Name: 飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶマクロファージにおける飽和脂肪酸誘導細胞死とセラミド蓄積の関連性。骨髄由来マクロファージの調製法とBSA-脂肪酸共役体の作製法を解説し、代謝性炎症のメカニズム解明に役立つ実験手法を紹介します。

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この作品はルイビル大学スタートアップ資金によって部分的に支えられた、国立癌研究所 (メリーランド州ベセスダ) は、R01CA177679、R01CA180986 を許可します。

プロトコル制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ルイビル大学の承認されました。
 1 です。 マウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) <ol><li>安楽死 CO 2 を使用して 6-8 週齢、健康の野生型マウス。発泡ボードにピンし、それがずぶぬれになるまで、70% エタノールをスプレーします。鉗子、はさみで脛骨・大腿骨骨を削除します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 5 ml 1 シャーレに入れてください。生殖不能の条件の下ですべての手順を実行します</li>。
	<li>カット滅菌のティッシュ文化フードのハサミで脛骨・大腿骨骨の両端オープン。15 mL チューブに PBS + 2% ウシ胎児血清 (FBS) 25 G 針と骨をフラッシュします</li>。
	<li>500 x g、5 分のための 4 ° C で骨髄細胞を遠心分離</li>
	<li>は、1 分未満 9 mL の 1x PBS ですぐに Dilute 赤血球 (RBC) を溶解して 1 mL 赤血球細胞換散バッファーの細胞ペレットを再懸濁します。手順 1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします</li>。
	<li>10 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します、細胞破片/塊を削除する別の 15 mL チューブに滅菌 40 μ m ナイロン メッシュを通して細胞懸濁液をフィルタ リングします。1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします</li>。
	<li>15 mL ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 1640 5 %fbs と 10 μ g/mL ゲンタマイシン、浮動取り出す 60 分ゆっくり旋回、皿の 37 o C インキュベーターで 100 mm 培養皿の細胞板細胞ペレットを再懸濁します。細胞し、それらをカウントします</li>。
	<li>10 ng/mL 遺伝子組換えマウスのマクロファージ 12 mL マクロファージ メディア (5 %fbs と 30 %l929 エアコン メディア 10 混合 10 G/ml ゲンタマイシン RPMI 1640) を区別すると 100 mm ディッシュの 6 x 10 6 セルを板します。2 日間のコロニー刺激因子 (M-CSF).</li>
	<li>5% CO 2 と 37 ° C の定温器で 2 日間培養後 6 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化と各料理をフィードします</li>。
	<li>5 日セルを妨げないでを古いメディアの 8 mL を取るし、10 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化を追加します</li>。
	<li>7 日セル リフターを使用して骨髄由来マクロファージ (BMDMs) を収穫します 。
	注: 接続されているマクロファージにも分離 5 mL 1 mM EDTA 5 〜 10 分の 1 × PBS のフロートのセルを削除し、5 mL の 1x PBS で 2 回プレートを洗浄した後。手順 1.3 のように細胞を遠心分離機します。 新鮮なマクロファージ、メディアの差別化でそれらを再懸濁します、診断に数を数えます。
	<ol><li>確認、BMDMs &#39; としてフローサイトメトリーによる表現型に 5 が記述されています。次の研究の特定の濃度でマクロファージ由来のマウスを準備します</li>。
	</ol></li></ol> 2。BSA 脂肪酸酸共役準備 <ol><li>準備 2 mM BSA 滅菌 PBS。たとえば、50 mL まで多くの PBS を追加、6.65 g BSA に溶かすために、30 mL の 1x PBS を追加重量を量る 1x PBS で 2 mM BSA をするコンポーネントをスケーリングします</li>。
	<li>2 mM BSA の脂肪酸の準備 5 mM 個々 のナトリウム塩。必要に応じて、37 ° c 以上の熱し、透明な溶液が得られるまで 2 mM BSA の混合物および脂肪酸のナトリウム塩を超音波照射します 。
	注: に比べて不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸必要があります高温、超音波処理に多くの時間を溶解するため</li>。
	<li>フィルター脂肪酸酸 BSA ソリューションを通じて、0.22 μ m フィルター、因数に 1.5 mL 滅菌遠心チューブ、短期使用のための 4 ° c または長期保管のための-20 ° C で保管します。冷蔵庫で 4 ° c の貯蔵の後の沈殿物必要がありますられなかった</li>。
</ol> 3。飽和脂肪酸誘導細胞死マウス骨髄由来マクロファージの <ol><li>メディアの差別化マクロファージ 10 6/mL × 0.4 で 24 ウェル培養プレートに BMDMs をプレートします</li>。
	<li>は、0.4 mM パルミチン酸とステアリン酸 5% CO 2 と 37 ° C の定温器で 16 ~ 24 時間のセルを扱います。負の制御として BSA を使用します</li>。
	<li>治療後セル リフターと細胞を収穫し 500 x g、4 ° C、5 分で細胞をスピン</li>
	<li>アネキシン V アレクサ 488 と 100 で 7 aminoactinomycin D (7 AAD) で細胞を染色アネキシン V 結合バッファー室温で 15 分間 μ L.</li>
	<li>200 μ L のアネキシン結合バッファーでサンプルを希釈、優しく、ミックスし、潜伏期間後に氷のサンプルを維持します</li>。
	<li>は流れ cytometry 5 によってできるだけ早く陽性細胞を分析します。アネキシン V アレクサ 488 が FITC チャンネルで検出され、PerCP/PerCP Cy5.5 チャネルで 7 AAD が検出された</li>。
</ol> 4。セラミドの細胞内染色 <ol><li>脂肪酸処理後ステップ 3.3 のように細胞を収穫します。30 分 4% パラホルムアルデヒドでセルを修正し、</li>
	<li>1 mL の 1x PBS でサンプルを洗って、スピン ・ ダウンとしては 3.3 では、ステップし、上清をデカントします</li>。
	<li>30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで対策セラミド一次抗体 (希釈 1: 200) と細胞を染色</li>
	<li>洗浄とスピン ダウン ステップ 4.2 のようにもう一度セル</li>。
	<li>30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで抗マウス igm 抗体二次抗体 (1: 500 希釈) と細胞を染色</li>
	<li>洗って、スピン ステップ 4.2 のように再びセルをダウンします。250 μ L 1 × PBS を追加し、流れの cytometry の 5 によって染色の細胞を分析します 。
	メモ: は、機器や試薬のテーブルの詳細な試薬リストを参照してください</li>。
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

著者は金融利害を宣言しません。

脂肪酸ソリューションの適切な準備は、脂肪酸の生物学的機能を研究する非常に重要です。脂肪酸の中和は、水溶液中での溶解性を増加します。ただし、特に飽和脂肪酸、脂肪酸のナトリウム塩は、水または PBS に難溶のまだ見ました。1 つの方法は、脂肪酸1を溶解するために 95-100% エタノールを使用することです。このメソッドを使用して、高い細胞毒性毒性が低く不飽和脂肪酸の低濃度でもなることがあります。脂肪酸ソリューションを準備する別の方法は、配信システムとして、脂肪酸がある最適な条件は、そのフォーム単量体9,11溶液メチル-β-シクロデキストリンを活用することです。このような法により作製した脂肪酸登場、正常な機能を持っているが、複雑な方法の実施です。細胞増殖に対するメチル-β-シクロデキストリンの影響は、高濃度が細胞死12につながる可能性です。飽和のステアリン酸とパルミチン酸可溶化9を支...

脂肪酸は、異なる種類の細胞膜リン脂質の合成、エネルギー代謝に重要な役割を果たします。脂肪酸には、低水溶解度があります。脂肪酸の適切な準備は、哺乳類細胞における脂肪酸の生物学的機能を研究するため非常に重要です。脂肪酸はエタノールを使用して、多くの脂肪酸が比較的低濃度1でも細胞膜への有毒な石鹸 (洗剤) 影響が表示されます。血清中遊離脂肪酸の自然、主要なトランスポーター、血清アルブミンは脂肪酸配信体外用脂肪酸機能試金2,3,4良いキャリアが考慮されます。しかし、脂肪酸組成と血清アルブミンの共役の準備の詳細通常ご利用いただけませんにもかかわらず、脂肪酸を使用して多くの研究論文が公開されています。
マクロファージには、表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪脂肪酸結合タンパク質5,6,7,8高い表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能を調節する可能性があります。マクロファージや他の細胞に脂肪酸の影響を研究するには、脂肪酸の準備のさまざまな方法は応用1,7,9.生物学的意味のあるデータを得ることは非常に重要です適切に準備された脂肪酸/血清アルブミン複合体を使用して、マクロファージに脂肪酸の影響を調査します。マクロファージに脂肪酸の影響に関する研究は、基本的な知識とマクロファージが関与する疾患における脂肪酸代謝に関する潜在的な治療上のターゲットを提供できます。

<table><tbody><tr><td>CPX超音波浴&nbsp;</td><td>ブランソニック</td><td>モデル2800</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸ナトリウム(PA)</td><td>Nu-Chek Prep、Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>ステアリン酸ナトリウム (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)、脂肪酸フリー</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>マウスマクロファージコロニー刺激因子(mM-CSF)&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology株式会社</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗セラミド抗体 (マウス IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>クローン: MID 15B4</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgM 抗体, & マイクロチェーン, FITCコンジュゲート</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;セルリフター&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>注:M.W.は分子量です。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

マクロファージは高い表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪の脂肪酸結合蛋白質を表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能の調節に重要な役割を担う。様々 な脂肪酸が飽和している数多くの研究が示しているなったり不飽和、細胞の成長と機能に関する別の影響を持っています。しかし、脂肪酸の準備に使用する方法が異なります、非生理学的な結果につながる可能性があります。脂肪酸石鹸の毒性を最小限に抑える哺乳類細胞における脂肪酸関数を勉強する共役脂肪酸のナトリウム塩との複合体を形成するため、血清アルブミン、哺乳類の末梢血液中の脂肪酸のための自然なキャリアをお勧めします。したがって、単純な比較的短時間加熱・ sonicating メソッドの開発・ BSA 脂肪酸の酸の共役形成はここで説明しました。飽和脂肪酸、特にステアリン酸マウス骨髄由来マクロファージにおける深刻な細胞死を誘導するためを使用してプロトコルについて述べる。さらに飽和脂肪酸が誘導する細胞死が積極的に蓄積された細胞のセラミド レベルに関連付けられていることを示します。このメソッドは、他の哺乳類細胞の脂肪酸の影響の研究を拡張できます。

肥満では、血清中遊離脂肪酸濃度を増加させます。プロの食としては、マクロファージは、ホストの恒常性を維持するために積極的にで脂肪酸を取る。これらのプロセスの間にオーバー ロードされた脂質は、マクロファージの細胞死を引き起こす可能性があります。このためには、我々 BMDMs 培養体外肥満レベルの脂肪酸と流れフローサイトメトリーによる染色を使用して測定されたマクロファージ細胞死。BSA の制御、飽和脂肪酸と比較して特にステアリン酸、死んだ細胞はアネキシン V と 7 AAD (図 1 ab) に染まる二重肯定的な集団として示されていた BMDMs の重要な細胞死誘導。注記のうち、不飽和脂肪酸は重要なマクロファージ細胞死5を誘発しなかった。生体内で飽和脂肪酸の増加レベルの毒性の影響が示唆されました。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

骨髄細胞からマウスのプライマリ マクロファージを派生させるストレートなメソッドを示すし、BSA 脂肪酸を準備する簡単な方法が抱合体します。示す飽和脂肪酸がマクロファージの細胞死を引き起こすことができる、このような細胞死はセラミド レベルの細胞集積に積極的に関連付けられました。

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

マクロファージを飽和脂肪酸で処理するこの実験の全体的な目標は、飽和脂肪酸誘導マクロファージの細胞死が細胞の蓄積されたセラミドレベルと関連していることを実証することです。この方法は、代謝性炎症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例:飽和脂肪酸誘発性細胞死および炎症。この技術の主な利点は、BSA脂肪酸コンジュゲートを推進するためのシンプルかつ詳細なアプローチを提供することです。一般に、この分析法を初めて使用する人は、一貫した結果が得られる正確で安定したBSA脂肪酸結合溶液を調製するのが難しいため、苦労します。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、安楽死させた6〜8週齢の健康な野生型マウスから脛骨と大腿骨を取り除くことから始めます。脛骨と大腿骨の両端をハサミと滅菌組織培養フードで切り開きます。PBSと2%のウシ胎児血清を添加した25ゲージの針で骨を15ミリリットルのチューブに洗い流します。骨髄細胞を500g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸濁して、赤血球を1分間未満溶解します。細胞を9ミリリットルの1x PBSで直ちに希釈します。前と同じように再度遠心分離し、上清をデカントします。細胞ペレットを10ミリリットルの1x PBSに再懸濁します。次に、細胞懸濁液を滅菌済みの40ミクロンナイロンメッシュでろ過し、別の15ミリリットルチューブに入れて、細胞の破片と凝集物を取り除きます。前回と同様に遠心分離した後、細胞ペレットを15ミリリットルのロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地1640に再懸濁し、5パーセントのFBSと1ミリリットルあたり10マイクログラムのゲンタマイシンを添加します。次に、100 mmの組織培養皿に細胞をプレートし、摂氏37度のインキュベーターに60分間入れます。皿をそっと回し、浮かんでいる細胞を取り出して数えます。次に、12ミリリットルのマクロファージ分化培地と1ミリリットルあたり10ナノグラムの組換えマウスマクロファージコロニー刺激因子、またはMCSFを2日間、100ミリメートル皿に6,000,000個の細胞をプレートします。摂氏37度のインキュベーターで5%のCO2で2日間培養した後、MCSF1ミリリットルあたり10ナノグラムを含む6ミリリットルの新鮮なマクロファージ分化培地を各皿に供給します。5日目に、細胞を乱さずに8ミリリットルの古い培地を取り出し、10ミリリットルの新鮮なマクロファージ分化培地と10ナノグラムのMCSFを添加します。7日目に、セルリフターを使用して骨髄由来マクロファージ(BMDM)を採取します。テキストプロトコルで参照されているように、フローサイトメトリーによってBMDMの表現型を確認します。BSA脂肪酸コンジュゲートを調製するには、2ミリモルBSA中に5ミリモルの脂肪酸ナトリウム塩を調製します。必要に応じて、混合物を摂氏37度以上に加熱します。次に、2ミリモルのBSAと脂肪酸のナトリウム塩の混合物を透明な溶液が得られるまでソニックヒートします。超音波処理後、0.22ミクロンのフィルターを通して、脂肪酸BSA溶液を濾過する。次に、ろ過した溶液を1.5ミリリットルの滅菌マイクロ遠心チューブに分注します。チューブは、短期使用の場合は摂氏4度、長期保存の場合は摂氏マイナス20度で保管してください。冷蔵庫で摂氏4度で保存した後、降水量は観察されません。24ウェル組織培養プレートにBMDMを、マクロファージ分化培地中の1ミリリットルあたり40万個の細胞でプレート化します。0.4ミリモルのパルミチン酸とステアリン酸で、摂氏37度のインキュベーターで16〜24時間、5%のCO2で細胞を処理します。BSAをネガティブコントロールとして使用します。処理後、セルリフターで細胞を採取します。次に、細胞を500g、摂氏4度で5分間スピンダウンします。Annexin V-Alexa 488および7-AADを用いて、100マイクロリットルのAnnexin-V結合バッファーで細胞を室温で15分間染色します。サンプルを200マイクロリットルのアネキシン結合バッファーで希釈し、穏やかに混合します。インキュベーション期間後、サンプルを氷上に保管してください。染色した細胞をできるだけ早くフローサイトメトリーで解析します。Annexin V-Alexa 488はFITCチャネルで検出され、7-ADDはPerCP PerCP-Cy5.5チャネルで検出されます。脂肪酸処理後、以前と同様に細胞を採取します。次に、細胞を4%パラホルムアルデヒドに30分間固定します。サンプルを1ミリリットルの1x PBSで洗浄してから、以前と同様にサンプルをスピンダウンします。上清をデカントした後、100μLの1x Permeabilization Bufferで抗セラミド一次抗体で細胞を染色し、30分間保存します。前回と同様に細胞を洗浄し、遠心分離した後、100μLの1x Permeabilization Bufferで抗マウスIgM二次抗体で細胞を染色し、30分間保存します。前と同じように細胞を洗浄し、再度スピンダウンします。次に、250マイクロリットルの1x PBSを添加し、染色した細胞をフローサイトメトリーで分析します。BMDMは、食事性脂肪酸の肥満レベルとともにin vitroで培養し、マクロファージ細胞死をFlow Cytometric染色を使用して測定しました。BSAコントロールと比較して、飽和脂肪酸、特に立体酸は、BMDMの有意な細胞死を誘発しました。死細胞は、Annexin Vおよび7-AADによって染色された二重陽性集団として示されました。さらに、飽和脂肪酸による細胞死は、マクロファージの蓄積細胞セラミドレベルと正の関連があります。このビデオを見れば、BSA脂肪酸コンジュゲーションの調製方法や、BSA脂肪酸コンジュゲートによるマクロファージの治療方法、細胞死や炎症の研究方法について十分に理解できるはずです。その開発により、この技術は、代謝性炎症の分野の研究者が飽和脂肪酸誘発性細胞死と肥満の炎症を探求する道を開きました。

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV...

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。...

ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

このビデオは、インフルエンザウイルスによる刺激による骨髄由来マクロファージの複数のカスパーゼ活性化の評価を示しています。マクロファージ溶解、ライセートの熱不活性化、および遠心分離に続いて、細胞内カスパーゼを回収し、その後の免疫学的分析を行います。...

マクロファージにおける複数のカスパーゼの活性化の評価

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。...

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ...

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。...

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP...

PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in...

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

学ぶマクロファージにおける飽和脂肪酸誘導細胞死とセラミド蓄積の関連性。骨髄由来マクロファージの調製法とBSA-脂肪酸共役体の作製法を解説し、代謝性炎症のメカニズム解明に役立つ実験手法を紹介します。

飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。

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