Name: 内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶマウス蝸牛の脱細胞化・脱灰化プロトコル。内耳組織工学用スカフォールドを作成し、細胞と蝸牛細胞外基質の相互作用を研究する方法です。感覚上皮形成のメカニズム解明に有用です。

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現在のプロジェクトは、概念資金のカンザス大学証明書によって賄われていた。我々 感謝したい看護スタッフ院長 (カンザスシティ、カンザス) で取得の蝸牛文化を支援するためひと臍帯やデビッド ・ ヨルゲンセンのことで私たちを支援のため。

カンザス大学医療センター (院長) で承認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のプロトコル (御急ぎでなかったら、#2014-2234) によると、動物の安楽死を含めたすべての処理を行った。
注: HWJCs は、インフォームド コンセントを提供される患者が寄贈したひと臍帯から分離した、標本 (区 IRB #15402) カンザス大学人間科目委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されました。
1. 側頭骨収穫と蝸牛の分離
<ol>
	<li>外科はさみの鋭いペアで頭蓋骨と第一頚椎の間に切断によって適切に安楽死させた、15 週齢マウスの首をはねるし、(図 1 a) を消毒する 70% エタノールで頭をスプレーします。</li>
	<li>外科はさみ (図 1 bの-C破線) の同じシャープな対を用いた正中面で頭蓋骨を二等分します。</li>
	<li>鉗子 (図 1の矢印) のペアを使用して頭蓋骨から脳組織を削除します。</li>
	<li>存在の聴覚と前庭神経根 (図 1E-F矢印) 頭蓋骨と (図の矢印 1f) 外から外耳道の奥の頭骨を識別します。頭蓋骨 (図 1) の残りの部分から側頭骨を分離する頭蓋骨を慎重にカットします。 注: いくつかのインスタンス可能性があります可能である繊細な加工を必要とせず頭骨から頭蓋骨の周囲の骨を詮索します。</li>
	<li>ヒントは蝸牛に穴をあけるリスクはないので、外耳道 (図 1 H)、約 5 mm の開口部に微細鉗子を挿入します。優しくこじ開ける胞 (図 1 H、トップの赤斜線領域) の骨骨折 (1I を図、赤い点線線) ので。 注: 必要に応じて、解剖顕微鏡役立つ可能性がありますこのプロセスの正確な配置や楽器の操作を確保するため。</li>
	<li>微細鉗子を使用すると、(図 1 j, 赤いブラケット) 蝸牛の骨迷路の公開側頭骨からブラの残りの部分で詮索離れて。</li>
	<li>シャーレの頭骨を保持するために十分な大きさの場所 (例えば、30 mm 以上)、解離性の下にあるビューのフィールドを対象範囲し、満タンで十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 側頭骨 (例えば1、0.5 mL) をカバーします。</li>
	<li>ブラ直面している蝸牛の楕円形や円形の窓が PBS で削除と側頭骨が水没します。 注: 前庭系を操作して定位 (1I を図と図 2 b) 蝸牛の機能のためのハンドルとしても優れていますと、蝸牛から前庭系の除去する、必要はありません。</li>
	<li>鉗子の超微細のペアを使用して、あぶみ骨を通過するアブミ骨動脈を削除します。</li>
	<li>動脈渡される、アブミ骨のアーチを超微細鉗子の先端を挿入し、繊細な上向きあぶみ骨を持ち上げます。縫合のアブミ骨は卵円窓から持ち上げる必要があります。</li>
	<li>超微細鉗子の先端を使用して、楕円の穴をあけるし、windows のラウンドします。</li>
	<li>28.5 ゲージ注射器とチューブを充填 1 × PBS を使用する (内側直径 0.28 mm、外径 0.61 mm) 管の楕円形の窓を置きます、接続されている (図 2 a -B)。 注: 管の開口部は、正確な配置を確保するため支援超微細鉗子を使用して操作できます。<ol>
		<li>各蝸牛に新鮮な注射器とチューブを使用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 mL の 10% 抗生物質抗真菌薬 (対策) と 10% ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン-連鎖球菌) PBS で蝸牛の 5 分以上を外リンパを削除するを灌流します。あまりにも多くの圧力で速すぎる灌蝸牛内微細構造に損傷を与えます。 注: 蝸牛を介して流体を灌流して手で注射器を手動で運転が効果的な灌流ポンプを代替として使用できます。<ol>
		<li>灌手動で場合は、側頭骨の前庭部分をつかんで灌蝸牛 (図 2 a) を安定させるために鉗子を自己終了の罰金ペアを使用します。 注意: 必須ではありませんが、これは両手を自由に楽器を処理を残します1 つの手はチューブを配置できる他、注射器 (図 2 a) を運転できる適切に (図 2 b)。</li>
		<li>このステップから転送、空気に不必要に蝸牛を公開しないように注意してください。流体の循環をブロック流体の空間に空気の泡を導入、蝸牛内の微細損傷さらに乾燥します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>削除し、残った微細鉗子を用いた筋肉組織や骨フラグメントを破棄します。</li>
	<li>必要に応じて、抗生物質溶液ごと 48 時間の定期的な変更で 7 日まで 10% 対策で PBS で 10% ペン連鎖球菌性ソリューション 4 ° C で分離の蝸牛を格納します。</li>
</ol>
2. 蝸牛処理
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>各蝸牛の塗りつぶし 1% ナトリウム ドデシルと 20 mL ガラス シンチレーション バイアルの硫酸塩 (SDS) 水溶液のイオン (DI) の水があり、蝸牛を decellularize するために使用。</li>
		<li>開口部は十分な大きさを通過する蝸牛のかみそりの刃を使用してプラスチック製の 7 mL 転送ピペットの先端をカットします。</li>
		<li>転送ピペットを使用して、ゆっくりと引いて、蝸牛ピペットにのでそれは数ミリでカットオフ端を渡します。</li>
		<li>1 %sds ソリューションいっぱいシンチレーション バイアルに蝸牛を追放します。</li>
		<li>転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛 (DI) 脱イオン水に 1 %sds の 2 mL を循環します。</li>
		<li>、ローテーターにシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。<ol>
			<li>72 時間の期間にわたって、1 %sds ソリューションすべての 24 h を変更します。決して空気に蝸牛を公開する SDS を変更するとき注意してください。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>3 回の DI 水で各 30 分の蝸牛を洗います。</li></ol></li></ol>SDS 料金; 同じシンチレーション バイアルの洗浄を行うこの段階では、蝸牛が脱です。
	
	
	<li>脱灰
	<ol>
		<li>蝸牛を維持するのに十分なだけを残して水没、シンチレーション バイアルから残りの DI 水を削除します。</li>
		<li>脱灰を開始するには、蝸牛を含むシンチレーション バイアルに DI 水で 10% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.02 M) 5 mL を追加します。</li>
		<li>転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛を純水で 10 %edta の 2 mL を循環します。</li>
		<li>回転子に戻るシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。72 時間の期間にわたって 10 %edta 溶液のすべての 24 h を変更します。蝸牛が空気にさらされないようにソリューションを変更するときに注意します。</li>
		<li>すすぎ 3 回 1 × PBS です。 で、2 h の蝸牛この段階では、蝸牛が脱灰します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ストレージ
	<ol>
		<li>72 h までの蝸牛溶液中で保存、10%、反反 10% ペン連鎖球菌 PBS で 4 ° C で 注: ストレージ期間を長く可能性があります抗生物質溶液; の定期的な変更が可能ただし、加工の蝸牛の拡張記憶域は、このプロトコルでは検証されていません。</li>
	</ol>
	</li>

3. 調達と hWJCs の拡大
<ol>
	<li>以前に発行されたプロトコル22によると hWJCs を分離します。簡単に言えば、3 cm のセクションにへその緒を分割します。</li>
	<li>慎重には、メスで浅い切開縦各臍帯のセグメントを広げるし、臍帯ワルトンを公開します。血管を削除するのに鉗子を使用します。</li>
	<li>組織が水没する (例えば、40 mL で 60 mm のペトリ皿) 十分な PBS で 2 回臍帯セグメントを洗います。メスで組織のセグメントを細かくみじん切り。100 mm ペトリ皿消化中の 50 mL の組織を消化 (0.2 %2 型コラゲナーゼ、低グルコース環境における 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM))。</li>
	<li>5% CO2、37 ° C のインキュベーターで一晩 50 回転軌道シェーカーの中の消化に組織を配置します。次の日、1:16 pbs は、抗生物質抗真菌 2% の割合で消化中を希釈し、室温で 500 × g で遠心分離によって細胞をペレット (~ 27 ° C) 10 分破棄上清の。</li>
	<li>細胞と間葉系幹細胞成長培地 (MSCGM) にペレットを再懸濁します。プレート細胞培養の 7 x 103セル/cm2の密度では、T-75 フラスコを扱われます。文化の MSCGM、HWJCs、通路 5 実験用に展開します。 注: HWJCs がサブ培養される大きい T フラスコに (例えば、T-150、T-300) 継 hWJCs 実験のための収穫を増加するとき。</li>
</ol>
4. 脱蝸牛への hWJCs の注入
<ol>
	<li>脱の蝸牛を準備します。
	<ol>
		<li>無菌技術を使用して、3 回の 30 分の 1 × PBS でストアドの蝸牛を洗浄します。</li>
		<li>24 ウェル プレートの別の井戸に蝸牛を転送し、37 ° C の 1 つの mL を追加 MSCGM で加温します。</li>
		<li>蝸牛 5% CO2セルの注入の前に 1 時間の最小値の 37 ° C 細胞文化インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HWJCs を切り離して、再懸濁します
	<ol>
		<li>37 ° C と洗浄 hWJCs 前回 1x PBS を温めた。</li>
		<li>十分な 37 ° C を追加セル容器表面に 0.5 %edta でトリプシンで加温します。</li>
		<li>HWJCs 5% CO2、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで最大 5 分間インキュベートします。<ol>
			<li>細胞の 90% が倒立顕微鏡の下のセルを表示することによって表層文化から切り離されることを確認します。 注: 移動文化容器を軽くタップすると、細胞をデタッチします。静止したとき、細胞が分離されていません。</li>
			<li>さらに添付された細胞を取り除くためフラスコの側面が軽きます。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>無菌技術を使用して、トリプシンのボリュームに MSCGM の同等のボリュームを含む 50 mL の円錐管に培養器から転送 hWJCs はセルを分離するに使用されます。</li>
		<li>常温 500 × g で遠心分離によって、hWJCs をペレット (~ 27 ° C) 5 分。</li>
		<li>上清を吸引し、500,000 細胞/ml の濃度で MSCGM で hWJCs を再懸濁します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蝸牛を灌流します。
	<ol>
		<li>転送ピペットを使用して新しい 24 ウェル プレートに蝸牛を転送します。</li>
		<li>任意の蝸牛が乾燥するを防ぐために各の蝸牛に MSCGM のドロップを追加します。</li>
		<li>繊細な楕円形や円形の窓を向いているように超微細鉗子を使用して蝸牛に合わせます。 注: は、際は蝸牛が簡単に破損している各蝸牛を直接取り扱いに細心の注意を取る。</li>
		<li>接続チューブ、滅菌 28.5 ゲージ インスリン注射器の使用を再停止される 0.2 mL hWJCs (100,000 細胞) を描画します。</li>
		<li>滅菌微細鉗子を使用して、楕円形の窓にチューブを置きます。</li>
		<li>繊細かつゆっくり 0.2 ml ポリエチレン チューブに接続されている 28.5 ゲージ インスリン注射器を使用して再懸濁の hWJCs の蝸牛を灌流 (外径: 0.61 mm、内径: 0.28 mm) で約 5 分。</li>
		<li>後、0.8 mL 37 ° C の追加も 1 mL に井戸の総容積をもたらすに蝸牛を含む、MSCGM で加温します。</li>
		<li>各蝸牛、新鮮な注射器を使用して、各時間をチューブの 4.3.3-4.3.7 の手順を繰り返します。</li>
		<li>5% CO2、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで灌流の蝸牛を置き、週 3 回のメディアを変更します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 蝸牛収穫と保存
注: 蝸牛培養があります、任意の時点で収穫まで 30 日後灌流。
<ol>
	<li>蝸牛を保持するには、ロッキング プラットフォーム上の 4 ° C で一晩 1x PBS で 4% パラホルムアルデヒドで修正します。</li>
	<li>固定後、3 回各 5 分の 1 × PBS と蝸牛を洗います。</li>
	<li>徐々 に脱水エタノールと蝸牛とのパラフィン包埋する前に脂肪族炭化水素溶剤でクリアします。</li>
	<li>セクションは、ミクロトームを使用して 10 μ m の厚さにサンプル、ガラス顕微鏡スライドをマウントします。 注: サンプルはする準備が整いました組織学的や免疫組織化学的処理の標準プロトコルを使用して。</li>
</ol>

<ol><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li>
<li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li>
<li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage%3A+Effects+of+tissue+preparation+%26+identification+of+regions+of+hair+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li>
<li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+a+recreational+noise+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li>
<li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+an+occupational+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li>
<li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics%3A+results+of+a+large+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Audiol%22%5BJournal%5D)">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li>
<li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18675691">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li>
<li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus%3A+surgical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li>
<li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li>
<li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li>
<li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li>
<li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li>
<li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear%3A+molecular+and+structural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton%27s+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Photo-conversion%3A+A+second+chance+to+label+unique+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+cells+from+Wharton%27s+jelly+form+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton%27s+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li>
<li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li>
<li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+%28ProHance%29+and+gadodiamide+%28Omniscan%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li>
<li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

我々 は正常に蝸牛の複雑な三次元組織足場としての使用を可能にする decellularization プロセスを介して蝸牛からネイティブ蝸牛細胞を削除できることを実証しました。サンティら。15 decellularizing の蝸牛の最初のメソッドを開発し、光シート顕微鏡23の助けを借りてを通じて多くの人工内耳構造のボリュームを正確に推定しています。このような初期の作品は、組織エンジニア リングと細胞培養の技術がここに提示のための強固な基盤として提供しています。脱蝸牛は正常に、細胞融合とすることができ、培養期間を延長。動物の広い配列からの蝸牛は、細胞の種類の同様に広い配列との組み合わせで理論的に利用できます。これらの組み合わせにより組織工学感覚上皮の開発14を調べて、薬の新規医薬品薬のテスト アプリケーションなど多数の可能な実験設計に活用するここでテクニック24、25モデルの蝸牛神経...

蝸牛は、側頭骨は、複雑なスパイラル構造です。外側の骨迷路と、同心の内側の膜迷路1から成り立っています。膜迷路は、流体の 3 つのスペースで構成されています: Scala スカラー座 vestibuli メディア、およびスカラー座索1。Scala メディア住宅感覚の上皮細胞の種類の多数で構成されているが、感覚有毛細胞 (HC)、神経インパルス2音波の機械的エネルギーを変換、特に重要です。音響外傷3,4、5薬6疾患7,8、および高齢化9への暴露は、すべての HC の死を介して聴覚機能障害で起因できます。哺乳類の毛細胞損失は傷害10後再生することができます鳥の HCs とは異なり、永続的なです。
様々 な現代的な研究努力を失われた HCs を復元する特定の実験的アプローチは異なるが求めています。感覚上皮における遺伝子発現の操作と体の外分化した幹細胞の注入、支配的なアプローチにおいて、蝸牛オルガノイドの幹細胞の分化を誘導方法がされているが11,12,13を試みた。それぞれのアプローチは、直接幹細胞や幹細胞の発達の手がかりに依存ただし、2 番目は共有で、潜在的に重要な要素はそれ自体蝸牛の ECM14,15。
ECM だけでなく細胞と細胞の接着、増殖、生存、および移行の面を含んでいますが、また HCs やらせん神経節報15,16 の開発に重要な役割を果たしている組織の物理的なサポートを提供します ,17。自然発生する ECM は、細胞の表現型決定および/または細胞の接着・増殖・生存の18のガイドが誘導信号を提供します。その結果、脱蝸牛培養 hWJCs との組み合わせでの使用は、ECM と HC の再生の役割を探検するユニークな機会を提供しています。HWJCs は、間葉系幹細胞の19のように振る舞うひと臍帯由来容易に利用できる、非論争の携帯タイプです。HWJCs は、麻痺細胞系統20,21を区別する能力を示しています。したがって、現在のプロトコル詳細分離、decellularization、および内耳組織工学用 hWJCs と C57BL マウスの死骸から蝸牛の血流を示します。

<table><tbody><tr><td>アレグラX-14R遠心分離機</td><td>ベックマンコール</td><td>ターB08861</td><td></td></tr><tr><td>イントラメディックセミリジッドチューブベ</td><td>クトンディキンソン</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィックイノーバ2000オービタルシャラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>ファインフォーセプス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>超微細鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 インスリンシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>ローテーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>トランスファー・ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質・抗真菌薬</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラスガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>プロロングゴールド退色防止マウンタント DAPI</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>クリアライト3</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>間葉系幹細胞増殖培地</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 培養フラスコ</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 培養フラスコ</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 培養フラスコ</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>ニコンエクリプス TS2R-FL 倒立顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメン</td><td></td>ツ MFA51010 <td></td></tr><tr><td>NuAire クラス II、タイプ A2 バイオセーフティキャビネット</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS ソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

内耳組織工学用マウス蝸牛を decellularizing するためのプロトコル

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

哺乳類のヒアリング不足を再生する能力を促進する機械刺激受容の有毛細胞では、難聴の治療法を限られています。現在の再生医療戦略は、移植幹細胞や内耳難聴を修正する損傷した幹細胞の交換を奨励するためにサポート細胞を周囲の遺伝子操作に焦点を当てています。しかし、細胞外マトリックス (ECM) は誘導と有毛細胞の機能を維持する重要な役割を果たすこと、十分に調査されていません。人工内耳を使用して成体幹細胞を成長する足場として ECM 方法、組成と細胞外の環境のアーキテクチャにエイズ聴覚機能の維持の細胞に独特な洞察力があります。分離し、成体幹細胞灌流を受け入れる足場として使用するマウスからの蝸牛を decellularizing する方法をご紹介します。現在のプロトコルの蝸牛は安楽死させたマウス、脱と脱灰から分離されます。その後、臍帯から隔離された人間の Wharton のゼリー細胞 (hWJCs) は、各蝸牛に慎重に灌。バイオリアクター, として、蝸牛を用い、解析の処理を受ける前に 30 日間培養します。脱の蝸牛は個人の細胞外構造を保持が、細胞の存在や DNA の顕著なフラグメントを明らかにしなかった。蝸牛に灌流セルは蝸牛の内外面のほとんどを侵略し、30 日間の期間にわたって問題なく育った。したがって、どのように人工内耳の ECM の影響細胞発達や行動を研究する現在のメソッドを使用することができます。

ここに提示されたメソッドを使用すると、蝸牛の成功した decellularization は、4' を介して DNA の存在有無を調べることで評価された 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色します。Decellularized 蝸牛内 DNA が識別されなかった場合、蝸牛を完全に decellularized と考えられていた。Decellularization または脱灰を受けていない以前の実験からネイティブ蝸牛は、構造と伝統的 C57BL マウス蝸牛に存在する細胞を示すために肯定的な制御として使用されました。任意の hWJCs の注入はありませんでした、脱脱蝸牛は、ネガティブ コントロールとして使用されました。任意組織切片 (図 3) の領域で定量化可能な DAPI 染色細胞核は認められなかった。2 つの蝸牛脱脱灰, し、現在のプロジェクトの hWJCs を注入します。HWJCs と灌流脱脱灰の蝸牛が多数 DAPI 染色蝸牛および蝸牛 (表 1</stron...

このプロトコルの目的は、decellularize し、めしマウス蝸牛組織工学用の足場として利用する効果的な方法を示すことです。

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

この手順の全体的な目標は、内耳組織工学アプリケーション用の足場を使用するために、マウス蝸牛を脱細胞化および脱灰する効果的な方法を実証することです。この方法は、3D蝸牛や細胞外マトリックスのさまざまな成分が幹細胞の分化にどのように影響するかなど、聴覚および組織工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が細胞が蝸牛の細胞外マトリックスと直接相互作用して感覚上皮を形成する方法を研究できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストの説明のみに基づいて骨の時間的分離および細胞増殖装置を正しく視覚化するのが難しい場合があるため、非常に重要です。この手順を開始するには、鋭利な手術用ハサミを使用して、中矢状面で頭蓋骨を二等分します。次に、頭蓋骨から脳組織を取り出します。次に、頭蓋骨の内側にある聴覚神経根と前庭神経根、および外部からの外耳道の存在を通じて側頭骨を特定します。頭蓋骨を慎重に切り取り、頭蓋骨の残りの部分から側頭骨を分離します。その後、細い鉗子を耳道の開口部に約5ミリメートル挿入して、先端が蝸牛に穴を開けるリスクがないようにします。ボーラの骨をそっと折って骨折させます。細い鉗子を使用して、蝸牛の骨迷路を露出させる側頭骨からボーラの残りの部分をこじ開けます。その後、蝸牛の楕円形と円形の窓を上に向けて、側頭骨をPBSに沈めます。極細の鉗子を使用して、アブミ骨を通過するアブミ骨動脈を取り除きます。次に、動脈が通るアブミ骨のアーチに極細鉗子の先端を1つ挿入し、アブミ骨を繊細に持ち上げます。その後、楕円形と円形の窓に穴を開けます。その後、PBSで満たされた28.5ゲージのシリンジに接続されているチューブを楕円形の窓の上に配置します。PBS 中の 10% 抗生物質 - アチミコシンと 10% ペニシリン - ストレプトマイシンの 2 mm を蝸牛を通して 5 分間かけて 2 mm を多量に塗布し、外リンパ液を除去します。次に、残っている筋肉組織と骨片をすべて取り除いて廃棄します。脱細胞化には、トランスファーピペットを使用して蝸牛をピペットにゆっくりと引き込み、切断された端を数ミリメートル通過させます。次に、蝸牛を1%SDS溶液で満たされたシンチレーションバイアルに排出します。トランスファーピペットを使用して、脱イオン水中の1%SDSを2ミリリットルの蝸牛を通してシンチレーションバイアルに循環させます。シンチレーションバイアルをローテーターに入れ、室温で72時間10RPMで回転させます。72時間にわたって24時間ごとに新しい1%SDS溶液と交換し、溶液の交換中に蝸牛を空気にさらさないように注意してください。.その後、蝸牛を同じシンチレーションバイアルで3回、DI水でそれぞれ30分間洗浄します。この段階で、蝸牛は脱細胞化する必要があります。脱灰のために、シンチレーションバイアルから残りのDI水を取り除き、蝸牛を水没させるのに十分な量を残します。脱灰を開始するには、蝸牛を含むシンチレーションバイアルに5ミリリットルの10%EDTAおよびDI水を加えます。トランスファーピペットを使用して、脱イオン水中の10%EDTAを2ミリリットルの蝸牛を通してシンチレーションバイアルに循環させます。シンチレーションバイアルをローテーターに戻し、シンチレーションバイアルを室温で72時間10RPMで回転させます。10%EDTA溶液は、72時間にわたって24時間ごとに交換します。溶液を交換するときは、蝸牛が空気にさらされないように注意してください。次に、蝸牛をPBSでそれぞれ2時間、3回すすぎます。この段階で、蝸牛は脱灰する必要があります。細胞を注入する前に、脱細胞化および脱灰蝸牛を5%二酸化炭素、摂氏37度の細胞培養インキュベーターで最低1時間インキュベートすることから始めます。蝸牛を大量に増やすには、次に各蝸牛にMSCGMを一滴加えて、蝸牛が乾燥するのを防ぎます。トランスファーピペットを使用して、新しい24ウェルプレートに移します。超微細な鉗子を使用して、楕円形と円形の窓が上を向くように蝸牛を繊細に向き合わせます。次に、チューブを接続した滅菌済みの28.5ゲージインスリンシリンジを使用して、再懸濁したヒトウォートンゼリー細胞を0.2ミリリットル引き出します。その後、滅菌した細い鉗子を使用して、楕円形の窓の上にチューブを配置します。蝸牛を繊細かつゆっくりと、0.2ミリリットルの再懸濁したヒトウォートンゼリー細胞で5分間かけて大量に処理します。この豊富なステップは重要です。蝸牛を介した液体の大量供給が成功すると、このプロトコルの結果に大きく影響します。滲出後、0.8ミリリットルの37°Cの予熱したMSCGMをウェルを含む蝸牛に加えて、総容量を1ミリリットルにします。蝸牛ごとに手順を繰り返します。毎回新しい注射器とチューブを使用します。ふんだんに使用した蝸牛を摂氏37度の細胞培養インキュベーターに入れ、培地を週に3回交換します。ここに示されているのは、細胞を注入せずにマウス蝸牛の脱細胞化と脱灰が成功したことです。全体として、蝸牛の解剖学的構造は保存されており、ボイドは残されており、汚れはありません。これは、蝸牛足場上でヒトウォートンゼリー細胞を成功裏に培養した代表的な結果です。蝸牛全体と骨の外側の表面に豊富なダッピー染色が観察されます。個々のターンを詳しく調べると、微細な蝸牛構造は脱細胞化と脱灰後も保存され、注入された細胞は天然の蝸牛細胞外マトリックスに付着したり、相互作用したりしていることが明らかになります。その後の細胞培養における脱細胞化も、H&E染色を用いて調査しました。脱細胞化した蝸牛には、天然の蝸牛の細胞は含まれていませんでしたが、細胞外マトリックスが残っているため、コルチ器官の解剖学的構造の大部分を保持しています。培養細胞に注入されたものは、コルチの器官を通じて観察でき、脱細胞化された細胞外マトリックスと相互作用します。一度習得すると、蝸牛がすでに準備され、必要なツールが適切に配置されている場合、脱細胞化蝸牛への細胞の大量化には約10〜15分かかることがあります。この手順を試みるときは、蝸牛は壊れやすいため、注意して取り扱うことが重要です。また、滲出時には気泡が流体の流れを妨げるため、蝸牛への空気の混入を避けることも重要です。この一般的な手順は、他の種の蝸牛に適用でき、さまざまな種類の細胞を注入することもできます。特定の脱細胞化と脱灰の時間は異なる可能性がありますが、基本的な概念は同じままです。ミネソタ大学のピーター・サンティ博士は、最初にこのプロトコルのために修正した脱細胞化技術を開発しました。私たちは、蝸牛足場での技術と細胞培養を他の組織エンジニアが利用できるようにしたいと考えています。このビデオを見た後、培養実験で使用するための細胞を注入する前に、側頭骨をうまく分離、脱細胞化、および脱灰する方法を十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

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学ぶマウス蝸牛の脱細胞化・脱灰化プロトコル。内耳組織工学用スカフォールドを作成し、細胞と蝸牛細胞外基質の相互作用を研究する方法です。感覚上皮形成のメカニズム解明に有用です。

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

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