Name: DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶSYBR Green IとNBTを用いたゲル内DNA染色・定量法。青色光または日光で可視化し、オフィススキャナーで簡易定量可能。現地調査に適した最小限機器の生化学的手法です。

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この作品は、フォンド ナシオナル デ開発 Científico y Tecnológico (Fondecyt)、チリ、(CW) にプロジェクト 11130263、プロジェクト チリ + NERC エイトによって支えられた (CW) に Colaboración インターナショナル PCI PII20150073 と U-inicia Vicerrectoría デから危惧デチリ (CW) します。
芸術 Químicas y 博士ホルヘ バーブルと参考については、原稿やリオイバニェス デ extensión デ ラ Facultad デ改正ロバート ・ レッシュ サンディエゴ キロガ ロジャー、このプロジェクトの初期の段階で助けタチアナ ナランホ パルマ行きのおかげでください。チリ大学から Farmacéuticas。ビデオを編集するためのマルセロ ・ ペレスとニール · スティーブンスのナレーションを提供するテキストとエロール ・ ワトソンを修正するためにあまりにも感謝します。

1. 準備とゲルの実行
<ol><li>Sambrook とラッセルの14が、SDS の代わりに水を用いたナトリウム Dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) レシピを使用して 12% のポリアクリルアミドゲルの非変性ゲルを準備します。<ol>
<li>解決のゲルの 5 mL の準備、TEMED 0.002 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.05 mL の 1.5 M トリス pH 8.8 1.3 mL アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 2 mL 1.7 mL の蒸留水を使用します。</li>
		<li>準備スタッキングのゲルの 2 mL は 1.5 mL の水、アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 0.33 mL、1 M トリス pH 6.8 の 0.25 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.02 mL、TEMED 0.002 mL を使用します。ゲルのサイズは 7.3 cm × 8.2 cm 0.075 × cm (w x d x l)。 注:感度を最高厚さ 0.75 mm の 15 も櫛を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>読み込みバッファーと DNA サンプルを 1.5 mL 遠心チューブ (例えば5 μ L の DNA のサンプルを 6 x の読み込みバッファーの使用 1 μ) x 6 の適切な量を追加します。</li>
	<li>垂直電気泳動室にゲルを配置します。<ol>
<li>2 ゲルを実行する 1 x TAE バッファーの 750 mL で部屋を満たします。50 の 1 L を準備する x TAE、トリス基地の 442 g、氷酢酸、57.1 mL と 0.5 M EDTA pH 8 の 100 mL を使用します。1 L の最終巻に蒸留水を追加します。</li>
		<li>ゲルのサンプルをロードします。2 h の 100 V でゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、Sambrook14のレシピを使用して 1 x TAE agarose のゲルを準備します。<ol>
<li>1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 V で 45 分のためのゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT SG (図 1) を汚す私。
<ol><li>
アクリルアミドゲル染色します。
	<ol>
<li>ソリューションの準備: 0.1 w/v NBT と 1.2 SG x 私。 注:エチジウム ブロマイド、GelRed、SG ではなくサイバー ゴールドを使用することが可能だけど、SG の最高のパフォーマンスをしていた。</li>
		<li>1.2 16.75 mL を注ぐ x SYBR 緑のソリューションに適切なサイズの容器。 注:我々 は、コンテナーとしてピペット チップ ボックスの蓋を使用し、これらのボリュームは、このコンテナーを使用してゲルをカバーする計算されます。その寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。</li>
		<li>ソリューションをジェルします。3.25 mL 0.1 %w/v NBT 液 0.2 mM NBT を与えるための追加と 1 x (2.0 μ M に相当) SG 私最終濃度。</li>
		<li>プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。 注:プラスチック フィルムは、飛散防止のため、染色液にアルミ箔の反応を避けるために使用されます。</li>
		<li>25 分 60 rpm で軌道シェーカーを振る。</li>
		<li>アルミとプラスチック製のカバーを取り外します。最大 90 分のための日光にさらします。興味のバンドが表示されるまでは、5 分ごとに確認してください。</li>
		<li>青色光を使用するには、3 光発光ダイオード (LED) と併せて使用を準備し、ゲルの表面 (LED 光源の強度に依存します必要な時間として、継続的に染色チェック) から約 5 mm の Led を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agarose のゲル染色します。
	<ol>
<li>準備と 1% の agarose を実行するゲルの 1.4 節で説明した後 (サイズが 1 cm × 6.2 cm × 7 cm; l x 幅 x 奥行)、2.1 は、これらの変更と同じ手順に従ってください。</li>
		<li>1.2 41.9 mL を注ぐ SG x 私ピペット チップ ボックスのふたにソリューションその寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。8.1 mL 0.1 %nbt ソリューションを追加します。</li>
		<li>プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。</li>
		<li>1 h 60 rpm で軌道シェーカーを振る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ分析。
<ol><li>
NBT SG 私検。
	<ol>
<li>1200 dpi でスキャンすることによって、ゲルの画像を取得します。</li>
		<li>画像解析ソフトウェアをオープン。イメージ エディターを使用してイメージをまっすぐにします。画像密度測定を実行します。</li>
		<li>曲線の下の領域を計算します。DNA 濃度対最大のグラフを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA の回復。
<ol><li>1 に 1% の agarose のゲルの準備のレシピを使用して x TAE が見つかりました Sambrook14。</li>
	<li>1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 ng/μ L pDJ10015プラスミッドおよび DNA ラダー図 2に与えられる方式を次の 4 μ L をロードします。100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。</li>
	<li>マークし、2 つの 2 mL 遠心チューブの重量を量る。</li>
	<li>真ん中 2 つの同じ部分を持つためにゲルをカットします。それぞれには、はしごと異なる染色法を比較するサンプル プラスミドを含める必要があります。概略図は、図 2にあります。</li>
	<li>ステイン 1 つ NBT SG と半分ステップ 2 のように。<ol>
<li>きれいなメスを使用してプラスミッド バンドをカットします。1 つの管でゲルの部分を保存し、重量を量る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SG とゲルの他の部分を染色私 1 の 50 mL の SG x 私ソリューションと暗闇の中で (60 rpm) 1 h のためのゲルをゆっくりと振る。<ol>
<li>ジェルを transilluminator ときれいなメスを使用してプラスミッド バンドを 2 分カットを公開します。</li>
		<li>他のチューブにゲルの部分を保存し、重量を量る。 注:プロトコルは-20 ° C でチューブを維持しながらここで一時停止できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>商業ゲル抽出キットを使用してプラスミッドの抽出を行います。</li>
</ol>5. プラスミド正規化されます。
<ol><li>1.5 mL 遠心チューブに抽出されたプラスミドの 10 μ L と 60 μ L の水の種類を追加します。ミックス 60 μ 石英キュベットに譲渡または直接、Nanodrop で 2 μ L を使用します。</li>
	<li>230 に 320 の吸収スペクトルを測定 nm。次の数式を使用してサンプルのプラスミド濃度を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> Dは適用される希釈率 (この場合は 70/10) x nm の吸収であり、50 は、dsDNA の μ g/mL への換算係数Ax 。</li>
	<li>9.1 ng/μ L のサンプルを希釈します。</li>
	<li>エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 有能なセル (例えばXL10 ゴールド) を変換次の希釈サンプルの 5 μ L を使用して井上変換手順16 。</li>
	<li>ペトリ皿のコロニーの数をカウントして、希釈します。次の数式17:とコロニー形成単位 (CFU) を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> Dは初期の文化から適用される希釈係数です。</li>
	<li>対になっていない t 検定を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
<li>Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Green-I%3A+a+new+fluorescent+dye+optimized+for+detection+picogram+amounts+of+DNA+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels.</a> Biophys. J. 66 (A150), (1994).</li>
<li>Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+agarose+gels+stained+with+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue.</a> Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).</li>
<li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li>
<li>Yang, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+using+a+visible+dye%2C+Nile+blue%2C+in+electrophoresed+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels.</a> Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).</li>
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<li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+salts+and+formazans%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li>
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<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

感受性と小説 DNA 染色法は NBT が減少し、私はこの記事で紹介した SG の使用に基づいています。このプロトコルの重要なステップは、NBT SG でゲルのインキュベーション時間私ソリューションおよび NBT の濃度。Agarose のゲルのより大きい厚さのために agarose のゲルの染色時間はアクリルアミドゲルよりも長くなります。このメソッド、NBT が接触して析出物も SDS 存在下で働きません。ゲルは、紫色の背景を取得した場合別のゲルを準備することをお勧めし、露光時間を短縮します。Agarose のゲルを染色、十分な感度がない場合は、露光時間を長くことをお勧めします。感受性の欠如があり、乳白色の沈殿はゲル中に存在する場合、これは SDS 汚染の結果かもしれない。その場合は、新しいゲルを準備し、染色試薬を追加する前にそれをすすいでください。
青色 LED や太陽の下で当然のことながら青い光現在の光によって提供されるかどうか、青い光による沈殿物が発生します。このため、手法の限界は、光源です。ある光源、青の光源を使用する必要はありません、光源が均一ではない場合は、比較を行う...

生物化学および分子生物学の発展に伴い、DNA を含む研究は DNA を分析する優れたテクニックが必要。DNA 染色する最初の方法は銀染色、非常に敏感であるが、欠けている選択性および回収はできません。その後、DNA を蛍光染色の開発許可サンプル回復の可能性のある DNA の選択的定量です。DNA の定量化に使用される最初の蛍光染料の一つは、変異2エチジウム ブロマイド1、だった。しかし、今は、安全 GelRed、SYBR グリーンなどの機密性の高い蛍光染料類の改善私 (SG 私)3;しかし、すべてこれらの蛍光染料の紫外線 (UV) transilluminator または蛍光を使用する必要があります。
4メチレン ブルーとクリスタル バイオレット5,6,7,8,9, など目に見えて、DNA を染色する方法がありますが、これらのすべてに苦しむに対する感度を下げると選択性。テトラゾリウム塩有機化合物減少に影響を受け、この場合彼らは不溶性を形成し、色塩沈殿10,11。最近では、DNA の正テトラゾリウム リング12のためにバインドするいくつかの二価テトラゾリウム塩を示されています。
最近文書13を汚し、ポリアクリルアミドゲルの DNA の定量化手法を表示する方法を提案、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) と GelRed、臭化エチジウムなど蛍光色素と呼ばれる二価テトラゾリウム塩の還元SYBR グリーン私とサイバー金。青色のライトや日光の存在下で勤務し、品質向上と回収を許可この反応と比較して SG の使用に私 UV transilluminator。本稿の目的は、テトラゾリウムを用いた染色技術の詳細なプロトコルを提供する塩です。

<table><tbody><tr>染色<td>に使用される</td><td>ニトロブルーテトラゾリウム</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジー298-83-9</td></tr>試薬 <tr><td>SYBRグリーンI 10000X</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>試薬 染色</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td>で使用される<td>試薬 QIAGEN</td><td>28704</td><td>インテグリティアッセイのゲルからプラスミドを抽出するために使用される</td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>検量線の作成に使用され、インテグリティアッセイのカットバンドの参照として使用されます</td></tr><tr><td>寒天培</td>地メル<td>ク</td><td></td>は<td>LB-アンピシリン培養プレートの作成に使用されました&nbsp;</td></tr><tr><td>メルク</td>社の<td>塩化ナトリウム</td><td>1064045000</td><td>LB-アンピシリン培養プレートの製造に使用されています&nbsp;</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>ベクトン、ディキンソンアンド</td><td>カンパニー212750</td>は<td>、LB-アンピシリン培養プレートを作るために使用されました&nbsp;</td></tr><tr><td>LB-アンピシリン培養プレートの製造に使用される</td><td>メルク</td><td>72161000</td>の<td>ペプトン</td>&nbsp;</tr><tr><td>ポリアクリルアミドゲルの製造に使用される</td><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>ポリアクリルアミドゲルの製造に使用される</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>ポリアクリルアミドゲルの製造</td></tr>に使用される <tr><td>ビスアクリルアミド</td><td>シグマ</td><td>146072</td>ポリ<td>アクリルアミドゲルの製造に使用される</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>メルク</td><td>1083821000</td><td>TAE緩衝液および非変性ポリアクリルアミドゲルtris-HCl緩衝液の製造に使用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T.ベイ</td><td>カー8993-01</td><td>TAE緩</td></tr>衝液の製造に使用 <tr><td>酢酸</td><td>メルク</td><td>1,000,632,500</td><td>TAE緩衝液</td></tr><tr><td>アガロース</td>の製造に使用 <td>メルク</td><td>16802</td><td>TAE緩衝</td></tr><tr><td>液分光光度計</td>の製造に使用 <td>DNAプラスミド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の定量に使用 Tecan infinite 200 pro水浄化ユニット</td><td>メルク</td><td>エリックス100</td>は<td>、分光光度法で使用される水タイプ1(ASTM)を作るために使用し</td></tr><tr><td></td><td></td>、ゲル<td></td><td>、培地、染色、および一般的な溶液</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T.ベイ</td><td>カー9535-03</td>は<td>、非変性ポリアクリルアミドゲルトリスHCl緩衝</td></tr><tr><td>液6X DNAローディング染料</td>サー<td>モフィッシャーR0610</td><td></td><td></td></tr><tr>を作るために使用されます。<td>完全性アッセイ</td>プロトボードKANDH KH102光源のサポートと回路で使用される<td>5 mm青色LED</td><td>Jinyuanエレクトロニクス</td><td>SP-021</td>光源</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>9 Vバッテリー</td><td>Duracell-LED</td><td></td>の水平電気泳動チャンバー<td>に電力を供給するために使用</td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>インテグリティアッセイでアガロースゲルを製造および実行するために使用されます</td></tr><tr><td>垂直電気泳動キット</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>ポリアクリルアミドゲルを検量線で実行するために使用されます</td></tr><tr><td>電源</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td>電気泳動の動力源として使用</td></tr></tbody></table>

dna 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA 染色法、生物医学研究のため非常に重要です。色の沈殿物の形成によって肉眼に目に DNA の可視化を可能にする簡単な方法を考案しました。それは、アクリルアミドを浸漬、または agarose DNA ゲル 1 x (2.0 μ M に相当) の溶液に SYBR グリーン私 (SG 私) と紫色を作り出す 0.20 mM ニトロ ブルー テトラゾリウム塩日光に露出されたときの沈殿または具体的に青色のライト。また、提案手法を用いた染色 agarose のゲルにアンピシリン耐性プラスミドを用いた DNA 回復試験を行った。コロニーの大きい数はより伝統的な手法で得られた SG を使用して染色私は紫外光照射。説明メソッドは高速、特定、および、transilluminator なし「肉眼で見える」生体分子の可視化をできるように DNA 検出のための非毒性を安価でフィールドでの使用に適した。これらの理由から、私たちの新しい DNA 染色法の研究と業界の両方に潜在的な利点があります。

紫塩沈殿物 (質量13によって確認される) DNA があるが表示されます。実験では, DNA の梯子は較正曲線 (図 3) に読み込まれました。アクリルアミドと agarose のゲルのプロトコルが動作しますが、低強度があり agarose の長い時間がかかります。しかし、agarose のゲルの使用により、市販のキットを使用してサンプルの回復、それは抽出と干渉しません。青色 Led でこのメソッドを使用して回復したサンプルに SG に比べると質の向上がある私は transilluminator (図 4) を使用しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56528/56528fig1.jpg"><...

このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

DNA染色プロトコールには、大きく分けて3つのステップがあります。1つ目は、ゲルをSYBRグリーンIとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の溶液に入れることです。次に、ゲルをポリアクリルアミドゲルの場合は25分間、アガロースゲルの場合は1時間撹拌します。最後のステップは、ゲルを青色LEDや太陽光などの青色光源にさらすことです。このステップでは、いくつかの沈殿物バンドが現れます。これらのバンドはDNA濃度と直接的な相関関係があり、DNAを定量化するために、ゲルをオフィススキャナーでデジタル化できます。ポリアクリルアミドゲルには、非変性ポリアクリルアミドゲルが調製されます。その後、ゲルにサンプルをロードし、電気泳動プロセスが開始されます。SYBR Green I を 1.2X に希釈し、NBT 20 ミリモル溶液を調製しました。ゲルをプラスチック容器に入れ、希釈したSYBR Green Iを16.75ミル、NBTを20ミリモルで325ミル加えます。次に、容器をパラフィルムとアルミホイルで覆い、60rpmで25分間攪拌します。最後に、アルミホイルとパラフィルムを取り除き、ゲルを日光または青色光源にさらします。バンド定量と検量線では、ゲルをオフィスのスキャナーに入れ、画像解析ソフトウェアを使用して画像を解析します。最後に、正規化されたシグナルと濃度のグラフトが作成されます。アガロースゲルが作られます。ウェルにはアンピシリン耐性を持つプラスミドを充填し、ゲルを2つに切断し、それぞれを異なる染色で染色します。次に、プラスミドバンドを抽出し、化学形質転換により、アンピシリンを含む培地を用いてコンピテントセルに変換します。1%アガロースゲルをTAE 1Xバッファーに調製し、4マイクロリットルのプラスミドを1マイクロリットルあたり約100ナノグラムで充填します。次に、電気泳動チャンバー内のゲルを100ボルトで1時間駆動します。ゲルの半分をSYBR Green IおよびNBT法で染色し、残りの半分をSYBR Green I UV法で染色します。アガロースゲルの場合、SYBR Green I NBT法は、1.2倍の濃度のSBYR Green Iと2ミリモルのNBTを使用して実行されます。ゲルをプラスチック容器に入れ、溶液の量をゲルを覆うようにスケーリングし、攪拌時間を1時間に延長します。アガロースゲルの場合、一般的に使用されるSYBR Green I法は、ゲルを1X SYBR Green I溶液で覆い、1時間撹拌することによって行われます。次に、ゲルをUVトランスイルミネーターに曝露し、バンドを2分間可視化します。ゲルを染色したら、プラスミドバンドをメスで切断し、市販の抽出キットでプラスミドを抽出します。DNAは、化学的に有能な大腸菌XL10細菌を変換するために、マイクロリットル

dna-staining-method-based-on-formazan-precipitation-induced-blue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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このビデオは、DAPI染色アッセイを使用して電離放射線(IR)誘発がん細胞株の主要な細胞死プロファイルをスクリーニングする方法を示しています。細胞死を受けている標的細胞のDAPI染色された核は、明確な形態を示し、蛍光顕微鏡で容易に同定できます。...

DAPI染色を用いた細胞死スクリーニング:がん細胞株におけるIR誘導クローン性細胞死の迅速スクリーニング法

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。...

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。...

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム...

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。...

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。...

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。...

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

このプロトコルは、タンパク質合成における天然産物/小分子阻害剤の特定に最適化されたフルオロメトリックスクリーニング手法を導入します。その実用性から、学部生向けの創薬技術教育や医薬品化学キャンペーンへの応用に適しています。...

天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

学ぶSYBR Green IとNBTを用いたゲル内DNA染色・定量法。青色光または日光で可視化し、オフィススキャナーで簡易定量可能。現地調査に適した最小限機器の生化学的手法です。

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

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