Name: そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶマウス乳腺全体採取法による組織形態と細胞外マトリックス発現の解析技術。免疫組織化学染色とImageJを用いて、導管構造とタンパク質発現を定量化し、発生生物学や腫瘍研究に応用する方法です。

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著者は、それぞれ動物の剖検と腺の分離について 4 月と博士ロジャー ・ Broderson を認めたいと思います。この仕事のための資金は、慢性疾患の高齢化のためフィラデルフィア大学整骨医学センターによって支えられました。

すべてのテクニックは厳密の下で実施された、このプロトコルでは動物を対象とする手順が審査し承認機関動物ケアおよび使用委員会フィラデルフィア オステオパシー医科大学の倫理的な指針。
 1 です。 サンプルの調達・加工 <ol><li>選択適切な動物の対象と CO 2 室に場所。この実験では、8-10 週を使用して古い女性未 B6。Cg-Cav1tmMIs/J ・ C57BI/6 j.</li>
	<li>30-40% にガスの流れをオン。約 2 分後に動物が目に見えて意識なく、追加分の完全な圧力にガス栓をあけて 
	注: は、10 分の期間のための CO 2 配信停止後 (例えば 胸の動き) を呼吸の兆候を観察することによって動物の死を確認します。動物がまだ生きている場合は、CO 2 チャンバーに戻されます可能性があります。頚部転位も使えますが血液が乳腺の解剖結果と干渉して集まるよう勧めできません</li>。
	<li>次の犠牲、仰臥位で死体をピン留めし、70% エタノールで飽和します</li>。
	<li>鉗子を使用して恥骨のすぐ上毛皮をピンチし、小さな手術ハサミ ニックします。移動腹側正中線に沿ってペルト仙骨頭蓋にカットはさみを回転します</li>。
	<li>大きいはさみや、止血、にべもなく解剖皮下筋膜両側、腹膜を穴をあけることは注意を使用しています。切開の両方の遠位端の水平方向の余白に沿って裁断します</li>。
	<li>ピン ペルト フラップを開き、70% エタノールで再度スプレーします 。
	注: 70% のエタノールの使用には、腺と周囲の皮下組織の間よりよい視覚的な効果が認められて、このソリューションの使用の結果として組織の乾燥を避けるために注意します。乾燥を避けるため、4 分を超えない時間内腺を削除します。捜査官として 70% のエタノールの代わりに、組織の乾燥を避けるために、1 × PBS などの一般的な分離バッファーを置き換えることも</li>。
	<li>乳腺と関連付けられた皮膚脂肪真皮から自由を切断、ペルト フラップの内側に沿って #4 メスのブレードをスライドさせて、関心の乳腺を検索します 。
	注: 外科用マイクロ ルーペ x 3.5 は腺の簡単に可視化に役立つ可能性があります</li>。
	<li>はすぐに新たに単離した腺 10% 中性緩衝ホルマリン 24-48 h. のための 10:1 ソリューション組織ボリュームを含む円錐管を水没 
	注: 依存研究の意図が、多くの代替の定着剤を使用できますパラホルムアルデヒド、ゲノム研究と市販の RNA のバッファーを保持するためにエタノールなど</li>。
	<li>は、パラフィン包埋用機関のプロトコルに従う、埋め込み処理、ベンダーにサンプルを提出、スライス/スライド マウント。5 μ m で組織をセクションします 。
	注: 余分な脂肪の周囲腺による区分および染色する前に組織の 100-200 μ m の削除を検討します</li>。
</ol> 2。組織染色 パラフィンを溶かす 1 h の 58 ° C で <ol><li>ヒート ブロックに染色される 免疫組織化学 <ol><li>場所のスライドを設定します 。
		注意: は、スライドをオフに実行可能性がありますパラフィン ワックスを溶融します。密接に監視または流出ワックスをキャプチャするスライド下のワイプを配置します 。
		注: この手順は必須ではない、スキップする場合があります。この一歩を追加する可能性があります結果を向上させる結果が期待されていない場合</li>。
		<li>加温スライド スライドで jar 含むの 100% キシレン 30 分完全な水没を確保するためです。もう一度繰り返します 。
		注: この時点で、目視検査対象となる脂肪組織のパラフィン切片が頂けますように。追加脂肪やワックスが明らかの場合、キシレンでスライドする必要があります再冠水しました。これは組織の収縮を引き起こす可能性があるキシレンに加えられた露出を最小限にする注意を使用します</li>。
		<li>10 分 100% のエタノールを含むスライド jar rehydrate 組織をもう一度繰り返します</li>。
		<li>10 分 95% のエタノールを含むスライドに移動スライドをもう一度繰り返します</li>。
		<li>スライド、スライド瓶含む 75% のエタノールの 5 分に移動</li>
		<li>スライド、スライド瓶含む 50% エタノールに 5 分間を移動します。</li>
		<li>10 mM クエン酸ナトリウム溶液 (pH 6.0) ホット プレートや電子レンジを茹でて Coplin jar に注ぐ 。
		注意: 慎重に加熱しながらソリューションを監視、上の沸騰を避けるために世話をします。コンテナーは、とても暑くなるでしょう。やけどをしないように保護を使用します</li>。
		<li>ゆっくり Coplin に場所スライド瓶、完全な水没の確保とエピトープを取得する 10 分間 100 ° C で孵化させなさい。削除し、慎重にスライドをドライします</li>。
		<li>は、疎水性のマーカーと組織のまわりで障壁を描画します。十分な内因性酵素の阻害剤を追加 (過酸化水素とアジ化ナトリウム、利用可能な商業的) 組織を被覆し、10 分間インキュベート</li>
		<li>サブマージ スライド 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 10 分間</li>
		<li>は、組織を被覆し、加湿チャンバーに室温で 1 時間インキュベート 1x PBS で十分な 10% ロバ血清を追加します 。
		注: 実験をここで休止して一晩 4 ° C で加湿チャンバ内のスライドを保存することによってできます。ロバ血清最適な染色結果が得られることがわかった、最適な結果を決定するための馬の血清やヤギ血清ウシ血清アルブミン (BSA) など異なる血清をテストする調査官しれません。捜査官が使用する前にこの新鮮なを準備する必要があります BSA を使用している場合</li>。
		<li>は、スライドから余分なブロッカーを捨て、組織がソリューションで均等に覆われていることを確保するスライドに直接 1% 血清中正しく希釈した一次抗体を追加します。加湿チャンバーに室温で 30 分間インキュベートします 。
		注: この手順続けられるかもしれません時間期間が長くなると湿気のある商工会議所の 4 に格納されている ° c. をこの段階で適切なネガティブ コントロール スライド (例えば ない一次抗体、抗原陰性組織等 を知られているとスライド) を含めるようにしてください</li>。
		<li>慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート</li>
		<li>過剰 PBS を捨て、ティッシュをカバーし、加湿チャンバー内で 30 分間インキュベートする十分な西洋わさびペルオキシダーゼ ラベルを追加します 。
		注: この手順では、捜査官が蛍光蛍光共役二次抗体を用いた染色へ進学を希望する可能性があります。次の手順を適宜変更する必要がありますこれを希望する場合</li>。
		<li>慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート</li>
		<li>は製造元の推奨比率に従ってクロモーゲン ソリューション プラス ジアミノベンジジン (軽打) を行い渦によるミックスします 。
		注: 多くの既製のキットは別にこのプロトコルで使用される市販</li>。
		<li>デカント過剰スライドからバッファーし、組織に直接発色染色の 2 〜 3 滴 (10-50 μ L) を追加し、湿気の多い部屋で 5 分間インキュベートします。慎重に組織を流れる約 1 mL 式行先方向 2 O でスライドを洗うです 。
		注意: DAB 発色は非常に有毒です。有害廃棄物を皮膚や収集のフローで汚れの直接接触を回避します</li>。
	</ol></li> <li>ヘマトキシリンとエオシン (H &#38; E) <ol><li>1-2 分の水道水の下で軽く 2 〜 2.5 分リンス スライドのハリス ヘマトキシリンでスライドを水没クロモーゲン インキュベーション後最終すすぎ、次 
		注: 組織の上に水の直接噴流を避けるために世話します</li>。
		<li>埋没スライド分化溶液 (70% エタノール 100 mL に塩酸の 0.25 mL) 2-3 s 用。約 1-2 分間水道水で優しくスライドをリンス</li>
		<li>の 95% のエタノール 30 の 60 s. リンス スライド ブルー エージェント (pH 9.4 を水道水 100 mL で 4.5 mg 炭酸カルシウム) のスライドを水没 s.</li>
		<li>アルコール エオシン Y 2-3 分で埋没、スライド</li>
		<li>脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織</li>。
		<li>Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更</li>
		<li>- リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします 。
		注: 異なる染色法が選ばれた場合、メディアを別のマウントが、要求されるかもしれない。例えば、調査官が蛍光標識二次抗体を場合、水性マウントより理想的である</li>。
		<li>室温で一晩を設定するスライドを許可します</li>。
	</ol></li> <li>Picrosirius 赤 (PSR) 染色 <ol><li>染色、免疫組織化学プロトコル手順 6 (50% エタノール浸漬) に従うスライドを選択します</li>。
		<li>1 h. の PSR の埋没、スライドを染色</li>
		<li>染色を区別するために 2 回の 1-2 秒の 0.5% 酢酸のスライドが水没します</li>。
		<li>脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織</li>。
		<li>Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更</li>
		<li>スライドをオフに簡単にについての 100% キシレンの沈没によって 3-4 s ・</li>
		<li>- リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします</li>。
	</ol></li></ol> 3。サンプル分析 <ol><li>管解析 <ol><li>選択スライド染色 α SMA。20 倍の倍率で代表的な画像を収集カメラ マウントの目的を搭載光学顕微鏡を使用しています</li>。
		<li>使用 ImageJ (NIH) を区別し、各画像のダクトをカウントします。これらは手動で列挙することができます。 または 1 つは個々 のダクトに数値のスコアを割り当てる可能性があります。数値スコアを割り当てる、ImageJ を開き、プラグインを選択します。次に分析を選択し、ドロップ ダウン メニューからセルのカウンターを選択します。初期化をクリックし、ダクトのラベリングを開始するタイプ 1 をハイライト表示します。完了したら、管のカウントを表示する結果を選択します 。
		: 注意して構造が乳管癌と血管がないことを確認します。</li>
		<li>で &#39; 設定測定 &#39; オプション、チェック &#39; 境界 &#39; と &#39; エリア &#34; です</li>。
		<li>筋上皮区画 (α SMA 汚れ援用可視性) で各ダクトの周りに線を描くフリーハンド多角形ツールを使用して。選択 &#39; メジャー &#39; 境界と領域を記録します</li>。
		<li>再び内部に内腔の上皮の根尖側に沿ってラインを描くフリーハンド多角形ツールを使用しています。選択 &#39; メジャー &#39; 境界と領域を記録します</li>。
		<li>は、上皮のまわりを得るために筋上皮区画の境界から内腔の区画の境界を減算します。上皮の領域を取得する上皮区画の面積から内腔の区画の面積を減算します</li>。
	</ol></li> <li>免疫組織化学分析 <ol><li>ImageJ やフィジー スイートなどの分析ソフトウェアに明視野画像をアップロードします 。
		注: このプロトコルは ImageJ と IHC ツールボックス プラグインを使用して分析の汚損のため手順をについて説明します</li>。
		<li>は、プラグイン メニューから IHC ツールボックスを開きます。&#34; モデルの選択 &#34; 適切な染色を選択コンボ ボックス (すなわち H-DAB、PSR、等)。選択、&#34; 色 &#34; 汚れを分離します。結果ウィンドウが表示されます 。
		注: 興味の蛋白質細胞外や細胞内スペースにある血しょう膜にバインドされている場合、このメソッドは適切です。興味の蛋白質が核の場合を選択する &#34; 核 &#34; 積極的に汚された核の画像を分析するプラグインが要求されます</li>。
		<li>色選択スライドを使用して、背景の追加または過剰な染色除外せず汚れの適切な分離を確保するためです 。
		注: 自動モードは汚れを検出することができるまたは許容範囲の画像は発生しません、正方形を描く関心領域 (ROI) 識別上領域を染色します。IHC ツールボックス ウィンドウで、選択 &#34; 鉄道 &#34; 適切なターゲットにプラグインを直接にします</li>。
		<li>は、画像を 16 ビットに変換します。画像 &#8594; タイプ &#8594; 16 ビット</li>。
		<li>しきい値画像。画像 &#8594; 調整 &#8594; 自動しきい値</li>。
		<li>は、長さを割り当てるイメージ スケール バーの上に直接ラインの投資収益率を描画することによって画像の計測スケールを設定します。スケール バーを設定するに移動 分析 &#8594; スケールを設定します。(例えば 120 ピクセル/50 μ m) の長さの単位あたりのピクセル数を入力します</li>。
		<li>は、結果の領域を測定し、平均グレー値。分析 &#8594; 設定測定 をクリックして測定を収集し、分析 &#8594; 測定</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

論文では, ECM 式および膵管の形態の下流組織学的解析のためそのままマウス乳腺を分離する方法を説明しました。膵管の形態の分析に関しては、この手法は、染色標本に基づいて管建築の迅速な調査を可能。 にします。管分析の他の方法は技術的に挑戦的で、時間がかかるかもしれない方法管のツリーの視覚化を有効にする染料の注射に依存します。
乳癌で ECM を異常と報告されています。1,2,6,9具体的には、ECM の豊かさおよび/または架橋結合パターンの変化腫瘍進行・転移・治療抵抗3,4,6,7 に影響...

乳がんは、実質的な組織線維症1,2,3,4度が特徴です。ECM と呼ばれる、この非携帯電話エンティティはすべての組織に様々 な程度で発見され維と非フィブリル型コラーゲン、エラスチンのに加えて、様々 なシグナル分子の糖タンパク質の複雑な網目の主に構成されていますこの行列で隔離。恒常性の条件の下で成膜と ECM の劣化が厳しく管理します。5乳腺腫瘍、ECM の沈着と分解のバランスが中断されます。そのため、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン-C 他の中など豊富な ECM 蛋白質を表現する乳腺腫瘍が報告されています。6マトリックス架橋の増加パターンに加えてこれらの蛋白質の異常発現は乳房腫瘍の進行・転移・治療抵抗1,の3、を促進するために記載されている4,7,8,9。
ECM 組成および膵管の形態を評価するためにそのまま乳腺の分離を行った。ここでは、我々 欠乏未メスマウス カベオリン 1, 内在性膜タンパク質は積極的にリンクされている乳房の腫瘍署名10、11,12、女性未 B6 を制御マウス。組織学的処理およびこれらのティッシュの汚損、管形態の特性と共にいくつかの ECM タンパク質の同定を許可しました。
全体的にみて、全体をそのまま乳腺の分離は、研究者に, 外的あるいは内的要因に応答して発生する組織全体の形態や細胞の変化を調査する機会を与えます。技術の欠点は、膵のツリーの複雑な形態のより完全な画像をもたらすと 3 D 視点とは対照的の 2 次元 (2 D) 組織切片の解析に関連付けられます。乳腺で行われる細胞と細胞外マトリクスの相互作用の複雑さを考えると、全体、そのまま腺の分離が効率的にマウス乳腺の様々 な地域で膵管の形態とタンパク質発現の分析に有利です腺。

<table><tbody><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>オリンパス</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>cellSensエントリーソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R 外科用マイクロルーペ</td><td>ローズマイクロソリューション</td><td></td><td>研究者の好みで倍率</td></tr><tr><td>メイヨーはさみ</td><td>メドライン</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>染色ラック</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>染色皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>コプリンジャー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td>組織に適したサイズ</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ キット (HRP、マウス、DAB+)</td><td>ダコ</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>ピクロシリウス レッド キット</td><td>アブカム</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>エオシン Y、アルコール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>ハリス ヘマトキシリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 血清</td><td>EMD ミリポア</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>キシレン、試薬グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200 プルーフ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>分子生物学に適した</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>永久取付媒体</td> ダ<td>コ</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>ユーキッツ 取付媒体</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td>アブカム</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>テネイシンC抗体</td><td>アブカム</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>アルファ平滑筋アクチン抗体</td><td>アブカム</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>ダコ・エンビジョン デュアルリンクシステム HRP</td><td>ダコ</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

この手順の目的は、ECM 式と管のアーキテクチャを評価するために雌の未経マウスから #4 腹部乳腺を収穫するためだった。ここでは、皮膚の下の小さなポケットは、マヨはさみ、基になる腹膜から皮下組織内腺の分離を許可するを使用して作成されました。腺の可視化は、3.5 の使用によって助けられた x R 外科用マイクロ ルーペ。ペルトは逆になったし、ヘアケアのままの乳腺の脂肪パッドの識別。#4 腹部腺の皮下層と腺の間メスの刃を横方向に摺動によって切開しぶっきらぼう。、収穫後すぐに腺 10% 中性緩衝ホルマリン後続のティッシュの処理のために置かれました。それは主に膵管上皮細胞と部分生検で見逃される可能性が他のアイソレータケージ細胞集団の重要な組織全体の相互作用を除外するリスクを排除するため、全体の腺の切除は有利です。方法論の 1 つの欠点は、腺内の個別の場所に管の形態形成および蛋白質の表現の分析を制限する固定組織から連続切片の使用です。など、3 次元 (3 D) で管のアーキテクチャおよび蛋白質の表現の変更は容易に獲得可能ではないです。全体的にみて、手法は全体そのままマウス乳腺発達性膵管の形態や乳房癌など下流の調査のために必要とする研究に適用されます。

雌マウス乳腺の 5 ペアがあります。具体的には、子宮頸部腺 (#1)、腹部腺 (#4)、呼吸器の腺 (#2 および #3) 1 組と鼠径腺 (#5) (図 1A) の 1 ペアの 2 つのペアの 1 つのペアがあります。ここでは、彼らは容易に識別可能、#4 腺を分離しました。状況によっては、#4 と #5 腺分離した一緒に両者の区別が困難です.そのまま #4 腹部を分離するには、乳腺、ペルトは固定され (図 1B) の矢印で示される #4 腺の場所を明らかに、基になる腹膜から慎重に分離します。#4 腺慎重に切除され任意の残留皮下または筋肉ティッシュの存在を検査します。私たちの分離腺 (図 1C) 個人を特定できるこれらがなかったら、我々 はフィブロネクチン ステンド腺を組織していた区分する前に削...

ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド グラスから抽出されました。

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

この乳腺全体採取技術の全体的な目標は、無傷の腺からの乳腺の組織学的提示の解析を容易にすることです。この方法は、腫瘍で間質組織がどのように再構築されるか、異常な遺伝子またはタンパク質の発現が乳管の構造をどのように変化させるかなど、腫瘍生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、健康なマウスと病気のマウスの乳腺全体におけるタンパク質発現と乳管構造を特徴付け、定量化できることです。この手法を実演するのは、私の研究室の大学院生であるクリス・トンプソンです。テキストプロトコルに従って8〜10週齢の雌の未経産マウスを犠牲にした後、死体を仰臥位に固定し、70%エタノールを使用して飽和させます。鉗子を使用して毛皮を恥骨のすぐ上につまみ、小さな手術用ハサミで傷をつけます。次に、はさみを回転させ、腹側の正中線に沿って毛皮をカットし、尾側から頭蓋側に移動します。大きなハサミまたは止血剤を使用して、腹膜に穴を開けないように注意しながら、皮下筋膜を両側に鈍く解剖します。切開部の両遠位端の水平縁に沿って切り込みます。次に、毛皮のフラップをピンで固定して開き、ティッシュにPBSをスプレーして湿らせます。次に、目的の乳腺を特定し、毛皮フラップの内側に沿ってメスの刃をスライドさせ、乳腺と関連する皮下脂肪を真皮から解放します。腹部を鼠径部から分離する前に、腺をできるだけ明確に識別するように注意してください。新たに分離された腺を、組織容量10%の中性緩衝ホルマリンに対する約6ミリリットルの10〜1溶液を含む円錐管に直ちに沈め、24〜48時間インキュベートします。パラフィンをスライドから溶かし、テキストプロトコルに従ってスライスを再水和した後、10ミリモルのクエン酸ナトリウム溶液をホットプレートまたは電子レンジで沸騰させ、溶液をCoplinジャーに注ぎます。スライドをゆっくりとCoplinジャーに入れ、完全に水没するようにし、スライドを摂氏100度で10分間インキュベートしてエピトープを回収します。次に、スライドを取り外して慎重に乾かします。次に、疎水性マーカーで組織の周りにバリアを描きます。乾いたら、スライドをPBSで1〜2秒間すすぎます。次に、組織を覆うのに十分な内因性酵素ブロッカーを追加し、スライドを10分間インキュベートします。スライドを1X PBSに10分間沈めます。次に、組織を覆うのに十分な10%ロバ血清とPBSを加え、サンプルを加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。スライドから過剰なブロッカーをデカントし、適切に希釈した一次抗体を1%血清で直接スライドに添加して、組織が溶液で均一に覆われるようにします。スライドを室温で加湿チャンバー内で30分間インキュベートします。約1ミリリットルの脱イオン水を組織上に流してスライドを慎重に洗浄し、次にスライドを1X PBSの1回の交換で5分間インキュベートします。余分なPBSをデカントし、十分な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、サンプルを加湿チャンバーで30分間インキュベートします。約1ミリリットルの脱イオン水を組織上に流してスライドを慎重に洗浄し、前回と同様に1X PBSを1回交換して組織を5分間インキュベートします。DABと発色剤溶液を調製した後、スライドから余分なバッファーをデカントし、組織に直接2〜3滴の発色剤染色液を加えます。サンプルを加湿チャンバー内で5分間インキュベートします。次に、約1ミリリットルの脱イオン水を組織に流してスライドを慎重に洗います。発色原インキュベーション後の最終すすぎ後、スライドをハリスヘマトキシリンに2〜2分半沈めます。.その後、水道水でスライドを1〜2分間やさしくすすぎます。スライドを分化溶液に2〜3秒間浸します。その後、水道水でスライドを約1〜2分間やさしくすすぎます。スライドを青色のエージェントに60秒間沈めます。次に、スライドを95%エタノールで30秒間すすぎます。スライドをアルコール性エオシンYに2〜3分間移し、その後、95%エタノールをそれぞれ1分間ずつ2回交換して組織を脱水します。次に、最後に、組織を100%エタノールで1分間1回脱水します。糸くずの出ないワイプでスライドを慎重に乾かします。次に、非水性樹脂ベースの合成封入剤をスライドに1滴塗布し、カバースリップを塗布します。管状分析を行うには、α SMAに染色されたスライドを選択します。次に、カメラに取り付けられた対物レンズを取り付けた光学顕微鏡を使用して、20倍の倍率で代表的な画像を収集します。各画像のダクトをカウントするには、手動でダクトをカウントするか、ImageJを開いてプラグインを選択します。次に、[分析]を選択し、ドロップダウンメニューからセルカウンターを選択します。[初期化]をクリックし、次に「1」とハイライト表示してダクトのラベル付けを開始します。終了したら、結果を選択して管数を表示します。まず、線ツールで画像のスケールバーに線を描きます。次に、[分析] をクリックしてスケールを設定します。次のウィンドウで、既知の距離で距離を入力し、長さの単位で単位を入力します。次に、[OK]をクリックします。次に、設定された測定オプションで、面積と周囲長を確認します。次に、フリーハンドのポリゴンツールを使用して、筋上皮コンパートメントの各管の周りに線を引きます。測定を選択し、周囲と面積を記録します。フリーハンドのポリゴン ツールを再度使用して、内腔の内部内の管上皮の頂端側に沿って線を引きます。次に、測定を選択し、周囲と面積を記録します。筋上皮コンパートメントの面積から内腔コンパートメントの面積を差し引いて、管上皮の面積を求めます。筋上皮コンパートメントの周囲から内腔コンパートメントの周囲を差し引いて、管上皮の周囲を求めます。免疫組織化学分析を行うには、明視野画像をImageJやFiji Suiteなどの分析ソフトウェアにアップロードします。ImageJのプラグインメニューを使用して、IHCツールボックスを開きます。開いたモデル選択コンボボックスで、適切な染色を選択します。カラーオプションを選択して、汚れを分離します。これにより、結果ウィンドウが開きます。カラーセレクタースライドを使用して、背景のインクルージョンや過度のステインの排除なしに、ステインを適切に分離します。画像タイプである 16 ビットに移動して、画像を 16 ビットに変換します。次に、画像に移動して画像をしきい値にし、しきい値を調整します。最後に、分析に移動し、測定を設定して結果の面積と平均グレー値を測定し、分析、測定を選択して測定値を収集します。これらの4番乳腺の固定切片では、コラーゲン、フィブロネクチン、およびテネイシン-Cの発現が解析されました。矢印は、これらの組織に管が存在することを示しています。管の形態学的特徴を定量化するには、不適切な取り扱いにより測定できない組織や管が損傷する可能性があるため、組織切片を慎重に扱うことが重要です。解析に使えない損傷組織の例をこちらに示します。このパネルには、ダクトが測定可能で定量化可能な無傷の組織標本が示されています。管は、周囲のフィブロネクチン染色された間質だけでなく、管の内腔を覆う上皮細胞の密集した集団によっても特徴付けられます。このフィブロネクチン染色切片では、いくつかの無傷の管に矢印で示された枝が含まれています。この分析の目的上、これらの管枝を別々の管構造と見なすべきではありません。管を評価および測定する際には、管と血管構造を区別することが重要です。血管構造は赤い矢印で、管の構造は黒い矢印で示されます。血管構造は、内腔を覆う内皮単層の存在だけでなく、内腔内の赤血球を示す無核性の好酸球構造の存在によっても同定できます。一度習得すれば、組織採取は1動物あたり約15分で完了し、切片染色は約7〜8時間で完了し、すべてが適切に行われれば翌日にスライド画像が撮影されます。これらの手順を試す際には、実験の個々の目標によって特定のステップでの最適化が必要になる場合があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、第2高調波発生やコヒーレントな反ストークスラマン散乱などの他の方法を実行して、組織間質の組成や構造に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、腫瘍生物学などの多くの分野の研究者が、ヒトの疾患や病状の多数の動物モデルにおける組織組織とタンパク質発現パターンを調査する道を開きました。このビデオを見た後、マウスの乳腺を解剖して分離する方法を十分に理解しているはずです。また、対比染色剤の使用を含む、組織切片の免疫組織化学的染色の手順も理解する必要があります。動物やその組織、キシレンやDAB発色剤などの化学物質を扱う作業は非常に危険である可能性があり、これらの手順を実行する際には、適切な飼育訓練や個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

このメソッドは、マウスから乳腺の発達と機能を細かく分析し、評価する方法について説明します。射乳がオキシトシンベースの筋上皮細胞の収縮アッセイを用いて評価される間に切除された乳腺を全部マウントを使用して開発の度合いを評価されています。...

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。...

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

このプロトコルは、非接着性/間葉性乳房上皮細胞からの細胞外小胞（EVs）/エキソソームの精製、定量化および特徴づけ方法、ならびにこれらを用いて乳腺上皮細胞に乳腺形成能を転移させる方法を記載する。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、この細胞特性をEV /エキソソームを摂取する細胞に移入することができる。...

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

げっ歯類における乳腺発達は、典型的には、記述的評価または基本的物理的属性の測定によって評価されている。分枝密度は、客観的に定量することが困難な哺乳類の発達の指標である。このプロトコールは、乳腺分枝特性の定量的評価のための信頼できる方法を記載している。...

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。...

病変同定のための乳腺全体マウントの分割

乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。...

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。...

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

本プロトコルは、授乳中のマウス乳腺の生体内イメージングのための容易な技術を、レーザー走査型共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡法によるものとして記述している。...

乳腺の生体内細胞内顕微鏡検査

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。...

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo...

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

学ぶマウス乳腺全体採取法による組織形態と細胞外マトリックス発現の解析技術。免疫組織化学染色とImageJを用いて、導管構造とタンパク質発現を定量化し、発生生物学や腫瘍研究に応用する方法です。

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

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