Name: NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ、少量の末梢血と低用量IL-2を用いてCAEBV患者からNKおよびT細胞株を効率的に確立する簡便な方法。この技術は免疫細胞の増殖メカニズムと疾患研究に重要である。

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この仕事だった中国の国立科学財団 (から科学 (KFZD-SW-205)、戦略的な生物資源技術支援システムの中国科学アカデミー (CZBZX-1、ZSSB-004) の中国アカデミーのキーのプロジェクトによっておよび補助金によってサポートされて81401640) 上海自然科学基金 (14ZR1434800)。

本研究は、遺伝学研究所・発生生物学、中国科学院の倫理委員会によって承認され、プロトコル人間福祉機関のガイドラインに従います。
メモ: ワークフローの模式図の図 1を参照してください。
1. CAEBV 患者の PBMC の分離
<ol><li>勾配 (例えば、Ficoll プラーク) による CAEBV 患者の全血の 2 mL からプライマリ PBMC を浄化する遠心分離の製造元の指示に従います。また、雪解けは RPMI 1640 培地と液体窒素から PBMC を凍結しました。</li>
	<li>細胞を染色し、細胞カウンター プレートに懸濁液を転送細胞の濃度と自動化された細胞カウンターと生存率を測定 3 分待つ、18 μ L 細胞懸濁液 2 μ L のトリパン ブルー色素 (0.4%) を追加します。</li>
	<li>2-3 × 106セル/mL の 20% ひと血清 (56 ° C で不活化熱)、2 mM L-グルタミンを含む完全な RPMI 1640 培養液を添加した密度の細胞懸濁液を準備、抗生物質 (100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリン)。24 ウェルの細胞培養皿によくあたり PBMC を懸濁液の 1 mL の種子。</li>
	<li>ウェルあたり 150 U 以上より 2 を追加します。</li>
	<li>37 ° C で 5% CO2インキュベーターで培養皿を配置します。</li>
	<li>2 日目、(200 倍); 顕微鏡下で細胞の形態を観察します。明るく丸い細胞が行き届いています。</li>
</ol>2. 細胞および実行可能なセルを番号の拡大
<ol><li>(200 倍)、顕微鏡下で細胞の形態を観察し、媒体を変更する前に、セルの番号付けによって細胞の成長の条件を監視: 18 μ L 細胞懸濁液にトリパン ブルー (0.4%) の 2 μ L を追加し、セルの濃度を計算 (1.2、参照してください図 2)。</li>
	<li>24 ウェル プレート中の 500 μ L を破棄し、500 μ L の新鮮な完全な文化媒体を追加します。ウェルあたり 150U 以上より 2 を追加します。</li>
	<li>ステップ 2.2 のように週に 2 回媒体を変更します。</li>
	<li>細胞成長曲線 (図 3) を描画します。</li>
	<li>実行可能な細胞の濃度が 5 × 106/mL を超えたら、各ウェルに 1-2 × 106セル/ml の濃度で新しい井戸にセルを分割します。このプロセスは 2-4 週間かかります。</li>
</ol>3. 細胞のフローサイトメトリーによる表現型解析
<ol><li>セルが展開されている場合は、細胞の表現型を決定する 1 × 106細胞を収集します。遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 240 x g細胞 (NK/T 細胞を管の下部に沈殿させる)。</li>
	<li>7 mL の PBS を追加することによって降水量を洗い、上澄みを廃棄します。常温 240 x gで 5 分間遠心します。もう一度繰り返します。</li>
	<li>各管に 200 μ L の血清を追加、よく混合し、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>室温で 5 分間 240 x g で細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、再 1 × 106/mL と冷たい PBSA (PBS+0.2%BSA) で細胞を中断します。5 チューブ、各チューブ 2 × 105セルを含むセルに分割します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 240 × g で遠心分離細胞上澄みを廃棄し、再 PBSA バッファーまたは PBSA 10 μ L PE (または PE Cy7) を含むセルを中断し、10 μ L FITC 標識抗体は、図 4で示されるように氷の上の T または NK の細胞の細胞の受容体を染色します。PBSA バッファーで中断のセルは、ネガティブ コントロールとして使用されます。</li>
	<li>暗闇の中で氷の上の 20-30 分のための抗体を持つ細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>冷たい PBSA で二回セルを洗浄して、300 μ L で細胞を再停止冷たい PBSA。</li>
	<li>流れの cytometer 細胞表現型を分析します。<ol>
<li>「ワークシートを作成する」の状態での流れの Cytometer を設定します。側方散乱 (SSC) 対前方散乱 (FSC) を表示するドット プロットを持つ実験的テンプレートを設定します。</li>
		<li>FSC と SSC の電圧を最適化するアイソタイプ コントロール チューブをロードし、興味のセル人口を妨げることがなくゴミを除去するために FSC のしきい値値を最適化します。FSC、SSC、FITC、PE と PE Cy7 以外のすべてのパラメーターを削除します。</li>
		<li>各 2 カラー解析グループにおけるアイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を用いる補正を実行します。</li>
		<li>サンプルを読み込むし、HLA-DR 対 CD19、セルの異なる人口を示す CD4 対 CD8、CD56 対 CD16、CD3 対 CD16 のドット プロットを作成します。 注: PBMC 負/アイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を使用して補正を行うに使用されました。流れの cytometer で 2 色を蛍光抗体法は、表面マーカーの発現を分析する日常的に使用されました。次の抗体が含まれている: 抗 CD19 PE Cy7 と共役、フィコエ リスリン (PE) と共役 CD3 抗 CD16 かに (FITC)、抗 CD8 抗 CD56 共役抗 CD4 抗 HLA-DR。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 拡大と NK/T 細胞の凍結保存
<ol><li>細胞表現型解析が完了したときは、メディアを変更します。慎重に上澄みの半分を削除し、プレートの底で細胞を触れないでください。セル板に 300 U/mL 以上より 2 を含む新鮮な培地の同じボリュームを追加します。</li>
	<li>培地の半分を変更するセルまで (2.2) として 3 日ごとクラスターは、(図 2) 顕微鏡の下ではっきりと見える。通常、このプロセスは 2-3 週間かかります。</li>
	<li>同じ系統の別の井戸を混合後 24 ウェルのプレートからコート t25 フラスコ培養フラスコにセルを転送します。培地量二重媒体のボリュームまで黄色に変わり、10-15 mL に展開します。150 U/mL の濃度以上より 2 を追加します。</li>
	<li>成長し、2-3 週間後に固定する前に中の 24 時間を変更するときセル質量を肉眼で観察できます。細胞カウンター細胞濃度を測定します。</li>
	<li>240 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心し、再 5 10 106セル/mL 90% 牛胎児血清と 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む冷凍原液で倍の密度で細胞ペレットを中断します。-80 ° C に毎分 1 ° C の割合で凍結し、液体窒素に直接転送。</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
<li>Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronic+mononucleosis+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The chronic mononucleosis syndrome.</a> J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphomas+containing+Epstein-Barr+viral+DNA+in+patients+with+chronic+Epstein-Barr+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections.</a> N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).</li>
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<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
<li>Tabata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroa+vacciniforme-like+lymphomatoid+papulosis+in+a+Japanese+child%3A+a+new+subset%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset.</a> J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).</li>
<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z. と X.Z.、X.C.、共同発明者に NK/T 細胞と本研究で確立された細胞株を確立するためのこの方法の潜在的な用途をカバーする特許出願中。D.Z.、X.Z.、および X.C. は、この仕事の金融利害関係を宣言しません。残りの著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。

このプロトコルでは NK/T CAEBV 患者の全血から細胞を確立するための新たな手法を開発しました。既存の手法と比較して, この方法の主要な利点はそのシンプルさとその要件への血液の量が少ないの高い成功率と細胞生存率の良い条件を発揮します。さらに、eb ウイルスの定量法として、事前に潜伏感染細胞の種類消費より多くの血液と培養開始前に、の時間を考慮せず PBMC を培養 NK/T 細胞株を確立できます。また、細胞を分析して細胞ライン設立後フローサイトメトリーによる細胞の異なった表現型を浄化することが。その上、メソッドは以上より 2 の低用量を使用し、フィーダー細胞を必要としません。この方法で 8 CAEBV 患者から 7 細胞を開発し、1 ヶ月内でそれらを凍結しました。細胞ラインに開発されていないものは生きている重要な増殖なし 5 ヶ月以上維持することができ、この背後にある理由は、さらに調査を必要があります。
細胞の成長は、以前レポート20,21; と一致している遺伝...

エプスタインバー ウイルス (EBV) は、ユビキタスと感染 B 細胞だけでなく、T とナチュラル キラー (NK) 細胞、NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患 (LPD) とリンパ腫/白血病、eb ウイルス関連血球貪食などの原因となります。症候群、hydroa 水疱症のようなリンパ腫、胃癌 NK/T 細胞リンパ腫、鼻型、アグレッシブ NK 細胞白血病1,2,3。これらの中では重度の慢性アクティブ EBV (SCAEBV) 疾患、東アジアを中心にインシデントであるし、EBV 感染 T または NK 細胞4,5,6,のクローン性増殖によって引き起こされる LPD にいえる7、伝染性単核症 (IM) に存在する明らかな免疫不全なし-高 eb ウイルス DNA と同様に、持続的または反復的に, 発熱やみ、リンパ節腫脹、肝機能障害を含む症状でロードのような末梢血8,9。CAEBV 患者は、予後10,11, とその病因を持ち、EBV の役割は明確。したがって、細胞由来の NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫は、白血病の発生率が高いと NK または T 細胞の増殖との関係を誘発する eb ウイルスの機構解明細胞モデルとして非常に役に立つかリンパ腫。
日には、さまざまなテクニック12,13,14,15,16のいくつかの細胞株が設けられています。人間 NK 細胞ライン、NK-イースは、NK 細胞リンパ腫/白血病からフィーダーと 20U mL15あたりの濃度以上より 2 の存在下で、マウス間質細胞ラインと共培養によって設立されました。KAI3 は厳しい蚊刺アレルギー患者または自家リンパ芽球様細胞株 (LCL) と SCAEBV から別に樹立 NK 細胞フィーダー細胞と 100U/mL16以上より 2 の追加として、eb ウイルスによる B 細胞。SNK6 と SNT8 は、以上より 2 (700U/mL)12の高用量を追加することによって鼻 NK/T 細胞リンパ腫患者の腫瘍組織から派生しました。同様の手法で SNK 1 セルから CAEBV 患者の PBMC 培養 T 細胞を除去して 700U/mL 以上より 213,17を追加します。SNT13 と SNT15 は、cd 4 + および cd 8 + 細胞18の取り外しによって設立されました。これまでのところ、EBV-NK/T LPD 患者から他の T 細胞と NK の細胞株は、すべてこのメソッド19開発されました。
上記の既存の方法の欠点は、ためにクリニックでは非常に挑戦的な高用量 IL-2 や NK/T 細胞の浄化、限り 10 mL 全血の使用率の要件フィーダー細胞の雇用を含めるどの種類の細胞その EBV 潜伏を確認の必要性は、文化を始める前に感染します。主にアジアの子供たちに発生する CAEBV と、10 mL の血液はすべての地域で取得する容易ではないです。本研究では、フィーダー細胞せず rhIL2 の低用量と血中の 2 mL の量を使って CAEBV 患者 PBMC を培養 NK および/または T 細胞ラインを確立する高い成功率を持つ新しい単純なメソッドを開発しました。このメソッドの結果は、その高い効率性と時間の節約を証明しています。

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td></td><td>560944 FACS用</td></tr>抗体 <tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD FACS</td>用<td>555346</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD FACS</td>用<td>557086</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>FACS用抗体</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>FACS用555406</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td></td><td>FACSに対する556647抗体</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>FACSに対する抗体</td></tr><tr>ヒト<td>IL-2</td><td>ロシュ</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>三洋遠心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分離</td><td>機 Techcomp</td><td>CT6T</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養クラスター</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>3524</td><td>ポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>25cm2 細胞培養フラスコ</td><td>ネスト</td><td>707001</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>細胞培地の成分</td></tr><tr><td>RPMI 培地 1640</td><td>寿命</td><td>22400089</td><td>細胞培地用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>アムレスコ</td><td>374</td><td>細胞培地の成分</td></tr><tr><td>100 x ストレプトマイシン ペニシリン溶液 BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>細胞培地の成分</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>リンパ球のin vitro単離用</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>細胞</td></tr><tr><td>の凍結用フローサイトメーター</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>soft ware</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva soft ware</td><td>FACS analysis</td></tr></tbody></table>

nk と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から t 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

リンパ腫またはリンパ増殖性症候群の患者から NK/T 細胞ラインを確立する記述されていた方法の数。これらのメソッドは、フィーダー細胞、血液の限り 10 ml 精製 NK または T 細胞または高用量 IL-2 の採用。本研究では、組換えヒト IL-2 (以上より 2)、添加と周辺機器を培養 T 細胞と NK 行血単核球 (PBMC) の確立する強力かつシンプルな戦略と手法を提案し、2 ml 全血の少しを使用しています。細胞は 2 週間で簡単に増殖できるし、3 ヶ月以上維持します。この方法では、高い成功率での 7 NK または T 細胞ラインが設けられています。このメソッドは、単純な信頼性、および CAEBV または NK/T 細胞リンパ腫のより多くのケースから細胞株を確立することに適用できます。

3 日間は、細胞株の確立の間に文化、多形性細胞 (図 2) が表示されますを開始します。7 日後セルにつれてすぐに数と細胞の生存率が高い (図 3) で増加しています。細胞の小さなクラスターが成長、細胞濃度を超えることは 3-6 × 106時 10-14 日後明確に表示されます。この期間で細胞培養プレートの分割 2 つまたは 3 つの井戸拡張する必要があります。一ヶ月後、一度セル数に達すると 3-5 × 107カウントは保全のために十分に高い。
もう一つの重要な問題は、細胞が正常に培養されているとき表現型を決定します。我々 の結果はセルにつれ 3 ヶ月以上良好な状態で T (L196) と NK (M296) 細胞を (図 4)、上...

CAEBV 患者から NK と T 細胞クローンを取得するための簡単な方法は、IL-2 の低用量末梢血の少量と高効率開発されました。

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

この手順の全体的な目標は、CAEBV患者からNKまたはT細胞株を取得することであり、これはこの致命的な疾患に関する研究に大きな意義を持っています。この方法は、細胞増殖上の生VBVの研究、NK/T細胞増殖を阻害する阻害剤のスクリーニングなど、CAEBVのメカニズムに関する研究のためのNKまたはT細胞株を取得するのに役立ちます。この技術の主な利点は、CAEBV患者からNKまたはT細胞株を確立するために、少量の末梢血と低用量の鉄2のみを必要とする非常にシンプルで効率的であることです。一般に、この方法に不慣れな個体は、培養の最初の2週間での細胞生存が不確実であり、この方法では初期培養の細胞増殖を決定する方法が示されるため、苦労します。この方法を最初に思いついたとき、ヒト血清鉄2には最大2週間PBMCを含めることができることがわかりました。この方法のデモンストレーションは、細胞の形状と増殖の原因を示すため、重要であることを示しました。そして、その細胞の伸長とYバー細胞の番号付けこの手順を開始するには、CAEBV患者の全血の2ミリリットルから一次PBMCを勾配遠心分離によって精製します。あるいは、RPMI-1640培地を用いて液体窒素から凍結保存されたPBMCを解凍します。次に、18マイクロリットルの細胞懸濁液に0.4%トリパンブルーを2マイクロリットル加えて細胞を3分間染色し、懸濁液をセルカウンタープレートに移し、自動セルカウンターで細胞の濃度と生存率を測定します。細胞懸濁液を1ミリリットルあたり10〜6分の1の細胞の2〜3倍の密度で調製し、20%のヒト血清、2ミリモルのL-グルタミン、および抗生物質を含む完全なRPMI-1640培地を補充します。その後、ウェルあたり1ミリリットルのPBMC懸濁液を24ウェルの細胞培養プレートに播種します。次に、各ウェルにミリリットルあたり150ユニットrhIL-2を追加します。培養プレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。2日目は、顕微鏡で200倍の倍率で細胞の形態を観察します。細胞は明るく丸いとき、良好な状態にあります。このステップでは、0.4%トリパンブルーの2マイクロリットルを18マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、細胞の濃度を計算します。次に、細胞の形態を観察し、培地を交換する前に細胞に番号を付けることで細胞の増殖状態を監視します。細胞の形態と状態を監視することが重要です。細胞が生存しているかどうかは、多型細胞と培養初期における細胞の状態によって判断できます。その後、24ウェルプレートの各ウェルから500マイクロリットルの培地を取り出し、それに500マイクロリットルの新鮮な完全培地を加えます。次に、各ウェルにミリリットルあたり150ユニットrhIL-2を追加します。週に2回、媒体を交換してください。細胞増殖曲線をプロットします。生細胞濃度が10〜6細胞/ミリリットルの5倍を超える場合は、各ウェルで10〜6細胞/ミリリットルの1〜2倍の濃度で細胞を新しいウェルに分割します。このプロセスには2〜4週間かかります。細胞が増殖したら、10〜6分の1の細胞を1回採取して、細胞株の表現型を決定します。室温で240倍gで5分間遠心分離し、NKNT細胞を沈殿させます。その後、上清を捨て、7ミリリットルのPBSを加えて沈殿物を洗います。室温で240時間gで5分間遠心分離します。手順をもう一度繰り返し、次に各チューブに200マイクロリットルのヒト血清を加え、よく混合し、室温で10分間インキュベートし、細胞を室温で5分間240回gで遠心分離します。上清を捨て、冷たいPBSAで1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を1回で細胞を再懸濁します。続いて、細胞を5本のチューブに分割し、各チューブには10〜5個の細胞を2倍含みます。その後、細胞を240倍gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、10マイクロリットルのPEおよび10マイクロリットルのFITC標識抗体を含むPBSAバッファーまたはPBSAで細胞を再懸濁し、T細胞またはNK細胞の細胞受容体を氷上で染色する。PBSAバッファーで懸濁した細胞は、ネガティブコントロールとして使用されます。次に、細胞を抗体と混合して、暗所の氷上で20〜30分間インキュベートします。細胞を冷PBSAで2回洗浄し、フローサイトメーターで分析する前に、細胞を300マイクロリットルの冷PBSAで再懸濁します。細胞表現型解析が終了したら、上清の半分を慎重に取り除き、プレート下部の細胞に触れないようにします。rhIL-2を含む新鮮な培地を同量の新鮮培地を1ミリリットルあたり300単位でプレートに加え、細胞クラスターが顕微鏡ではっきりと見えるまで、培地の半分を3日ごとに交換します。その後、同じ系統の異なるウェルを混合した後、細胞を24ウェルプレートからT-25培養フラスコに移します。培地の容量が10〜15ミリリットルに拡大するまで、培地が黄色に変わるため、培地の量を2倍にします。その後、1ミリリットルあたり150単位の濃度のrhIL-2をそれに加えます。細胞塊を肉眼で観察できる2〜3週間の成長後、凍結の24時間前に培地を交換してください。セルカウンターで細胞濃度を測定します。次いで、細胞懸濁液を240倍gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを1ミリリットル当たり10〜6細胞の5倍から10倍の密度で、ウシ胎児血清90%およびDMSO10%を含有する凍結ストック溶液で再懸濁する。1分間に1°Cからマイナス80°Cまで冷凍し、そのまま液体窒素に移します。細胞株の樹立中に3日間培養すると、多型細胞が現れ始めます。7日後、細胞の数と生存率の両方が高い速度で増加したため、細胞は急速に成長します。細胞の小さなクラスターは、細胞の濃度が10〜6分の3〜6倍を超える10〜14日の成長後にはっきりと見えます。この期間では、培養プレートの2つまたは3つのウェルに分割して細胞を増殖させる必要があります。約1か月後、細胞数が10倍から7分の1の3倍から5倍に達すると、カウントは保存するのに十分な量になります。もう一つの重要な問題は、細胞が成功裏に培養された後の表現型を決定することです。その結果、T細胞とNK細胞は上記の方法で培養でき、細胞が良好な状態で3ヶ月以上成長したため、この技術で細胞株を樹立できることが示されました。この方法、この手法は、さらに多くのことを行うことができます。適切に実行するのは簡単です。この手順を試行する際には、PBMCの変動性を維持することを覚えておくことが重要です。この手順では、MTTアッセイキット8のようなどちらの方法も実施して、養子免疫療法に使用できるNK細胞株またはT細胞株の毒性などの追加の質問に答えることができます。各開発の後、この技術は、CAEBVの分野の研究者が細胞モデルシステム内の手術疾患に関与するEBV関連NK/Tのメカニズムを探求するための道を開きます。このビデオを見れば、このプロトコルに従ってNK細胞株とT細胞株を拡大させる方法についてよく理解できるはずです。病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する場合は常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

我々は、EBウイルスを用いて形質転換B細胞株を生成する方法を説明します。我々はまた、感染3日後には早くも変換を受けることを運命づけB細胞を識別することができる新たなアッセイを示しています。...

Epstein - Barrウイルスの成長形質転換リンパ芽球様細胞株の樹立

ここでは、最初の良い製造基準（GMP）に準拠した臍帯血、主にナイーブT細胞のソースからウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を製造する方法を説明します。...

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV...

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。...

Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。...

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。...

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8+...

感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離

このプロトコルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテートでウイルス溶解サイクルを誘導する際に、ヒトP3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離することを可能にします。続いて、ウイルス調製物からDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供してウイルス粒子濃度を定量化する。...

P3HR1細胞株からのエプスタインバーウイルスの単離と定量

学ぶ、少量の末梢血と低用量IL-2を用いてCAEBV患者からNKおよびT細胞株を効率的に確立する簡便な方法。この技術は免疫細胞の増殖メカニズムと疾患研究に重要である。

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

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