内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル
January 1st, 2018
このプロトコルの目的は、decellularize し、めしマウス蝸牛組織工学用の足場として利用する効果的な方法を示すことです。
この手順の全体的な目標は、内耳組織工学アプリケーション用の足場を使用するために、マウス蝸牛を脱細胞化および脱灰する効果的な方法を実証することです。この方法は、3D蝸牛や細胞外マトリックスのさまざまな成分が幹細胞の分化にどのように影響するかなど、聴覚および組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が細胞が蝸牛の細胞外マトリックスと直接相互作用して感覚上皮を形成する方法を研究できることです。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストの説明のみに基づいて骨の時間的分離および細胞増殖装置を正しく視覚化するのが難しい場合があるため、非常に重要です。この手順を開始するには、鋭利な手術用ハサミを使用して、中矢状面で頭蓋骨を二等分します。次に、頭蓋骨から脳組織を取り出します。
次に、頭蓋骨の内側にある聴覚神経根と前庭神経根、および外部からの外耳道の存在を通じて側頭骨を特定します。頭蓋骨を慎重に切り取り、頭蓋骨の残りの部分から側頭骨を分離します。その後、細い鉗子を耳道の開口部に約5ミリメートル挿入して、先端が蝸牛に穴を開けるリスクがないようにします。
ボーラの骨をそっと折って骨折させます。細い鉗子を使用して、蝸牛の骨迷路を露出させる側頭骨からボーラの残りの部分をこじ開けます。その後、蝸牛の楕円形と円形の窓を上に向けて、側頭骨をPBSに沈めます。
極細の鉗子を使用して、アブミ骨を通過するアブミ骨動脈を取り除きます。次に、動脈が通るアブミ骨のアーチに極細鉗子の先端を1つ挿入し、アブミ骨を繊細に持ち上げます。その後、楕円形と円形の窓に穴を開けます。
その後、PBSで満たされた28.5ゲージのシリンジに接続されているチューブを楕円形の窓の上に配置します。PBS 中の 10% 抗生物質 - アチミコシンと 10% ペニシリン - ストレプトマイシンの 2 mm を蝸牛を通して 5 分間かけて 2 mm を多量に塗布し、外リンパ液を除去します。次に、残っている筋肉組織と骨片をすべて取り除いて廃棄します。
脱細胞化には、トランスファーピペットを使用して蝸牛をピペットにゆっくりと引き込み、切断された端を数ミリメートル通過させます。次に、蝸牛を1%SDS溶液で満たされたシンチレーションバイアルに排出します。トランスファーピペットを使用して、脱イオン水中の1%SDSを2ミリリットルの蝸牛を通してシンチレーションバイアルに循環させます。
シンチレーションバイアルをローテーターに入れ、室温で72時間10RPMで回転させます。72時間にわたって24時間ごとに新しい1%SDS溶液と交換し、溶液の交換中に蝸牛を空気にさらさないように注意してください。.その後、蝸牛を同じシンチレーションバイアルで3回、DI水でそれぞれ30分間洗浄します。
この段階で、蝸牛は脱細胞化する必要があります。脱灰のために、シンチレーションバイアルから残りのDI水を取り除き、蝸牛を水没させるのに十分な量を残します。脱灰を開始するには、蝸牛を含むシンチレーションバイアルに5ミリリットルの10%EDTAおよびDI水を加えます。
トランスファーピペットを使用して、脱イオン水中の10%EDTAを2ミリリットルの蝸牛を通してシンチレーションバイアルに循環させます。シンチレーションバイアルをローテーターに戻し、シンチレーションバイアルを室温で72時間10RPMで回転させます。10%EDTA溶液は、72時間にわたって24時間ごとに交換します。
溶液を交換するときは、蝸牛が空気にさらされないように注意してください。次に、蝸牛をPBSでそれぞれ2時間、3回すすぎます。この段階で、蝸牛は脱灰する必要があります。
細胞を注入する前に、脱細胞化および脱灰蝸牛を5%二酸化炭素、摂氏37度の細胞培養インキュベーターで最低1時間インキュベートすることから始めます。蝸牛を大量に増やすには、次に各蝸牛にMSCGMを一滴加えて、蝸牛が乾燥するのを防ぎます。トランスファーピペットを使用して、新しい24ウェルプレートに移します。
超微細な鉗子を使用して、楕円形と円形の窓が上を向くように蝸牛を繊細に向き合わせます。次に、チューブを接続した滅菌済みの28.5ゲージインスリンシリンジを使用して、再懸濁したヒトウォートンゼリー細胞を0.2ミリリットル引き出します。その後、滅菌した細い鉗子を使用して、楕円形の窓の上にチューブを配置します。
蝸牛を繊細かつゆっくりと、0.2ミリリットルの再懸濁したヒトウォートンゼリー細胞で5分間かけて大量に処理します。この豊富なステップは重要です。蝸牛を介した液体の大量供給が成功すると、このプロトコルの結果に大きく影響します。
滲出後、0.8ミリリットルの37°Cの予熱したMSCGMをウェルを含む蝸牛に加えて、総容量を1ミリリットルにします。蝸牛ごとに手順を繰り返します。毎回新しい注射器とチューブを使用します。
ふんだんに使用した蝸牛を摂氏37度の細胞培養インキュベーターに入れ、培地を週に3回交換します。ここに示されているのは、細胞を注入せずにマウス蝸牛の脱細胞化と脱灰が成功したことです。全体として、蝸牛の解剖学的構造は保存されており、ボイド
は残されており、汚れはありません。これは、蝸牛足場上でヒトウォートンゼリー細胞を成功裏に培養した代表的な結果です。蝸牛全体と骨の外側の表面に豊富なダッピー染色が観察されます。個々のターンを詳しく調べると、微細な蝸牛構造は脱細胞化と脱灰後も保存され、注入された細胞は天然の蝸牛細胞外マトリックスに付着したり、相互作用したりしていることが明らかになります。
その後の細胞培養における脱細胞化も、H&E染色を用いて調査しました。脱細胞化した蝸牛には、天然の蝸牛の細胞は含まれていませんでしたが、細胞外マトリックスが残っているため、コルチ器官の解剖学的構造の大部分を保持しています。培養細胞に注入されたものは、コルチの器官を通じて観察でき、脱細胞化された細胞外マトリックスと相互作用します。
一度習得すると、蝸牛がすでに準備され、必要なツールが適切に配置されている場合、脱細胞化蝸牛への細胞の大量化には約10〜15分かかることがあります。この手順を試みるときは、蝸牛は壊れやすいため、注意して取り扱うことが重要です。また、滲出時には気泡が流体の流れを妨げるため、蝸牛への空気の混入を避けることも重要です。
この一般的な手順は、他の種の蝸牛に適用でき、さまざまな種類の細胞を注入することもできます。特定の脱細胞化と脱灰の時間は異なる可能性がありますが、基本的な概念は同じままです。ミネソタ大学のピーター・サンティ博士は、最初にこのプロトコルのために修正した脱細胞化技術を開発しました。
私たちは、蝸牛足場での技術と細胞培養を他の組織エンジニアが利用できるようにしたいと考えています。このビデオを見た後、培養実験で使用するための細胞を注入する前に、側頭骨をうまく分離、脱細胞化、および脱灰する方法を十分に理解しているはずです。
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概要
このプロトコルは、組織工学応用のためのスキャフォールドとして使用するためのマウスの蝸牛の脱細胞化と脱カルシウム化の効果的な方法を示しています。この技術により、研究者は細胞と蝸牛の細胞外マトリックスの相互作用を研究することができ、これは感覚上皮形成を理解する上で重要です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 聴覚研究
- 細胞間相互作用
背景
- 脱細胞化と脱カルシウム化はスキャフォールドの作成に不可欠です。
- 蝸牛の構造の理解は内耳研究にとって重要です。
- 細胞外マトリックスは幹細胞の分化に影響を与えます。
- 視覚的方法は複雑な手順の理解を助けます。
研究の目的
- 蝸牛スキャフォールド準備のための信頼できる方法を提供すること。
- 蝸牛細胞間相互作用の研究を促進すること。
- 聴覚と組織工学分野における知識を進歩させること。
使用された方法
- 頭蓋から側頭骨の分離。
- 蝸牛の脱細胞化。
- スキャフォールド準備のための脱カルシウム化プロセス。
- 手順の明確性のための視覚的デモンストレーション。
主要な結果
- マウスの蝸牛の成功した脱細胞化と脱カルシウム化。
- 細胞-細胞外マトリックス相互作用の理解の向上。
- 感覚上皮形成の研究のための改良された方法。
- 視覚的補助が大幅に手順の理解を向上させます。
結論
- この方法は内耳研究のための貴重なツールを提供します。
- これは蝸牛スキャフォールドにおける幹細胞の挙動を研究する道を開きます。
- 視覚的デモンストレーションは複雑な生物学的手順にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
