフュージチューブの最終重量を記録します。最終重量からマイクロフュージチューブの初期重量を差し引いて、各ペレットの重量を決定します。滅菌水を使用して、C.albicansペレットを10ミリグラム/ミリリットルに、OP50ペレットを20ミリグラム/ミリリットルに再懸濁します。

次に、ストレプトマイシンの50ミリグラム/ミリリットル溶液を10マイクロリットル、OP50培養液2.5マイクロリットル、C.Albicans培養液0.5マイクロリットル、滅菌水7マイクロリットルを組み合わせて、マスター感染ミックスを調製します。

コントロールプレートの場合は、C.albicans培養液の量を滅菌水に置き換えてマスターミックスを作成します。次に、マイクロピペットを使用して、20マイクロリットルの感染ミックスまたはOP50制御溶液をNGMプレートの中央に播種します。このビデオの前半で示したように卵を準備した後、解剖スコープの下で卵を数えます。

そして、M9を使用して卵液を希釈し、マイクロリットルあたり約5〜6個の健康な卵の濃度が達成されます。ピペットを使用して、約30個の卵を含む20マイクロリットルのサンプルを、細菌培養物とプレートの側面の間の領域に調製したNGMプレートに分注します。プレートを摂氏20度で48時間インキュベートします。

次に、解剖顕微鏡下で、各プレート上の生きた成虫と死んだ成虫の数を数えます。アルミニウムワイヤーで頭を叩いたり、プレートを叩いたりしても反応しない場合は、動物が死んだと考えます。また、Darを持つ線虫の数を数え、動物がDarを持っているかどうかは、解剖顕微鏡のステージ上のプレートをすばやくタップして確認します。

ダールを持たない動物はすぐに後退しますが、ダールを持つ動物は方向を逆にするために何度もタップする必要があるか、まったくタップしません。1日おきに、残っている成虫を新しい感染プレートまたはコントロールプレートに移します。この時点で、必要に応じて、毎日生きている線虫、死んでいる線虫、行方不明の線虫の数を追跡して、生存アッセイを行います。

少なくとも1日おきにワームを移すことが重要です。これにより、このアッセイで採点される成虫が子孫で混同されることがなくなります。C.elegansは6日間にわたってC.albicansに曝露され、感染の兆候、疾患の進行、および死亡について観察されました。

Darの表現型は、感染していない動物には見えない突出した肛門領域によって指摘されるように、生存アッセイの4日目までに最も顕著になります。C.albicansに感染した線虫は、外陰部に腫脹を示すことも知られています。どちらの場合も、ワームはこの段階に達した後、感染を取り除くことができません。

腸管腔におけるC.albicansのコロニー形成を視覚化するために、RFPでタグ付けされた野生型C.albicansを線虫に与えました。これにより、コロニー形成領域が赤色に蛍光を発します。C.albicansは、アッセイの3日目までに腸管腔にコロニーを形成します。ここに示すように、感染した線虫は、感染していない対照群で観察されたよりも重度の腸内膨満を示しました。

この実験では、猛毒のC.Albicansのefg1/efg1 cph1/cph1二重変異体によって引き起こされる感染を生き延びる線虫の能力がテストされました。二重変異体に感染した線虫は、対照群よりも統計的に有意に長生きします。これらの2つの遺伝子は、C.albicansのC.Elegansに対する病原性に必要であることを示唆しています。

一度習得すると、このテクニックの各部分は、ワームの寿命の毎日1〜2時間で行うことができます。この手順を試みる際には、感染性病原体を使用している可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、適切なバイオセーフティ予防策を実践する必要があります。

この基本的な手順には、生きた宿主の状況での微生物相互作用を研究するために追加の微生物剤を導入するなど、わずかな変更を加えることができます。この技術は、その開発後、感染症分野の研究者が微生物の病原性、宿主の自然免疫応答のメカニズム、および新規抗菌剤の発見を探求する道を開きました。このビデオを見れば、C.Elegansの維持と操作の方法、および生物を使用して分子レベルで宿主微生物の相互作用を研究する方法について十分に理解できるはずです。

アジ化ナトリウムなどの微生物病原体や化学試薬を扱うことは危険であり、PPEや廃棄物処理方法などの適切な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。