サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

この手順の全体的な目標は、ファゴソームを含む無傷で濃縮された細菌を単離することです。この手法は、病原性微生物が宿主細胞に侵入した場合のファゴソームの成熟や抗原処理の変化など、免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ファゴソームを含む高品質の細菌を簡単な手順で、特殊な機器を必要とせずに生産できることです。

この方法に不慣れな個人は、非方法論と比較して技術的に親しみやすいと感じるでしょう。この方法を開発するというアイデアを最初に思いついたのは、細胞内病原体がファゴソームを乗っ取って有利にするメカニズムを研究していたときでした。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるSaray Gutierrezです。

サルモネラ菌チフス菌の培養を開始するには、バクテリアループを使用して、1つの細菌コロニーを5ミリリットルの脳心臓注入ブロスに接種します。次に、懸濁液を摂氏37度のインキュベーターで振とうしながら一晩インキュベートします。この細菌懸濁液の1ミリリットルを翌日、円錐形フラスコで19ミリリットルのBHIブロスに移します。

しながら、摂氏37度のインキュベーターで再度インキュベートします。OD600が1つに達したら、インキュベーターからフラスコを取り出し、培養物を50ミリリットルのチューブに移します。次に、チューブを5400 x Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。

上清を取り除いた後、細菌ペレットを10ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。遠心分離を一度繰り返した後、ペレットを4.9ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、調製したばかりのビオチン結合溶液100マイクロリットルを細菌懸濁液に加えます。

この懸濁液を5本の1.5ミリリットルチューブに分割した後、室温でサーマルブロック内でインキュベートし、350rpmで2時間一定に振とうします。チューブを室温で10分間15, 000 x Gで遠心分離した後、上清を捨てます。さらに2つの遠心分離ステップを行い、ビオチン結合溶液を完全に除去した後、このビオチンコード細菌を1.5ミリリットルチューブ内の1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。

100マイクロリットルのストレプトアビジン結合磁気ビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気ラックに5分間置きます。チューブから溶剤を取り除いた後、チューブを磁気ラックから取り外します。次に、チューブ内に残ったビーズを1ミリリットルのビオチンコード細菌懸濁液で再懸濁します。

チューブをサーモブロック上で室温で1時間インキュベートし、350rpmで振とうします。次に、チューブを磁気ラックに5分間置きます。ピペットを使用して壁に付着しなかった細菌を取り除き、コード化されていない細菌とラベル付けされた新しいチューブに移します。

壁面に磁気ビーズが付着したチューブには、ビオチン・ストレプトアビジンをコードする細菌が入っています。ビオチンストレプトアビジンコード細菌の入ったチューブを磁気ラックから取り出し、1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。チューブを磁気ラックに5分間置いたら、PBSを取り外します。

最後に、洗浄したビオチンストレプトアビジンコード細菌を500マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、チューブにコード細菌として標識します。感染の前日に、10%のFBSを補充したRPMIの6センチメートルの皿で完全に分化したBMDMをプレート化しました。翌日、コード化された細菌懸濁液を摂氏4度で15, 000 x Gで5分間遠心分離します。

上清を取り除いた後、10%のFBSを補給したRPMI培地に細菌ペレットを再懸濁します。BMDMから培地を取り出し、細胞に感染させるためにRPMI培地に5ミリリットルのコード化された細菌懸濁液を追加します。食作用を同期させるには、室温で10分間インキュベートします。

次に、食作用を開始するには、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、皿から培地を取り出し、RPMIで細胞を3回洗浄して、非内在化細菌を除去します。ゲンタマイシン50マイクログラム/ミリリットルに10パーセントのFBSを含むRPMIの10ミリリットルで、非食細胞化細菌を殺すこと。

最後に、感染したBMDMを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で目的の時点までインキュベートします。まず、使用直前にDTTとサイトカラシンBを添加し、メーカーが推奨するようにプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を添加して、必要な量のファゴソーム単離バッファーAを調製します。目的の時点で感染細胞から培地を取り出し、室温に予め加温した滅菌PBSで細胞を洗浄します。

次に、750マイクロリットルのファゴソーム分離バッファーAを皿に加え、氷上で20分間インキュベートします。時々プレートを揺らすことを忘れないでください。次に、250マイクロリットルのファゴソーム単離バッファーBを加え、プレートを揺さぶってバッファーが表面を完全に覆うようにします。

ゴム製の警官を使用して細胞をそっとこすり落とし、皿から細胞を取り出し、事前に冷やした1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、1ミリリットルの注射器を使用して、細胞懸濁液を26ゲージの針に少なくとも15回通過させます。次に、セル懸濁液を磁気ラックに5分間置きます。

磁気ビーズに付着した粒子は、コード化されたS.Typhimuriumを含むファゴソームです。次に、残りの細胞成分を含む懸濁液を、Cytosolとラベル付けされた新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。単離されたファゴソームを含むチューブをラックから取り外し、1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。

チューブを磁気ラックに5分間戻し、PBSを取り外します。このPBSによる洗浄を一度繰り返した後、PBSを除去し、最後に、ファゴソームを含むS.Typhimuriumを必要なバッファーに再懸濁します。共焦点顕微鏡法によるS.Typhimuriumビオチン化の有効性を評価するために、BMDMをビオチンで標識したmCherry S.Typhimuriumに感染させた。

Cy5-ストレプトアビジンによる固定およびインキュベーション後、Cy5-ストレプトアビジン蛍光シグナルにより、ビオチン化の成功が確認されました。このシグナルは、ビオチン化mCherry S.Typhimuriumでのみ観察されましたが、ビオチン化されていないmCherry S.Typhimuriumではシグナルは観察されませんでした。単離されたファゴソームのイムノブロック分析では、ファゴソーム中のチフス菌を発現するmCherryの有意な濃縮が、細胞質画分と比較して

単離されたファゴソームのエンドソームマーカーとリソソームマーカーを使用した免疫ブロック分析では、感染の4時間後に分離されたファゴソームの試験マーカーの濃縮が、感染の30分後と比較して示されました。このプロトコールを黄色ブドウ球菌に適用したところ、黄色ブドウ球菌を発現するGFPのビオチン化が成功することが示されました。一度習得すると、この技術は、研究者が感染のために選択したインキュベーション時間に応じて、約1時間半で行うことができます。

ファゴソームを含む細菌の単離を成功させるためには、緩衝液に指示された濃度が含まれていること、およびプレートが振とうされていることを確認して、細胞が均一にカバーされるようにしてください。また、細胞をこすり落とすときや、細胞懸濁液を針に通すときは優しくしてください。この手順に続いて、プロテオミクスやメタボロミクスなどの他の手法を単離されたファゴソームを用いて実施し、病原性因子が関与する病原体によって引き起こされる変化を研究することができます。