作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

この手順の全体的な目標は、ポリ乳酸、コグリコール酸、エレクトロスピニング繊維を、さまざまな量の抗ウイルスタンパク質グリフィシンで製造し、表面修飾することです。この方法は、HIV-1などの性感染症ウイルス感染を予防できる新しい送達手段をどのように策定し、特性評価するかなど、ドラッグデリバリー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高分子エレクトロスピニング繊維を繊維表面上の高度に局在するグリフィシンの固定足場として使用することにより、グリフィシンの抗ウイルス活性が最大化されることです。

この技術の意味は、グリフィシンのさまざまな感染タイプに対する強力な予防的および治療的可能性のために、他のウイルスおよび細菌感染症の治療にまで及びます。この方法は、HIV-1感染の予防に関する洞察を得ることができますが、グリフィシンが効力を示した他のウイルス感染症や細菌感染症など、他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、720ミリグラムの50/50 PLGAを10ミリリットルのシンチレーションバイルに計量します。

血清学的ガラスピペットを使用して、3.0ミリリットルのHFIPを追加します。下品な部分をプラスチックフィルムで覆います。次に、厄介な塊を測定して記録します。

ポリマー懸濁液を摂氏37度で一晩インキュベートし、ポリマーが完全に溶解することを確認します。この後、テキストプロトコルに概説されているようにエレクトロスピニング装置を準備します。3ミリリットルのシリンジを使用してポリマー溶液を吸引します。

次に、鈍い18ゲージの0.5インチの針先をシリンジに接続します。余分な溶液を分注して、針の空のヘッドスペースを取り除きます。シリンジをシリンジポンプに置き、機器の流量を毎時2.0ミリリットルに設定します。

電源をシリンジ針に接続します。正の27キロボルトの電圧を使用してポリマー溶液をエレクトロスピンします。溶液全体をエレクトロスピニングした後、電源を切ります。

マンドリルをさらに30分間回転させて、溶媒を完全に蒸発させます。次に、回転するマンドリルコレクターの電源を切ります。かみそりの刃を使用して、マンドリルから繊維をそっと剥がします。

エレクトロスピニングされたPLGAファイバーをラベル付きのペトリ皿に集めます。ディッシュをデシケーターに一晩置いて、残留溶剤を取り除きます。まず、テキスト プロトコルで説明されているように、PBS ソリューションと MES ソリューションを準備します。

次に、EDCとNHSを冷凍庫から取り出します。室温に平衡化するためにそれらを休ませてください。この後、4ミリグラムのEDCを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに秤量します。

6ミリグラムのNHSを別のマイクロ遠心チューブに計量します。各チューブに1ミリリットルのMESバッファーを追加します。両方のチューブを激しくボルテックスして、試薬が完全に溶解していることを確認します。

次に、70ミリグラムのヒドロキシルアミンを50ミリリットルの円錐形遠心チューブに秤量します。20ミリリットルのPBSを加え、渦巻きます。適量のPLGA繊維を15ミリリットルの円錐形遠心分離管に塊にします。

8ミリリットルのMESバッファーをファイバーに追加します。次に、EDCとNHSの両方の溶液を1ミリリットル追加します。プラスチックフィルムを使用して、15ミリリットルの円錐形遠心分離管をシールします。

チューブをローテーターに置き、溶液を室温で15分間穏やかに反転させます。この後、反応を急冷するために14マイクロリットルのβ-メルカプトエタノールを加えます。チューブを数回反転させて、完全に混合されるようにします。

上清を捨て、洗濯ごとに10ミリリットルのPBSを使用してPLGA繊維を2回すすぎます。テキストプロトコルに概説されているように、適切な量のGRFTストック溶液をチューブに加えます。次に、十分なPBSを追加して、最終的な容量を8ミリリットルにします。

チューブを閉じて反転させ、完全に混合します。チューブをプラスチックフィルムで密封します。チューブをローテーターに置き、溶液を2時間静かに反転させます。

この後、調製したヒドロキシルアミン溶液を2ミリリットル加え、30秒間ボルテックスして反応を急冷します。上清を捨てます。表面改質PLGA繊維を10ミリリットルの超純水で2回すすぎ、洗濯のたびにボルテックスします。

次に、洗った繊維をシャーレに移します。繊維が完全に乾くまで、ペトリ皿をデシケーターの中に入れます。次に、ペトリ皿を摂氏4度で保管します。

まず、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを3本セットします。それぞれに2ミリグラムの繊維をまぶします。次に、各チューブに1ミリリットルのDMSOを追加します。

室温で1分間ボルテックスして、繊維を完全に溶解します。この後、10 マイクロリットルのアリコートを TE バッファーで少なくとも 100 倍に希釈します。摂氏マイナス20度で保管し、Elizaで特性評価をロードします。

5〜10ミリグラムの表面改質繊維を計量し、マイクロ遠心チューブに移します。各チューブに配置された繊維の質量を記録します。次に、各サンプルの生理学的環境を模倣した溶液を1ミリリットル加えます。

回転するシェーカーでサンプルを200 RPMおよび37°Cで1時間インキュベートします。この後、脱着したGRFTを含む溶液を約1ミリリットル取り出し、クラスターチューブに分注します。タンパク質定量を行う準備ができるまで、摂氏マイナス20度で保存してください。

次に、サンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移します。1ミリリットルの新鮮な緩衝液を加え、テキストプロトコルで概説されているように、次の時点までインキュベートします。本研究では、PLGAエレクトロスピニングファイバーの作製条件について検討します。

ブランク、0.05ナノモル、0.5ナノモル、および5ナノモルのGRFT繊維のSEM分析は、GRFT修飾が繊維形態に影響を与えないことを示しています。すべての地層の平均直径は約1.9ミクロンとほぼ同じであることが見られ、バッチ間での改変製造プロセスの一貫性を示しています。次に、エレクトロスピニングファイバーに結合するGRFTの量が決定されます。

5ナノモルの修飾には373ナノグラムのGRFTが含まれており、0.5と0.05の修飾にはそれぞれ165と42のGRFTが含まれています。これは、理論上の表面改質密度が高いファイバーが結合すると、ファイバーに結合するGRFTが増えることを示しています。ただし、結果として得られる共役効率には逆相関が見られます。

次に、繊維に共有結合したGRFTの量を評価します。最初の4時間以内に、5ナノモル、0.5ナノモル、0.05ナノモルの理論修飾濃度で、エレクトロスピニングファイバー1ミリグラムあたり113ナノグラム、25ナノグラム、10ナノグラムのGRFTがそれぞれ検出されます。4時間後、3つの製剤すべての放出溶出中に無視できるGRFTが検出されます。

このデータは、GRFTの大部分がエレクトロスピニングファイバーに共有結合しており、表面に吸収されたGRFTが最初の4時間以内に放出されることを示しています。一度習得すれば、このテクニックは約4日で完了します。ポリマー繊維の足場をエレクトロスピニングするには、ポリマー溶液の調製とエレクトロスピニングに2日かかります。

一方、表面改質、その後の乾燥、繊維の特性評価には、少なくとも2日の追加が必要でした。この手順を試行する際には、最適な修飾を確実にするために、試薬の適切な比率を維持することを覚えておくことが重要です。さらに、適切な繊維形態を確保するために、エレクトスピニングパラメータが正しいことを確認することも重要です。

その開発後、この技術は、薬物送達の分野の研究者が、繊維内に抗ウイルス剤をカプセル化するだけでなく、繊維表面を通じて活性剤を結合する能力を持つエレクトロスピニング繊維を製造する道を開きました。このビデオを見れば、高分子繊維をエレクトロスピンする方法、抗ウイルスタンパク質Griffithsinによる繊維の表面修飾を行う方法、および繊維に結合した定性的Griffithsinの方法をよく理解できるはずです。HFIP、β-メルカプトエタノール、EDC、NHSなどの試薬の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。

この手順を実行する際には、PPEの適切な適用や化学薬品のヒュームフードの使用などの予防措置を常に講じる必要があります。