Name: まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 学ぶ ヒトBリンパ球から完全ヒトモノクローナル抗体を生成する方法。希少な抗原結合B細胞を分離し、類似抗原を弁別する抗体を作製。免疫療法への応用に有用な技術です。

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専門的な技術支援ありがとうフローサイトメトリー施設"CytoCell"(SFR 健康、Biogenouest、ナント)。彼らのテクニカル サポートもすべてのスタッフが組換えタンパク質の生産 (P2R) とプラットフォームの影響 (INSERM 1232、SFR 健康、Biogenouest、ナント) にありがちましょう。原稿の建設的なコメント、エマニュエル Scotet とリチャード ・ ブレスナックに感謝します。この仕事財政的に、IHU セスタス プロジェクトで、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) を管理する «Investissements d'Avenir» フランス政府プログラムによって資金を供給によって支えられました。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。この作品は、将来プログラム ANR-11-LABX-0016-01 の投資を通して国立研究機関によってサポートされて LabEX 囲碁プログラムのコンテキストで実現しました。

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著者が明らかに何もありません。

提案プロトコルは血で循環 Ag 特定の B 細胞から直接人間の抗体の生成のための強力な方法です。それは 3 つの重要な側面を組み合わせた: (i)、四量体関連磁気濃縮、まれな Ag-結合 B 細胞の前のヴィヴォ分離ができるの使用(cytometry 流れによって、BCR に関する必要な Ag; を発現する B 細胞のみを分離する 3 つの異なる蛍光色素で標識 3 つの Ag テトラマー (2 つの関連するものと無関係なものを 1 つ) を使用して ii) のゲートの戦略(iii) RT-PCR 単一セルのレベルで人間の細胞の Cdna の発現によって対応する組み換え mAb Cdna の再建。
以前の研究は、1 つまたは 2 つの蛍光関連抗原を使用して分離された B セル6,7,8から Mab の並べ替えおよびそれ以降の生産の前に人間の B 細胞をラベルする.関節リウマチ患者の ...

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Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

ここで説明する方法は、目的の抗原 (Ag) に対するモノクローナル抗体 (Mab) を完全に人間の迅速かつ汎用性の高い生産を可能します。Mab は、多くの基礎研究アプリケーションin vitroとin vivoで不可欠なツール: たとえばフローサイトメトリー、組織学、西部のしみを付けおよびブロックの実験の流れ。さらに、自己免疫疾患、がん、治療し、移植拒絶反応1を制御する Mab をより多くに医学で使用されています。たとえば、反 ctla の条項 4、抗 PD 1 (またはアンチ PD L1) Mab は最近がん治療2免疫チェックポイント阻害剤として使用されました。
免疫グロブリン (Ig) で作り出された最初のモノクローナル抗体-免疫マウスまたはラットの脾臓細胞から得られたハイブリドーマを分泌します。ただし、マウスまたはラット モノクローナル抗体と強い免疫反応は、その急速なクリアランスと過敏反応3のありそうな誘導のための人間の彼らの治療上の使用を妨げます。この問題に取り組むため、Mab の動物性タンパク質シーケンス部分的に取って代わられましたいわゆるキメラ マウス ヒトやヒト化抗体を生成する人間の物。ただし、この戦略は部分的にしかコストと生産時間規模の両方を大幅に増加させながら、免疫原性を減少します。よい解決策はヒト B 細胞から直接人間の抗体を生成する、このためのいくつかの戦略があります。それらの 1 つは、ファージや酵母のディスプレイの使用です。これは含まランダム人間 Ig 重のコンビナトリアル ライブラリから可変領域を表示し、光チェイン ファージや酵母と興味の特定の抗原を用いた選択のステップを実施します。この方法の主な欠点は、重く、軽鎖がランダムに関連付けられ、生成された抗体の多様性の非常に大きな増加につながることです。抗体は特定 Ag に対する自然免疫応答から生じるだろっているものに対応しています。また、人間のタンパク質の折りたたみおよびポスト翻訳の修正、複製は、体系的に原核生物や酵母。2 番目の人間 mAb 生産方法は、エプスタイン ‐ バーウイルス感染や抗アポトーシス因子 BCL 6 および BCL-XL4発現によって自然の人間の B 細胞の不死化です。ただし、このメソッドは、メモリー B 細胞にのみ適用され、多数 mAb 生産不死化 B 細胞が目的の抗原特異性と (もしあれば) いくつかの mAb のクローンを識別するためにスクリーニングを必要とする、効率的ではありません。メソッドはこのように高価な時間のかかるです。
新しいプロトコルは、隔離された単一 B 細胞5から人間の抗体の生産の最近記載されています。最適化された単一セル逆転写-ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) の増幅の両方、重と光-鎖のセグメントを単一の並べ替えられた B 細胞からのエンコードを依存しています。真核生物発現系、完全に人間の mAb の再構築をできるように、クローニングと発現のこれらのセグメントのこの続きますです。このプロトコルは、ワクチン接種ドナーからの B 細胞から正常に使用されています。セルを目的の Ag に対して指示される B 細胞の高い周波数を取得し、6をスクリーニングするために必要な時間を制限するワクチン接種後数週間収穫されました。他の完全ひと抗体は、HIV+ (ひと免疫不全ウイルス) 感染患者7と黒色腫患者8から生産されています。これらの進歩にもかかわらずプロシージャがないまだ利用可能メモリ表現型や頻度の独立した Ag 固有の B 細胞の分離ができます。
手順ここで効率的な前のヴィヴォ完全ひと抗原特異的モノクローナル抗体低上映時間と高収率で生産が続く、BCR 特異性に基づいて人間の循環 B 細胞の分離につながる。メソッドは、メモリー B 細胞や抗体産生 B 細胞免疫反応を誘導する制限されていないが、人間ナイーブ B 細胞レパートリーにも適用することができます。Ag 特定 B 細胞は非常に低い周波数で存在からでも動作する、効率の良い指標です。法の原理は次のように: 末梢血単核細胞 (PBMC) は興味の抗原を提示 2 テトラマーと汚れる、それぞれ異なる蛍光色素 (例えば、フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC))、というラベルの付いた密接に関連抗原提示第 3 四量体共役 3 蛍光色素 (例えば、ブリリアント バイオレット 421 (BV421))。抗原結合セルの豊かにする細胞は、抗 PE をコートしたビーズと孵化させると反 APC Abs、細胞分離カラムでソートします。PE+ APC+細胞画分が選択されます種類 PBMC 細胞 B 細胞の同定を許可するために特定の抗体の様々 なステンド グラスと受ける流れ cytometry 細胞選別します。PE+と APC+、鮮やかなバイオレット-、しかしである B 細胞は分離されています。この手順は、カウンター B 細胞ではないまたは tetramerized の抗原にはバインドしませんが、PE/APC (PE+ APC-または PE- APC+これらの細胞になる) または使用されるテトラマー (これらの非抗原部分にバインドを行うセルを選択しますセルになります BV421+)。B 細胞の高い関心のエピトープに固有ではないがこのステップでも反選択されます (これらの細胞に BV421 なるも+)。したがって、このメソッドは、表現する B 細胞受容体 (BCRs) 2 つの非常に密接に関連抗原の間で区別することができる非常に特定の B 細胞を浄化できます。チューブに収集され、単一の特定の B 細胞と、Ig の PCR 増幅 Cdna (相補的デオキシリボ核酸) を複製し、分泌された IgG 抗体としてのひと細胞ラインで表現。
概念の証拠としてこの調査は記述するペプチドが提示主要な組織適合性の複雑なクラスによって認識される人間の抗体の効率的な生成 (MHC-私) 分子とを区別することができますこのペプチドと同じで読み込まれる他のペプチドMHC-私の対立遺伝子。このメソッドは (i) に Ag 固有 Mab; の高収量回復を可能この Ag の複雑さのレベルは重要ですが、(ii) 構造的に 2 つを区別することができるモノクローナル抗体の生産は、Ags を閉じます。このアプローチは、プロトコルのままには、ワクチン接種や感染患者に拡張することができます、ヒト化ラット システム9にもすでに、正常に実装されています。したがって、本研究は基礎研究と免疫療法で使用することができます完全ひと抗体を生成する汎用性と効率的なアプローチについて説明します。

<table><tbody><tr><td>HEK 293A 細胞株</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) ダルベッコ Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-グルコース 0,11g/L ピルビン酸ナトリウム (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - リンパ球の分離中</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>密度 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン R-フィコエリトリン抱合体</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>S21388</td><td>初級グレード 1mg/ml 5mM アジド</td></tr><tr><td>ナトリウム ストレプトアビジン、アロフィコシアニン抱合体</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM アジド プレミアムグレード</td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 421 ストレプトアビジン</td><td>バイオレジェンド</td><td>405225</td><td>濃度:0,5mg / ml</td></tr><tr><td>抗PE共役磁気Microビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>反APC共役磁気MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACsまたはQuadroMACSセパローター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302 / 130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>使用希釈 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>使用希釈 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>使用希釈 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>使用希釈 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Used dilution 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-strip PCR tubes</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks for 96 microtubes</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>数量:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>蒸留水 Dnase/RNase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>ランダム六量体</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>数量 : 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>上付き文字 III 逆転写酵素</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>数量:10000U(200U / ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTPセット、分子生物学グレード</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4 * 100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>PCRの最初のラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>PCRの第1ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>PCRの最初のラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>PCRの第1ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>PCRの初ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - ヒトIgのリバースプライマー - 細菌PCRスクリーニング</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>ユーロフィン</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>PCRの初ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - ヒトIgのリバースプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAGG</td><td>PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGAG</td><td>PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>PCRの2ラウンド目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>PCRの2回目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>PCRの2回目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー -</td></tr><tr><td></td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT 5AgeIVH3__9_30_33GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー 3SalIJH1_2_4_5</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAGA</td><td>PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>PCRの2ラウンド目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー</td></tr><tr><td>5'LVk1_2</td><td>ユーロフィン</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>PCRの第1ラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>ユーロフィン</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>PCRの第1ラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>ユーロフィン</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTCTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー - リバースプライマー - バクテリアPCRスクリーニング</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>PCRの第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash;13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCACAC</td><td>第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>ユーロフィン</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACCAGTCT</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>ユーロフィン</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTGTC</td><td>PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCCA GTCTGCCCTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅 - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>PCRの初ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>PCRの初ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅 - アウタープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー - フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS<br/br/> CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>PCRの第2ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>ユーロフィン</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>PCRの第2ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>ユーロフィン</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅。- インナープライマー -リバースプライマー - バクテリアPCRスクリーニング</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>バクテリアPCRスクリーニング</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plate</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Genbank受託番号 FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Genbank受託番号 FJ475056)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Genbank受託番号FJ517647</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>社製 15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT 培地</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (ルリア・ベルタニ) ブロス (レノックス)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオスピンプラスミド DNA、RNA およびタンパク質精製</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNAトランスフェクション試薬</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>フラットボトム96ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Vボトム96ウェルプレート</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 フラスコ</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOTコーティング緩衝液</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp 平底 96 ウェル ELISA プレート</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>高タンパク質結合</td></tr><tr><td>抗ヒト IgG Ab 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)</td> <td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>TMB 基質</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>シグマ</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap protein A HP カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus クロマトグラフィーシステム</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

まれな抗原特異的 b 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

モノクローナル抗体 (Mab) は、両方の基礎研究および生体医に役立つ強力なツールです。抗体は (例えば、正常な蛋白質およびその変異バージョン) の関連性の高い構造を区別する必要がある場合、高い特異性が必要不可欠です。このような差別の Mab を生成する現在の方法には高価な時間のかかる複数の Ab-産生 B 細胞のスクリーニングが含まれます。提案する迅速かつコスト効果の高い方法の識別、生成のため B リンパ球を循環血液から始まって完全ひと抗体.この戦略の独創性は、容易に利用可能な末梢血単核細胞 (PBMC) を使用して、他のすべてのセルのカウンターの選択を組み合わせる特異抗原結合 B セルの選択によるものです。単一のセルを逆転写ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 技術を使用して人間で表されるその後に対応する mAb のコーディング (相補的デオキシリボ核酸) cDNA シーケンスを取得特定の B 細胞が分離されたら、セルです。わずか 1 ヶ月で、内自然 B 細胞レパートリーによって検出されたあらゆる目的の抗原に対して指示される高い識別人間 Mab のミリグラムを生成することが可能です。

このプロジェクトでは、ペプチド Pp65495を認識する人間の Mab の世代に健康なドナーから PBMC から始まって主要な組織適合性の複雑なクラスによって (Pp65、ヒトサイトメガロから) 提示私 (MHC-私) 分子 HLA A * 0201 (HLA-A2)。これらの Mab を区別このコンプレックスと同じ MHC に読み込まれる他のペプチドを表す複合体-私の分子。
PBMC は、HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマー上記プロトコルで説明したようと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れ cytometry セルソーターの磁気濃縮細胞が実行可能な CD14 のゲート最初-CD16-CD3-CD19+</s...

希少な B 細胞人間の血液循環から始まって、興味の抗原のために特定の抗体の生産のための手法について述べる。これらの自然抗体の生成は効率的かつ迅速、得られた抗体関連性の高い抗原の間で区別することができます。

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

この手順の全体的な目標は、血液中を循環するヒトBリンパ球から始まる目的の抗原に対する完全なヒトモノクローナル抗体を産生することです。このプロトコルにより、関連性の高い抗原を識別できるモノクローナル抗体を作製することができます。免疫療法などの一部のアプリケーションでは、抗原の正確なターゲティングが不可欠になる場合があります。この技術の利点は、これが健康なドナーまたは免疫化されたドナーの血液から開始して実行でき、まれな抗原結合B細胞でさえも単離できることです。この方法はヒトサンプルから開始して説明されていますが、事前に免疫化できる動物にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、手順が実際には識別されたBリンパ球の非常に複雑な複数の分析ゲーティング戦略の下にあるため、重要です。手続きはメリンダが行います。当研究室のアシスタントエンジニアです。まず、50ミリリットルの円錐管に15ミリリットルの密度勾配で35ミリリットルの希釈細胞懸濁液をピペットで入れます。次に、ブレーキをオフにして円錐形のチューブをスイングバケットローターに入れ、室温で25分間重力1290倍で遠心分離します。次に、密度勾配培地とプラズマ層の界面で、単核細胞層を慎重に吸引し、新しい50ミリリットルの円錐管に移します。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に加え、重力460倍で5分間遠心分離します。次に、ペレットを200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に2%ウシ胎児血清とともに再懸濁します。共役四量体を最終濃度10マイクログラム/ミリリットルまで添加します。よく混合し、光から保護された層流フード内で室温で30分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの氷冷セル分離バッファーを細胞懸濁液に加えます。細胞懸濁液を重力の460倍で5分間遠心分離します。得られた細胞ペレットに、500マイクロリットルの氷冷細胞分離バッファーと50マイクロリットルの2種類の磁気マイクロビーズを加え、細胞懸濁液を20分間インキュベートします。次に、細胞ペレットを氷冷細胞分離バッファーに再懸濁します。平衡化したカラムの上部に細胞懸濁液を慎重に移し、完全に排出します。次に、チューブを3ミリリットルの細胞分離バッファーですすぎ、バッファーをカラムに移します。カラムを3回すすいだ後、マグネットから取り出し、25ミリリットルの円錐形の収集チューブに置きます。カラムの上に5ミリリットルの氷冷分離バッファーを追加した後、プランジャーを使用してカラムから細胞をすばやく洗い流します。抗ヒト抗体と7AADのカクテルで細胞ペレットを再懸濁し、総量100マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水と2%ウシ胎児血清で再懸濁します。その後、細胞を摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、セルソーターサイトメーターを使用して、1秒あたり1, 000イベントを超えない単一細胞レベルで特定のB細胞をソーティングします。次に、選別した1つのB細胞を、10マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水と10ユニットのRNAse阻害剤をあらかじめ充填した8ストリップPCRチューブに集め、96マイクロチューブのラックに置きます。チューブをマイナス80°Cですばやく凍結します。凍結したサンプルを70°Cに保ったドライバスで5分間加熱し、細胞を溶解します。次に、ストリップを氷の上に置き、逆転写マスターミックスの構成を開始します。逆転写マスターミックスが調製されたら、プログラムはサーモサイクラーに指示します。逆転写の最後に、ネスティングPCRを行い、免疫グロブリン遺伝子を増幅します。可変重鎖およびコードセグメント用の500塩基対PCR産物と可変軽鎖コードセグメント用の350塩基対PCR産物の移動を1.5%アガロースゲル上で視覚化することにより、陽性クローンを同定します。クローニング産物1マイクロリットルを45マイクロリットルの電気コンピテントTOP10大腸菌細胞に加えます。エレクトロポレート。次に、500マイクロリットルの2X YT培地を細胞に素早く加え、摂氏37度の水浴中で30分間インキュベートします。形質転換した細菌を2X YTアンピシリンプレートに広げます。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、反応プレミックスをセットし、氷上に保管した8ストリップPCRチューブに25マイクロリットルを加えます。次に、滅菌爪楊枝を使用してコロニーを選び、2X YTアンピシリンプレートにコロニーを縞模様にします。次に、つまようじをPCR反応チューブに浸します。1.5%アガロースゲル上で、重鎖ベクターの850塩基対PCR産物と軽鎖ベクターの600塩基対PCR産物の移動を視覚化することにより、陽性クローンを同定します。2ミリリットルのLB培地に、4つの陽性コロニーを接種します。接種液を摂氏37度で毎分200回転振とうしながら一晩インキュベートします。トランスフェクションの前日に、平底96ウェルプレートの各ウェルに10%の胎児ウシ血清を補充したダルベッコの修正イーグル培地の200マイクロリットルに15,000個のヒト胚性腎臓細胞を播種します。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。直鎖状ポリエチレンイミン誘導体トランスフェクション試薬を使用して細胞をコトランスフェクションします。0.5マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬を150ミリモルの塩化ナトリウム10マイクロリットルで希釈します。次に、各可変重鎖および軽鎖発現ベクターを0.125マイクログラムで10マイクロリットルの150ミリモル塩化ナトリウムに希釈します。すべての希釈液をそれぞれ10秒間ボルテックスします。次に、あらかじめ希釈したDNAトランスフェクション試薬を10マイクロリットルのDNA溶液と混合します。DNAトランスフェクション混合物を15秒間すばやくボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。DNAトランスフェクション混合物を細胞上に滴下し、プレートを静かに渦巻かせます。トランスフェクションの16時間後に培地を交換し、無血清培地で37°Cで5日間細胞を培養します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して上清を吸引し、それをv-bottom 96ウェルプレートに移します。各ウェルを96ウェルのELISAプレートに関連抗原を4°Cでコーティングし、再構成したELISAコーティングバッファー100マイクロリットルに最終濃度2マイクログラム/ミリリットルで一晩コーティングします。次に、トランスフェクションした細胞上清50マイクロリットルを96ウェルELISAプレートのウェルに加え、プレートを室温で2時間インキュベートします。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に結合した100マイクロリットルの抗ヒト免疫グロブリンG抗体を1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度で加え、ウェルを室温で1時間インキュベートします。最後に、50マイクロリットルの発色基質をウェルに加え、さらに20分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、分光光度計で450ナノメートルの光学密度を読み取ります。特定のB細胞を単離するために、HLA-A2/Pp65複合体に対して受容体を発現するB細胞を識別できるゲーティング戦略が用いられた。当初、細胞はCD19陽性、CD3陰性ゲートでした。最後に、HLA-A2/Pp65PEおよびHLA-A2/Pp65APCの両方で細胞を染色し、HLA-A2/MelABV421四量体ではなく、ゲーティングして、特異性の高いB細胞を得ました。このゲーティング戦略を用いて、選択的B細胞を単離することができ、HLA-A2/Pp65と他の関連HLA-A2ペプチド複合体を区別することができます。次に、HLA-A2/Pp65四量体に対するPC1.02抗体の存在を調べるために、ELISAアッセイを行った。得られた棒グラフでは、y軸は最適な密度の読み取り値に対応し、x軸はHLA-A2ペプチドに対応します。このアッセイから、モノクローナル抗体がペプチドおよび主要組織適合遺伝子複合体依存的にHLA-A2/Pp65四量体と結合することが示されています。次に、表面プラスミンレジデンスを使用して、PC1.02抗体の結合親和性を研究しました。次に、HLA-A2/Pp65特異的B細胞を解析するための表形式のデータを取得しました。非特異的B細胞の排除戦略、免疫グロブリン遺伝子増幅の収量、およびHLA-A2/Pp65特異的B細胞からのモノクローナル抗体産生の影響が示されています。習得すれば、ヒト血液からの抗原特異的B細胞の単離からモノクローナル抗体の産生まで、わずか1か月で行うことができます。この手順を実行するときは、B細胞のソーティングからRT-PCRに一時停止せずに直接行うことを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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天然物に対するモノクローナル抗体の作製

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