ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成と評価

合成および精製の全体的な目標は、市販のルテニウム360よりも10倍効果的な、ミトコンドリアカルシウム取り込みアッセイで使用されるルテニウム360類似体を比較的容易に製造することです。この方法は、ミトコンドリアカルシウム取り込みの純粋な阻害剤を提供することにより、ミトコンドリアカルシウム生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、最終製品が非常に強力で純粋であることです。

この方法に不慣れな人は、浄化に時間と忍耐が必要なため、苦労するかもしれません。プロデューサーのデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるSarah Nathanです。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、ペンタアンミンクロロルテニウムジクロリドの合成から開始します。

100ミリグラムのペンタアンミンクロロルテニウム二塩化物を50ミリリットルの1モル水酸化アンモニウム溶液に200ミリリットルの丸底フラスコに溶解します。ガラス栓でフラスコを緩くキャップし、反応混合物を摂氏75度で6時間加熱します。密閉容器を加熱すると、圧力が上昇します。

ガラスストッパーが緩んでいて、過剰な圧力が解放されていることを確認してください。6時間後、反応混合物を火から下ろします。そして、室温で4日間攪拌して、濃い緑色の溶液を生成します。

得られたトランスジアクアオクトアミンmu-オキソジルテニウム五塩化物をカチオン交換クロマトグラフィーにより精製するために、まず、25ミリリットルのビーカーに0.1モルHCLの10ミリリットルのメッシュカチオン交換樹脂を懸濁します。このスラリーを50ミリリットルの溶媒リザーバーで固定された10ミリリットルのカラムにロードします。溶出が無色になるまで、約20〜30ミリリットルの0.1モルHCLで樹脂を洗浄します。

次に、以前に単離した緑色の反応溶液に濃縮HCLを添加してPHを2に調整し、その時点で溶液の色が茶色に変わります。この酸性化した溶液を、レジンの上で静かにピペッティングして、陽イオン交換樹脂カラムにロードします。溶出液を完全に排出し、溶液のロードを続けます。

ソリューション全体が追加されるまで、このプロセスを繰り返します。レジンの上部はダークブラウンまたはブラックになります。樹脂の体積がわずかに減少します。

次に、新しい溶液を追加したときにレジンが乱れるのを防ぐために、レジンの上部をガラスビーズで覆います。20ミリリットルの1モルHCLでカラムを溶出します。次に、HCL濃度が1.5モルに増加した50ミリリットルでカラムを溶出します。

黄色の溶液がカラムから外れ始めます。次に、HCL濃度を2モルに増やし、150〜200ミリリットルで溶出を続けます。溶離液は、非常に淡い黄色から始まり、明るい黄色に変わります。

カラムから来る溶離液が再び非常に薄くなるまで待ちます。このステップでは、忍耐力が重要です。溶離液は非常に淡いものでなければなりません。

HCL濃度をさらに2.5モルまで上げます。溶離液を試験管に画分として集めます。最後に、濃度を3モルHCLに増やします。

製品は、カラムから緑褐色の溶液として溶出します。赤茶色の画分もカラムから剥がれ始めることがあります。これらの画分はルテニウム褐色の不純物であり、緑褐色の画分と一緒にプールしないでください。

UV-Vis分光法ですべての画分をテストするには、特定の画分を100マイクロリットルを2ミリリットルの3モルアンモニアに加えます。次に、UV-Vis分光法で混合物を分析します。純粋な製品を含む画分は、360ナノメートルで大きな吸光度バンドを持ち、600ナノメートルでそれほど強くない吸光度を持ちます。

480ナノメートルの吸光度はルテニウムブラウンを示し、533ナノメートルの吸光度はルテニウムレッド不純物を表します。他の不純物は、300ナノメートル未満の吸光度で見られます。純粋な製品を含むフラクションをプールし、回転蒸発によって溶液を乾燥に蒸発させてから、IR分光法による固体状態でのサンプルの分析を行います。

テキストプロトコルに詳述されているように、蛍光分光法によるミトコンドリアカルシウム取り込み阻害の評価に進みます。精製されたトランスジアクアオクトアミンmu-オキソジルテニウム五塩化物のUV-Visスペクトルは、それぞれ360ナノメートルと600ナノメートルでの主要な吸収と小さな吸収によって特徴付けられます。逆に、不純な混合物は、ルテニウム赤色不純物から533ナノメートル、出発物質から275〜300ナノメートルに吸収帯を示します。

赤外分光法を用いた固体特性評価では、アミンからの伸びが予想されます。ルテニウム酸素ルテニウムは850逆センチメートルで伸びます。カルシウム感受性蛍光色素およびトランスジアクアオクトアミンμ-オキソジルテニウム五塩化物で処理した透過食箕HeLa細胞は、ミトコンドリアへのカルシウム取り込みの阻害を示します。

手順を試行するときは、フラクションが完全に溶出するのを待つことを忘れないでください。忍耐は純粋な製品を生み出します。このビデオを見れば、この強力なルテニウム360アナログの合成、精製、特性評価の方法について十分に理解できるはずです。

ミトコンドリアのカルシウムレベルは、生体エネルギー学や制御された細胞死など、幅広い細胞間プロセスを調節します。この方法から得られる阻害剤は、ミトコンドリアのカルシウム生物学が他の生物学的プロセスを媒介する役割を理解するための研究に適用することができます。濃酸や濃塩基の取り扱いは腐食性があり、この手順を実行する際には常に適切なPPEの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。