NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

この手順の全体的な目標は、CAEBV患者からNKまたはT細胞株を取得することであり、これはこの致命的な疾患に関する研究に大きな意義を持っています。この方法は、細胞増殖上の生VBVの研究、NK/T細胞増殖を阻害する阻害剤のスクリーニングなど、CAEBVのメカニズムに関する研究のためのNKまたはT細胞株を取得するのに役立ちます。この技術の主な利点は、CAEBV患者からNKまたはT細胞株を確立するために、少量の末梢血と低用量の鉄2のみを必要とする非常にシンプルで効率的であることです。

一般に、この方法に不慣れな個体は、培養の最初の2週間での細胞生存が不確実であり、この方法では初期培養の細胞増殖を決定する方法が示されるため、苦労します。この方法を最初に思いついたとき、ヒト血清鉄2には最大2週間PBMCを含めることができることがわかりました。この方法のデモンストレーションは、細胞の形状と増殖の原因を示すため、重要であることを示しました。

そして、その細胞の伸長とYバー細胞の番号付けこの手順を開始するには、CAEBV患者の全血の2ミリリットルから一次PBMCを勾配遠心分離によって精製します。あるいは、RPMI-1640培地を用いて液体窒素から凍結保存されたPBMCを解凍します。次に、18マイクロリットルの細胞懸濁液に0.4%トリパンブルーを2マイクロリットル加えて細胞を3分間染色し、懸濁液をセルカウンタープレートに移し、自動セルカウンターで細胞の濃度と生存率を測定します。

細胞懸濁液を1ミリリットルあたり10〜6分の1の細胞の2〜3倍の密度で調製し、20%のヒト血清、2ミリモルのL-グルタミン、および抗生物質を含む完全なRPMI-1640培地を補充します。その後、ウェルあたり1ミリリットルのPBMC懸濁液を24ウェルの細胞培養プレートに播種します。次に、各ウェルにミリリットルあたり150ユニットrhIL-2を追加します。

培養プレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。2日目は、顕微鏡で200倍の倍率で細胞の形態を観察します。細胞は明るく丸いとき、良好な状態にあります。

このステップでは、0.4%トリパンブルーの2マイクロリットルを18マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、細胞の濃度を計算します。次に、細胞の形態を観察し、培地を交換する前に細胞に番号を付けることで細胞の増殖状態を監視します。細胞の形態と状態を監視することが重要です。

細胞が生存しているかどうかは、多型細胞と培養初期における細胞の状態によって判断できます。その後、24ウェルプレートの各ウェルから500マイクロリットルの培地を取り出し、それに500マイクロリットルの新鮮な完全培地を加えます。次に、各ウェルにミリリットルあたり150ユニットrhIL-2を追加します。

週に2回、媒体を交換してください。細胞増殖曲線をプロットします。生細胞濃度が10〜6細胞/ミリリットルの5倍を超える場合は、各ウェルで10〜6細胞/ミリリットルの1〜2倍の濃度で細胞を新しいウェルに分割します。

このプロセスには2〜4週間かかります。細胞が増殖したら、10〜6分の1の細胞を1回採取して、細胞株の表現型を決定します。室温で240倍gで5分間遠心分離し、NKNT細胞を沈殿させます。

その後、上清を捨て、7ミリリットルのPBSを加えて沈殿物を洗います。室温で240時間gで5分間遠心分離します。手順をもう一度繰り返し、次に各チューブに200マイクロリットルのヒト血清を加え、よく混合し、室温で10分間インキュベートし、細胞を室温で5分間240回gで遠心分離します。

上清を捨て、冷たいPBSAで1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を1回で細胞を再懸濁します。続いて、細胞を5本のチューブに分割し、各チューブには10〜5個の細胞を2倍含みます。その後、細胞を240倍gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、10マイクロリットルのPEおよび10マイクロリットルのFITC標識抗体を含むPBSAバッファーまたはPBSAで細胞を再懸濁し、T細胞またはNK細胞の細胞受容体を氷上で染色する。

PBSAバッファーで懸濁した細胞は、ネガティブコントロールとして使用されます。次に、細胞を抗体と混合して、暗所の氷上で20〜30分間インキュベートします。細胞を冷PBSAで2回洗浄し、フローサイトメーターで分析する前に、細胞を300マイクロリットルの冷PBSAで再懸濁します。

細胞表現型解析が終了したら、上清の半分を慎重に取り除き、プレート下部の細胞に触れないようにします。rhIL-2を含む新鮮な培地を同量の新鮮培地を1ミリリットルあたり300単位でプレートに加え、細胞クラスターが顕微鏡ではっきりと見えるまで、培地の半分を3日ごとに交換します。その後、同じ系統の異なるウェルを混合した後、細胞を24ウェルプレートからT-25培養フラスコに移します。

培地の容量が10〜15ミリリットルに拡大するまで、培地が黄色に変わるため、培地の量を2倍にします。その後、1ミリリットルあたり150単位の濃度のrhIL-2をそれに加えます。細胞塊を肉眼で観察できる2〜3週間の成長後、凍結の24時間前に培地を交換してください。

セルカウンターで細胞濃度を測定します。次いで、細胞懸濁液を240倍gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを1ミリリットル当たり10〜6細胞の5倍から10倍の密度で、ウシ胎児血清90%およびDMSO10%を含有する凍結ストック溶液で再懸濁する。1分間に1°Cからマイナス80°Cまで冷凍し、そのまま液体窒素に移します。

細胞株の樹立中に3日間培養すると、多型細胞が現れ始めます。7日後、細胞の数と生存率の両方が高い速度で増加したため、細胞は急速に成長します。細胞の小さなクラスターは、細胞の濃度が10〜6分の3〜6倍を超える10〜14日の成長後にはっきりと見えます。

この期間では、培養プレートの2つまたは3つのウェルに分割して細胞を増殖させる必要があります。約1か月後、細胞数が10倍から7分の1の3倍から5倍に達すると、カウントは保存するのに十分な量になります。もう一つの重要な問題は、細胞が成功裏に培養された後の表現型を決定することです。

その結果、T細胞とNK細胞は上記の方法で培養でき、細胞が良好な状態で3ヶ月以上成長したため、この技術で細胞株を樹立できることが示されました。この方法、この手法は、さらに多くのことを行うことができます。適切に実行するのは簡単です。

この手順を試行する際には、PBMCの変動性を維持することを覚えておくことが重要です。この手順では、MTTアッセイキット8のようなどちらの方法も実施して、養子免疫療法に使用できるNK細胞株またはT細胞株の毒性などの追加の質問に答えることができます。各開発の後、この技術は、CAEBVの分野の研究者が細胞モデルシステム内の手術疾患に関与するEBV関連NK/Tのメカニズムを探求するための道を開きます。

このビデオを見れば、このプロトコルに従ってNK細胞株とT細胞株を拡大させる方法についてよく理解できるはずです。病原体を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する場合は常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。