神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ
2017年9月12日
このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection ソフトウェアを使用して分析しました。
この自動化された高速反復的陰性地走性アッセイの全体的な目標は、神経変性に関連するショウジョウバエ成体の登攀障害を分析することです。この方法は、神経科学分野における重要な問題、例えば神経変性に関連する運動障害のメカニズムへの答えを得るのに役立ちます。この技術の主な利点は、ショウジョウバエの登攀活動を自動化され、高精度の専門的な方法で分析できることです。
この技術の意味は、神経変性の治療と診断にまで及びます。なぜなら、神経変性疾患は進行性の運動能力の喪失と寿命の短縮、そして加齢に伴う神経変性と頻繁に関連しているからです。私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていました。ショウジョウバエ成体の運動活動をより正確に測定したかったのです。
ショウジョウバエの収集を行うには、まずショウジョウバエを25度セルシウス、70％の湿度、12時間の光、12時間の暗闇のサイクルで標準的なショウジョウバエの餌で維持します。炭酸ガス麻酔下でUAS-Dicer2 DDC-GAL4の処女バエを収集します。処女バエを2日齢の成熟雄バエと交配させます。この雄バエは以下の遺伝子型を持ち、雄と雌のバエの比率は1対2です。
各実験グループごとに、新しく孵化した雄バエと雌バエをそれぞれ3つのバイアルに分けて収集します。各正規のショウジョウバエ用バイアルに標準的な餌とともに10匹のショウジョウバエを入れます。その後、バイアルを25度セルシウスに設定します。自動化されたRINGアッセイを実行するには、各遺伝子型について10匹の性別問わずのショウジョウバエを各バイアルに移します。
次に、バイアルをねじで固定します。各実験セットについて、対照群のバエと異なる遺伝子型を持つバエを一緒に分析します。装置の前に配置されたデジタルカメラの電源を入れ、バエが装置に装填され準備ができたら、録画を開始します。
カメラは水平に配置し、装置から適切な距離にカメラを配置して、すべてのバエの位置を比較的正確な場所で捉えるようにします。バエがバイアルに落ち着くのを1分間待った後、ステップドライバーを制御するステップコントローラーの電源を入れます。これは小さな電動モーターを駆動して、取り付けられたレバーを制御し、2秒間で4回装置を連続的に上昇させ、タップします。
装置をタップした後、バエが壁を登り始めることに注目してください。録画を継続したまま、先ほど示したと同様の同期を60秒間隔で3〜5回の連続トライルを繰り返します。実験を5日、15日、25日、35日齢のバエで繰り返します。
各グループについて各実験で少なくとも3つの独立した実験を行い、少なくとも30匹の収集バエまたは3つのバイアルを使用します。データを分析するために、録画されたビデオをコンピュータにインポートします。各トライアルについて、タップしてから6秒後にビデオのスナップショットを撮ります。
R-fly検出ソフトウェアで、ファイルメニューを使用してスナップショット画像をインポートします。次に、ツールバーのベースラインアイコンを使用して、バイアルの上下ベースラインを正確に設定し、カーソルを使用して画像の上下ベースラインにマークを付けます。設定バーの「Rect内のフライ」フィールドに入力するフライの数/バイアル数と、「チューブの高さ」フィールドにバイアルの長さを入力します。
個々のバエの位置は、各バイアルについて画面上にドットで検出され、ラベル付けされます。右側のパネルの表に注目してください。ソフトウェアは各バエの登攀距離を自動的に決定し、各バイアルの10匹のバエの平均値を表示します。平均±SEMとしてデータを提示します。
一元分散分析とボンフェローニ多重比較検定を用いて有意性のP値を計算します。このビデオで示されている自動化されたRINGアッセイを使用したDicer2指定バエの分析は、6秒の時間枠内で雄バエと雌バエの両方で登攀距離の年齢依存的な減少を示し、ドーパミン作動性またはDAニューロンにおけるaux発現がショウジョウバエの運動活動に重要であることを示唆しています。DAニューロンにおけるauxGFPの過剰発現やauxRとauxGFPの共発現は、RNAiの表現型から回復しているにもかかわらず、登攀能力は影響を受けていないようです。
一度習得すれば、適切に行えば2〜3時間で完了します。この開発により、神経科学分野の研究者にとってショウジョウバエメラノガスターにおける神経変性を探求する手段となっています。電気RING装置の使用は非常に危険であり、各確認はしっかりと固定し、この手順を実行する前に慎重に確認する必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルでは、神経変性に伴う成 flies の登攀能低下に焦点を当て、ショウジョウバエの負の地光走性の挙動を分析するための自動化手法について詳述します。この手法では、マルチシリンダーシステムを用いてハエの動きを同期および記録し、運動能の欠損に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 神経変性
背景
- Drosophilaは、神経変性疾患を研究するためのモデル生物として利用されています。
- 負の走地性は、ハエの運動能力を測定する指標となります。
- 神経変性は、多くの場合、運動能の進行的な喪失と寿命の短縮を招きます。
- 自動化システムにより、行動アッセイの精度が向上します。
研究目的
- 神経変性に伴うショウジョウバエの登攀能力低下を分析する。
- 運動機能低下の根底にあるメカニズムを探索する。
- ハエの運動活性の測定精度を向上させる。
使用方法
- ショウジョウバエの同期した移動を制御する自動マルチシリンダーシステム。
- 負の地光走性行動のデジタル記録。
- 自作のRflyDetectionソフトウェアを用いた解析。
- ハイスループットなデータ収集を可能にする迅速な反復アッセイ。
主な結果
- 正確な解析に向けた、ショウジョウバエの運動の同期に成功した。
- 神経変性と関連した登攀能力の低下を特定した。
- 自動解析が効率的かつ信頼できることが証明された。
- 神経変性疾患の治療および診断への潜在的な影響が示唆された。
結論
- この自動アッセイは、Drosophilaの運動行動を研究するための堅牢な手法を提供します。
- 得られた知見は、神経変性疾患に対する治療アプローチに寄与する可能性があります。
- この手法により、運動と神経変性状態との関係についての理解が深まります。
よくある質問
産業上の重要性
この自動化されたハイスループットアッセイにより、神経変性疾患のショウジョウバエ（Drosophila）モデルにおける運動機能低下の迅速な定量が可能となり、客観的で再現性のある行動学的リードアウトを提供することで、初期段階のターゲットバリデーションを支援します。本手法は、複数の遺伝子型および年齢群にわたる数百匹のハエを同時に分析できるため、前臨床スクリーニングにおける予測信頼性を高め、化合物や遺伝的修飾因子の効率的な評価を促進します。この手法を探索ワークフローに組み込むことで、標準化され拡張可能なフェノタイピングを通じて、神経変性疾患ターゲットのメカニズム的なリスク低減に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：遺伝的モデルにおける神経変性に関連した加齢依存的な登攀能力の低下を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：ニューロンの完全性の指標として運動活性を高スループットで測定することにより、機能的な標的バリデーションを支援する。
- 予測的価値：顕著な運動機能障害を示す遺伝子型を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを裏付ける定量的な行動データを生成する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 神経変性疾患に焦点を当てたスクリーニングキャンペーンにおけるアッセイ検証に適した、標準化され再現性のある負の地走性指標を算出します。
- 運用上の価値： 自動ビデオキャプチャとRflyDetectionソフトウェア解析により、遺伝学的または薬理学的な修飾因子の迅速なスクリーニングを可能にします。
- 拡張性： 1回のランで数百匹のハエのデータを処理できるため、手動のアッセイと比較してスループットが向上し、ばらつきが減少します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナル上の意義：神経変性疾患における臨床的な運動機能低下に相当する、運動表現型を評価するための疾患関連システムを提供する。
- 前臨床的な連続性：ショウジョウバエの齢（5, 15, 25, 35日）にわたる縦断的評価を可能にし、進行性の神経変性をモデル化する。
- メカニズム的なリスク低減：遺伝的レスキュー実験（例：auxR/auxGFPの共発現）による評価を可能にし、ターゲットの特異性と経路の関与を検証する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬プロセスの流れに適合し、神経変性モデルにおける遺伝子操作と表現型の結果を橋渡しする定量的な行動学的エンドポイントを提供します。
- 探索生物学：反復的な負の地光走性の測定を通じて、遺伝子発現（例：ドーパミン作動性ニューロンにおける aux）と運動機能を結びつけることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：アッセイにそのまま利用可能な標準化された出力（6秒間の登行距離）を提供し、異なる実験条件間での信頼性の高い比較を可能にします。
- 分析：統計的な厳密さ（一元配置分散分析、ボンフェローニ補正）を伴う平均値 ± SEM データを生成し、群間比較および有意性検定を裏付けます。
- トランスレーショナルリサーチ：行動学的読み取り値を神経変性メカニズムに結びつけ、前臨床モデルにおけるバイオマーカーに基づいた表現型評価を支援します。
- エンタープライズでの再利用：複数の遺伝子型、年齢、および治療群にわたる縦断的な行動スクリーニングのための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：定量的な高解像度の行動表現型解析により、メカニズムの曖昧さを排除し、ターゲット検証における予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：自動同期、デジタル記録、およびソフトウェアベースの解析を通じて、再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：大規模なサンプルサイズにおける運動機能低下の迅速な評価を可能にし、go/no-go判断の効率性を改善する。
- ポートフォリオへの影響：堅牢な年齢依存的表現型進行データに基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを促進する。
実施上の検討事項
- Drosophilaの取り扱い、遺伝交配の維持、および行動解析系のセットアップに関する専門知識が必要です。
- 自動RING装置、ステップコントローラー、デジタルカメラ、および適合する照明などの専用機器が必要です。
- ビデオのインポート、スナップショットの抽出、およびRflyDetectionソフトウェアの操作のための計算基盤が必要です。
- 環境条件（25°C、湿度70%、12時間明暗サイクル）の標準化およびバイアル調製のプロトコルに従う必要があります。
- 電気部品を使用するため、安全への配慮が必要です。装置は操作前に固定し、動作を確認してください。
