Name: 培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ 培養破骨細胞における天然ウランの影響評価法。RAW 264.7細胞を用いて生存率・分化・機能を解析し、骨代謝への環境毒性メカニズムを解明する新たなスクリーニングツールを提供します。

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著者は、役に立つのテクニカル サポートにシャンタル Cro を感謝したいです。 この研究はからの補助金によって賄われていた、「兵站 à l'Energie Atomique et aux エネルギー代替"(URANOs - プログラム トランスバーサル ・ デ ・ Toxicologie ・ デュ ・ CEA と CPRR CEA アレバ)、ANR から (ウランの毒性: バイオミネラリゼーション マルチレベルのアプローチ骨、ANR-16-CE34-0003 で処理)。この作品は、CNRS ニース ・ ソフィア ・ アンティポリ大学によっても支えられました。

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</ol>

著者がある何も開示するには

我々 の知る限り、これは天然ウランの骨細胞に及ぼす影響を研究することを目指して詳細な手順が記載されている最初の時間です。この方法は骨生理学へのウランの影響のより良い理解を達成するために役に立つでしょう、ウランのキレート剤のスクリーニングのため興味深い新しいツールを提供することがあります。さらに、ここで説明されているプロトコル可能性があります osteoclatogenesis に他の重金属の影響の研究に適用することと考えています。
そのウラニルは文化メディア18,19,20,21無機・有機成分との複合体といわれます。これらの複合体形成ウランと、このようにして、その細胞毒性の種分化に影響を与えます。このため、プロトコルの重要なステップは、ウラン含有培地の準備です。私たちは以前23ウラ...

ウランは天然に存在する放射性元素の土壌、空気、水の存在など、動物と人間は彼らの食事療法の自然なウランに公開されます。自然な源に加えてウランは環境の豊かさを高める人為的活動から起きる。ウランは化学と放射線の危険を引き起こします。ただしの場合 (これは同位体混合物含む 99.27 238U、0.72 235U、0.006 234U) 天然ウランは低特定活動 (25.103 Bq.g-1) があるのでその健康への影響に起因して、化学的毒性。
何その侵入経路 (吸入、摂取、または皮膚暴露)、ほとんど糞便と体内に侵入が排除されウランの小さい部分だけ全身循環に達する。血液中のウランの約 67% が腎臓によってフィルター処理順番と 24 h1尿中に肉体を離れます。残りは腎臓や骨、ウランの毒性2,3,4の 2 つの主なターゲット器官ほとんど堆積されています。探索するいくつかの研究が行われているスケルトンは、ウラン長期保持2,3,4,5,6のプライマリ サイトとして識別されている、ので、骨生理学7におよぼすウラン
骨は、その生涯を通じて継続的に改造は石灰化組織です。骨を改造する専門にされた細胞のタイプに依存し、ほとんどの 2 つのフェーズで構成されています複雑なプロセスである: 骨芽細胞による de novo 骨建設続いて既存の古い行列破骨細胞と骨吸収。破骨細胞は、8を骨に接続する吸収サイトに移行する原産の造血前駆細胞の融合から生じる大きな多核細胞です。愛着は、その骨格9の広汎な再編成と同時に発生します。この再編がセルとハイドロキシアパ タイトとの分解に関与するプロテアーゼの解散につながる陽子を分泌する破骨細胞を骨表面の間の分離されたコンパートメントの確立のために必要な有機マトリックス。結果として得られる劣化製品は貪食、骨表面の反対側膜領域にセルを経由、分泌、トランスサイトーシス10,11と呼ばれるプロセス。
体内と体外の調査からの結果を示すウランが骨形成を阻害して数と骨芽細胞7,12の活動を変化させます。対照的に、骨と破骨細胞に及ぼすウランは不十分な検討しています。いくつかの生体内での研究は、マウスやラット13,14硝酸ウラニル投与後骨吸収の強化を報告しています。さらに、疫学的調査は、飲料水経由でウラン摂取量の増加が男性15の骨吸収マーカーの血清レベルの増加に関連付けられている傾向があることを提案しました。一緒に取られて、これらの調査結果は、ウランは、骨に蓄積することが骨吸収を促進する結論に至った。しかし、ウランのこの潜在的な影響に関与する細胞のメカニズムは、未解決の問題を残る。このため、骨細胞を吸収に及ぼすウランの影響を調べることにしました
ここでは、設けてプロトコルについて述べるを特徴付ける、前破骨細胞の生存率と破骨細胞分化と吸収活性天然ウランの影響を定量化します。未加工 264.7 変換されたマクロファージ細胞ライン、これは容易に破 4 または 5 日間のサイトカイン RANKL の存在下で培養した場合に区別できるし、古典的な研究に用いられる実験記載が行われています。破骨細胞の分化および機能の16。開発手順は、信頼性の高い、再現性の高い結果とは完全に主要な破骨細胞を対象に与えます。これらすべての理由から、この方法論が骨におけるウランの毒性に関与する分子メカニズムのより良い理解を得ることに有用であると考えています。さらに、このアプローチは新しいウランのキレート剤を特定するためのスクリーニング ツールとして適応できると考えています。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ロンザ</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>ロンザ</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まない</td><td>ロンザ</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用水</td><td>ロンザ</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;L-グルタミン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>HyClone ウシ胎児血清</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 重炭酸ナトリウム水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>酸性ホスファターゼ・レコサイト(TRAP)キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム(MTT)粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>アリザリンレッド S ナトリウム塩、1% w/v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>オステオアッセイ骨吸収プレート、24ウェルプレート</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェル 24ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンコニカルチューブ 50ml</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー 30 cm</td><td>TPP</td><td>90003</td><td></td></tr></tbody></table>

培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

骨生理学と干渉するウランが示されているし、この金属が骨に蓄積することは周知します。しかし、少しは天然ウランの骨細胞の挙動に及ぼす影響について知られています。特に、破骨細胞、細胞の骨基質の吸収のための責任のウランの影響は記載されていません。この問題を調べるためには、破骨細胞前駆体のモデルとして天然ウランのソースとマウスの未加工 264.7 のセル行酢酸ウランを使用して新しいプロトコルを定めています。ここで、破骨細胞の前駆物質のウランの細胞毒性をテストして、破骨細胞形成と破骨細胞の吸収機能にその影響を評価するために必要なすべてのアッセイを詳しく説明します。条件を開発した、特にウラン含有培地の調製および未加工 264.7 の播種細胞を信頼性が高く、高度生殖の結果を取得する許可。さらに、破骨細胞のサイズや堤吸収症マトリックスの割合など様々 なパラメーターの解析を容易にするソフトウェア ツールの使用を最適化します。

酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ染色は、3 つ以上の核を持つ紫色の大型の細胞と破骨細胞を可視化する使用されました。RANKL の存在下で培養した未加工 264.7 のセルから取得した破骨細胞の代表的な画像とウラニル イオンは図 1に示します。ウランへの応答で破骨細胞の数とサイズの変更は、全体の井戸の複合画像と拡大写真で簡単に表示されます。
破骨細胞の大きさは、ImageJ ソフトウェア (図 2) を使用してによって分析されました。この目的のためトラップの破骨細胞を染色の全体も画像が使用され、各培養条件の扱われた同じ地域 (図 2 a と2 D)。輪郭を描かれた各領域内に存在すべて破骨細胞 (<strong ...

ウランは、骨代謝に影響を与える知られています。ここでは、担当骨細胞破骨細胞の機能や分化、生存率に及ぼす天然ウランの影響の調査を目的としたプロトコルを提案する.

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

この手順の全体的な目標は、天然のウラン曝露が破骨細胞の生存率、分化、および機能に及ぼす影響を調査することです。この方法は、ウラン曝露が骨の生理機能と代謝に与える影響に関する環境毒性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ウランのオリジネーターをスクリーニングするための興味深い新しいツールを提供することです。RAW 264.7細胞培養が85〜90%のコンフルエンシーに達したら、セルスクレーパーを使用して細胞培養フラスコの底部から細胞を機械的に持ち上げ、細胞を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。細胞溶液を数回ピペットで動かして塊を砕き、得られた単一細胞懸濁液をカウントします。L-グルタミンと5%ウシ胎児血清を添加したα修飾最小必須培地で、細胞を1ミリリットルあたり10〜4細胞の濃度の1倍に希釈し、ウェルあたり1ミリリットルの細胞を24ウェル細胞培養プレートに加えて、摂氏37度で6時間インキュベートします。破骨細胞の分化および再吸収アッセイの再現性にとって重要なパラメータは、細胞播種密度です。細胞をプレーティングする前に、細胞のカウント、細胞懸濁液の調製、およびその均質性に特に注意してください。小便器用塩溶液を調製するには、滅菌細胞培養試験済みの7.5%重炭酸ナトリウム水溶液から始めて、まず氷上で100ミリモルの重炭酸塩を調製して冷却し、100ミリモルの酢酸小便器溶液を1液ずつ、穏やかに振とうしながら9容量の氷冷重炭酸塩溶液に一滴ずつ加えます。溶液を室温で平衡化させます。3時間後、所望の小便器作動濃度が達成されるまで、適量の小便器溶液をRANKLの1ミリリットルあたり50ナノグラムを含む分化培地に一滴ずつ希釈し、室温でさらに3時間の平衡化を待ちます。小便器塩を希釈するたびに長いインキュベーションステップを行うことは、溶液中の小便器複合体の安定化に不可欠です。2回目の平衡化期間の終了時に、各ウェルの培地を必要に応じて1ミリリットルの小便器処理またはコントロール培地に穏やかに交換し、細胞をインキュベーターに戻します。多核破骨細胞は、培養の3日目から4日目の間に現れるはずです。新たに分化した破骨細胞のサイズと形態を評価するには、製造元の指示に従って酒石酸耐性酸性ホスファターゼで細胞を染色し、細胞核を区別するのに十分な解像度で各ウェルの全表面を画像化します。すべてのウェルの画像化が完了したら、オープンソースのImageJソフトウェアで1つのウェルの画像を開き、スケール単位を確認します。次に、ポップアップウィンドウの[グローバル]チェックボックスをオンにして、新しいスケールユニットを後のすべての画像に適用します。「分析」メニューで、「測定値の設定」を選択し、「エリア」ボックスと「表示ラベル」ボックスにチェックを入れます。他のすべてのボックスのチェックを外します。[分析]メニューで、[ツール]、[関心領域マネージャー]の順に開き、ImageJのメインウィンドウで長方形の選択ツールを選択します。約 1 、 000 x 1 、 000 マイクロメートルの関心領域をアウトライン化し、[ 追加 ] ボタンをクリックして、選択項目を Region of Interest Manager に追加します。次に、[More]、[Save]の順にクリックして、リージョンを保存します。分析する 5 つの領域のいずれかのコピーを作成するには、Region of Interest Manager で関心領域を選択し、選択した領域内で右クリックして領域を複製します。[すべて表示] ボックスと [ラベル] ボックスをオンにし、ポリゴン選択ツールを選択して、重複した対象領域の破骨細胞の 1 つを手動でアウトライン化します。このアウトラインを Region of Interest Manager に追加するには、「Region of Interest Manager」ウィンドウで「追加」をクリックします。すべての破骨細胞を追加したら、すべてのアウトラインを選択し、[計測] をクリックしてその表面を測定します。次に、結果ウィンドウに表示される測定値をスプレッドシートに転送します。小便器で処理した破骨細胞の機能を評価するために、分化培地を添加する1日前に、85〜90%のコンフルエント細胞培養のRAW細胞を成長培地中の24ウェル骨アッセイプレートにプレート化します。翌日、上清を分化小便器を含む培地にそっと置き換え、示したようにRAW細胞が破骨細胞に分化できるようにします。破骨細胞形成の5日目に、小便器含有培地を10%漂白剤溶液に交換して、骨模倣表面から細胞を除去します。室温で5分後、井戸を脱イオン水で2回洗い、風乾させます。次に、各ウェルの非再吸収領域のカルシウム塩を1%Alizarin Red Sナトリウム塩溶液で染色します。10〜15秒後、アリザリン溶液を取り出し、ウェルを水で3〜4回やさしく洗います。アリザリン染色ウェルのRGB画像をグレースケールの8ビット形式に変換するには、[画像]メニューで[タイプ]と[8ビット]を選択します。次に、楕円形の選択ツールを使用して、吸収について分析するウェルの表面全体の輪郭を描き、先ほど示したように関心領域を保存します。閾値の選択を容易にするために、[編集] と [外部のクリア] を選択して、定義された関心領域の外側にあるすべてのフィーチャをクリアします。先ほど示したように関心領域を複製し、[画像] メニューの [しきい値の調整] を選択し、スライド バーを調整して適切なしきい値を選択します。再吸収されたすべての領域はしきい値を上回って白く表示され、再吸収されていない領域はすべてしきい値を下回って赤く表示されます。しきい値の選択を確定するには、[しきい値] ウィンドウで [適用] をクリックし、最終的なバイナリ イメージを適切な形式で保存します。関心領域内で取得する測定を定義するには、[分析]メニューで[測定の設定]を選択し、[面積]、[面積の割合]、および[しきい値に制限]ボックスをチェックし、他のすべてのボックスのチェックを外します。次に、結果ウィンドウ内で再吸収された領域の割合を直接取得するには、[編集] メニューの [反転] を選択して、複製されたバイナリ イメージを反転し、最終的なバイナリ イメージで関心のあるメイン領域が選択されるように注意して、再吸収された領域の割合を測定します。ウランに応答した新たに分化した破骨細胞の数とサイズの変化は、ウェル全体の合成画像や、関心のある特定の領域の拡大写真で容易に見ることができます。異なる培養条件下で成長した破骨細胞のサイズは、各領域内のすべての破骨細胞の輪郭を描き、各輪郭を描いた細胞の面積を測定することで、今示したように分析できます。破骨細胞の吸収活性に対するウランの影響を調べるために、RAW 264.7細胞を骨模倣表面プレート上にプレーティングし、分化させます。アッセイの最後に、破骨細胞を採取し、再吸収されていない領域を染色し、実証されているように画像化します。その後、画像は 8 ビット グレースケールに変換され、吸収された領域の計算を容易にするためにしきい値が設定されます。この手順は、他の重金属が破骨細胞形成に与える影響の研究にも適用できます。

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、破骨細胞の祖先から破骨細胞が形成されるプロセスである破骨細胞形成に対する、異なる抗c-fms抗体濃度の影響を示しています。...

In vitroでのマウス骨髄細胞の破骨細胞形成に対する抗C-fms抗体の効果

破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。...

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

小胞の 2 つの人間の骨細胞によって放出における鉱物の状態を比較するためのプロトコルを提案する: hFOB 1.19 と Sao 2。自分の鉱化作用のプロファイルによってアリザリン赤-S (イオウ) 染色, 紫外線 (UV) 光可視化、伝達電子顕微鏡検査 (TEM) イメージング、エネルギー分散型 x 線微小分析 (EDX)...

HFOB 1.19 によって生成される鉱物と Sao 2 セルを使用して透過型電子顕微鏡エネルギー分散型 x 線微小分析での分析

破骨細胞は、造血幹細胞の単球-マクロファージ系統に由来する組織特異的なマクロファージ polykaryons...

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化

このプロトコルにはマウス長管骨および骨髄分離、骨髄のマクロファージを生成し、破骨細胞マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化剤を使用するが含まれていますか腫瘍壊死因子 α (TNF-α) と M-CSF 受容体抗体抗 c fms...

破骨細胞形成と培養破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体

このプロトコルは、放射性標識アミノ酸取り込みアッセイを提示し、初代細胞または単離された骨のいずれかにおけるアミノ酸消費を評価するのに役立ちます。...

培養骨細胞および単離骨軸におけるアミノ酸消費の評価

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。...

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。...

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

ここでは、中枢神経系髄鞘形成のin...

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するためのインビトロ髄鞘形成アッセイ

学ぶ 培養破骨細胞における天然ウランの影響評価法。RAW 264.7細胞を用いて生存率・分化・機能を解析し、骨代謝への環境毒性メカニズムを解明する新たなスクリーニングツールを提供します。

培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法

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