DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法
2018年1月28日
このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。
DNA染色プロトコールには、大きく分けて3つのステップがあります。1つ目は、ゲルをSYBRグリーンIとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の溶液に入れることです。次に、ゲルをポリアクリルアミドゲルの場合は25分間、アガロースゲルの場合は1時間撹拌します。
最後のステップは、ゲルを青色LEDや太陽光などの青色光源にさらすことです。このステップでは、いくつかの沈殿物バンドが現れます。これらのバンドはDNA濃度と直接的な相関関係があり、DNAを定量化するために、ゲルをオフィススキャナーでデジタル化できます。
ポリアクリルアミドゲルには、非変性ポリアクリルアミドゲルが調製されます。その後、ゲルにサンプルをロードし、電気泳動プロセスが開始されます。SYBR Green I を 1.2X に希釈し、NBT 20 ミリモル溶液を調製しました。
ゲルをプラスチック容器に入れ、希釈したSYBR Green Iを16.75ミル、NBTを20ミリモルで325ミル加えます。次に、容器をパラフィルムとアルミホイルで覆い、60rpmで25分間攪拌します。最後に、アルミホイルとパラフィルムを取り除き、ゲルを日光または青色光源にさらします。
バンド定量と検量線では、ゲルをオフィスのスキャナーに入れ、画像解析ソフトウェアを使用して画像を解析します。最後に、正規化されたシグナルと濃度のグラフトが作成されます。アガロースゲルが作られます。
ウェルにはアンピシリン耐性を持つプラスミドを充填し、ゲルを2つに切断し、それぞれを異なる染色で染色します。次に、プラスミドバンドを抽出し、化学形質転換により、アンピシリンを含む培地を用いてコンピテントセルに変換します。1%アガロースゲルをTAE 1Xバッファーに調製し、4マイクロリットルのプラスミドを1マイクロリットルあたり約100ナノグラムで充填します。
次に、電気泳動チャンバー内のゲルを100ボルトで1時間駆動します。ゲルの半分をSYBR Green IおよびNBT法で染色し、残りの半分をSYBR Green I UV法で染色します。アガロースゲルの場合、SYBR Green I NBT法は、1.2倍の濃度のSBYR Green Iと2ミリモルのNBTを使用して実行されます。
ゲルをプラスチック容器に入れ、溶液の量をゲルを覆うようにスケーリングし、攪拌時間を1時間に延長します。アガロースゲルの場合、一般的に使用されるSYBR Green I法は、ゲルを1X SYBR Green I溶液で覆い、1時間撹拌することによって行われます。次に、ゲルをUVトランスイルミネーターに曝露し、バンドを2分間可視化します。
ゲルを染色したら、プラスミドバンドをメスで切断し、市販の抽出キットでプラスミドを抽出します。DNAは、化学的に有能な大腸菌XL10細菌を変換するために、マイクロリットルあたり9.1ナノグラムに正規化されています。最後に、コロニーがカウントされます。
コロニー形成単位が計算されます。結果をグラフトし、SYBR Green I NBTとSYBR Green I UVから得られた結果を比較します。DNAが位置する場所に紫色のホルマザン沈殿物が現れます。
実験では、DNAラダーをロードして、1, 500塩基対で192ピコグラムの検出限界を持つ検量線を作成しました。アガロースゲルを使用すると、市販のキットを使用してサンプルを回収でき、抽出を妨げません。青色LEDでこの方法を使用すると、トランスイルミネーターを使用したSYBR Green Iと比較して、一部の回復がより良い結果になります。
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概要
この手法では、SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium溶液を用いて、ゲル中のDNAを選択的に染色および定量することが可能です。本プロセスは必要最小限の器具で実施できるため、フィールドでのアプリケーションに適しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 分子生物学
- フィールドアプリケーション
背景
- DNA定量は、さまざまな生物学的研究において不可欠です。
- 従来の方法では、複雑な装置が必要となることが多くありました。
- 本手法により、プロセスを大幅に簡略化できます。
- 一般的な試薬を用いて、効果的な結果を得ることが可能です。
研究目的
- DNA染色のための簡便な手法を開発すること。
- 異なる種類のゲルにおけるDNAの定量化を可能にすること。
- 最小限の設備要件でフィールドワークを容易にすること。
使用された手法
- ゲルをSYBR Green IおよびNBT溶液に浸漬する。
- ゲルを25分間（ポリアクリルアミドの場合）または1時間（アガロースの場合）撹拌する。
- ゲルを青色光源または日光にさらす。
- DNA定量のためにゲルのデジタル化を行う。
主な結果
- 可視的な沈殿バンドはDNA濃度と相関します。
- 最小限の設備で効果的な染色が可能です。
- 結果は標準的なオフィス用スキャナーを用いて定量化できます。
- 本手法はフィールド条件下での信頼性が実証されています。
結論
- 本手法は、DNA定量のための実用的なアプローチを提供します。
- さまざまなゲルの種類やフィールドでのアプリケーションに適しています。
- 遠隔地にいる研究者のアクセシビリティを向上させます。
よくある質問
産業界における重要性
このDNA染色法により、特殊な装置を用いることなく核酸の直接的な視覚化と定量化が可能となり、リソースの限られた環境における迅速なターゲットバリデーションがサポートされます。UVトランスイルミネーターへの依存を排除することで、初期探索ワークフローにおける安全上のリスクと操作の複雑さを軽減します。本アプローチは、染料ベースのシグナルとDNA濃度の再現性のある相関を通じて予測の信頼性を高め、リード同定パイプラインにおけるgo/no-go判断を促進します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：フォルマザン沈殿の強度とDNA濃度の直接的な相関により仮説検証が可能となり、ターゲットエンゲージメントの評価を支援する。
- 運用上の価値：室温での攪拌と青色光照射を用いるため、危険なUVプロトコルや専用のイメージング装置を回避できる。
- 予測的価値：オフィス用スキャナーと互換性のある定量的な出力を提供し、異なる実験条件下での核酸収量の迅速な比較を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 高スループットの核酸スクリーニング形式において標準的な読み取り値として機能する、安定した可視的な沈殿バンドを生成します。
- 再現性： 定義された撹拌時間（ポリアクリルアミドで 25 min、アガロースで 60 min）およびスケール可能な試薬濃度により、バッチ間で一貫した信号生成が保証されます。
- プラットフォームの互換性： アガロースゲルとポリアクリルアミドゲルの両方で動作するため、変異体またはプラスミド解析のための既存の電気泳動ワークフローにシームレスに統合可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳の連続性： UVベースの手法と比較してコロニー形成単位が高くなることが示されており、染色後の機能性プラスミドの回収をサポートし、下流での機能検証を可能にします。
- メカニズム的なリスク低減： UVによるDNA損傷を回避し、サンプルの完全性を維持することで、表現型スクリーニングアッセイにおける正確な遺伝子型-表現型相関を実現します。
- 前臨床での有用性： 研究室のインフラがなくても、前臨床モデルにおける遺伝子発現コンストラクトやウイルスタイターの現場での定量化を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、核酸抽出から機能アッセイの検証に至るディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続的プロセス）に適合しており、特に装置へのアクセスが制限されている場合や、迅速な反復試行が必要な場合に有効です。
- 探索生物学：経路調節研究における転写効率または編集効率と相関する定量可能なDNAリードアウトを提供し、ターゲットの検証を支援します。
- スクリーニング：CRISPRまたは過剰発現ライブラリにおけるヒット確認のための標準化された核酸定量を可能にし、アッセイの再現性を向上させます。
- 分析：オフィススキャナーによる画像化を通じて線形のシグナル濃度曲線を生成し、マルチウェルプレートまたはゲルベースのフォーマット全体でのデータ標準化をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitro機能アッセイのために完全な核酸の回収を容易にし、探索から前臨床有効性試験への橋渡しを行います。
- 企業内での再利用：SYBR Green I、NBT、および青色光源のみを必要とするため、複数のプロジェクトチーム間で利用可能な低コストで再利用可能なモジュールとなります。
運用および企業への影響
- 科学的価値： UV誘起のアーティファクトを回避することでメカニズムの曖昧さを軽減し、ターゲット検証アッセイにおけるデータの信頼性を向上させます。
- 運用上の価値： 暗室や透過照明装置が不要になるため、スループットが向上し、共有コアファシリティにおけるボトルネックが解消されます。
- 戦略的価値： 核酸定量の設備投資額を抑え、サテライトラボや共同研究拠点での分散型試験を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 下流の精製に投資する前に、装置に依存せず構築物の収量を早期に確認できるため、リスクを調整した研究推進をサポートします。
実施上の検討事項
- ゲルの作製および電気泳動に関する基礎的な分子生物学のトレーニングが必要です。
- 青色光源（例：470 nm LED）または日光、および標準的な実験室用攪拌装置へのアクセスが必要です。
- ラボ間の再現性を確保するため、染色の時間と試薬濃度を標準化する必要があります。
- ゲルの操作が手動であるため、ハイスループット形式への最適化が必要になる場合があります。
- 核酸検出に限定されており、適応させない限りタンパク質または低分子化合物のアッセイには適用できません。
