単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

この手順の全体的な目標は、細胞のフローサイトメトリー分析を実行できるように、後根神経節から十分な細胞を、個々のマウスから坐骨神経を取得することです。一般的に、この方法に不慣れな人は、末梢神経物質が消化されるときに大量の破片を生成するため、苦労するでしょう。この方法の主な利点は、複数のマーカーを同時に使用して複数の細胞タイプを識別できることです。

この技術の意味は、神経障害中の炎症と免疫病理学の診断にまで及びます。この方法は、マウスモデルに洞察を与えることができますが、わずかな変更を加えれば、ヒトやブタの神経などの他の生物にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、消化によって生成される大量の破片のために苦労します。

マウスあたりのニューロン材料が限られているため、解剖および細胞解離のステップを実行するのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Steve Lacroixの研究室で坐骨神経から白鳥細胞を分離するプロトコルを見たときでした。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているようにマウスを準備し、下肢を伸ばしながら腹側を下にして配置します。

次に、一対の鉗子を使用して、坐骨神経全体を両側に解剖します。まず、筋肉組織を大腿上部から分離し、脊柱に沿って神経をたどります。脊柱から出る神経を切断し、もう一方の端で膝のすぐ上を切断します。

次に、切除した神経を1.5ミリリットルの氷冷PBSを含む1ミリリットルのチューブに移します。神経を氷の上に保管します。次に、後根神経節を分離します。

両側の脊柱と平行で、脊柱に近い肋骨を切断することから始めます。次に、後側の大腿骨の高さと前側の頭蓋骨の近くで脊柱を横方向に切ります。脊柱を切除し、虹彩はさみを使用して、脊椎からすべての筋肉、脂肪、およびその他の軟組織を切り取ります。

次に、腹側を上にして脊柱を留置し、ハサミの片方の先端を12時の位置で脊柱に滑り込ませ、骨を切り取って尾側の端から開きます。背骨全体が切られるまで進み、背骨が半分になるまでこの手順を6時の位置で繰り返します。脊椎の2つの半分を分離し、サンプルを解剖顕微鏡の下に置きます。

脊髄を切除して脊髄神経を露出させ、次に背根をそっと引っ張って脊柱管に引き込むことにより、腰椎後根神経節を見つけて除去します。次に、虹彩はさみを使用して、後根神経節の周りの神経と結合組織をクリップします。鉗子を使用して、後根神経節を1.5ミリリットルのチューブに移し、氷上に保存します。

後根神経節を特定し、損傷を与えることなく抽出し、脊髄神経から解放するには、運動とスキルが必要です。消化培地を準備し、デオキシリボヌクレアーゼ1ミリリットルあたり100マイクログラムを補給し、氷上に保存します。次に、500マイクロリットルの消化媒体を、坐骨神経と後根神経節の各チューブに追加します。

坐骨神経の場合は、スプリングハサミを使用して材料を15〜20回切り刻み、組織懸濁液を摂氏37度の振とうインキュベーターで20分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、1, 000マイクロリットルのピペットチップを介して細胞懸濁液を繰り返し粉砕し、不完全に消化された組織を機械的に解離します。1, 000マイクロリットルのピペットチップでトリチュレーションを繰り返します。

次に、サンプルを摂氏37度でさらに10分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。氷冷したFACSバッファーを準備し、それを使用して、メッシュサイズ140ミクロンのステンレス鋼スクリーンを氷上の60ミリメートルのシャーレにすすぎ、浸します。次に、鈍い鉗子を使用して140ミクロンのスクリーンフィルターをペトリ皿に保持し、組織懸濁液をフィルターに繰り返し通過させます。

細胞懸濁液をペトリ皿から回収し、氷上に保管されているのと同じ1.5ミリリットルのチューブに移します。フィルター上に残っている不完全な消化組織を、1, 000マイクロリットルのピペットチップで繰り返しトリチュレーションして押し込みます。次に、スクリーンフィルターを500マイクロリットルのFACSバッファーで2回すすぎ、1.5ミリリットルチューブ内の細胞懸濁液と組み合わせます。

が不完全で、金属メッシュを通過すると、細胞損失が発生し、フローサイトメトリー解析が不可能になる可能性があります。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨てます。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。

この洗浄ステップを一度繰り返し、最終細胞ペレットを150〜350マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。これで、細胞を染色する準備が整いました。コンピュータで、目的の蛍光色素を検出するための適切なチャンネル、サンプルの適切な流速、およびサンプルごとに収集されるイベントの総数を選択します。

イベントの最小数は 100 万にする必要があります。次に、グローバルワークシートの下に、サイドスキャッターAとフォワードスキャッターA、および対象となる各蛍光色素分子とフォワードスキャッターAの散布図を作成します。また、選択した蛍光色素のイベント数と平均蛍光強度を表示する統計ビューを作成します。親ゲートP1を、DAPIのみの染色コントロールからの散布図に基づいて決定します。

サンプルをフローサイトメトリーに添付し、acquireをクリックします。DAPIとFSCのプロットを観察し、DAPI+集団が見えるまでDNAパシフィックブルーチャネルの電圧を下げます。四角形ゲート ツールを使用して、DAPI+母集団の周囲にボックスを描画します。

これは P1 ゲートを表します。各蛍光色素の散布図を選択し、DAPI+イベントのみを表示します。これは、各蛍光色素のバックグラウンド蛍光を表しています。

長方形のゲーティングも使用して、各蛍光色素の散布図に、y軸上の103から始まるボックスを描画します。このゲートは、指定された各マーカーの正のイベントが見つかる領域を表します。DAPIのみの染色コントロールを使用して、各蛍光色素の電圧を調整します。

サンプルをフローサイトメトリーに添付し、acquireをクリックします。各蛍光色素の DAPI+ ポピュレーションの位置を観察し、ポピュレーションが長方形のゲートの外側に来るようにそれぞれの電圧を調整します。フローサイトメーターをセットアップしたら、サンプルを実行し、さらに分析するために前方散乱ファイルをエクスポートします。

フローサイトメトリーによる解析前にDAPI染色を洗い流すと、非核デブリの蛍光強度が低下しました。これにより、不完全に消化された組織を含む前方散乱軸の上位の材料を、シングレット集団の選択から除外することができました。全体として、2つの完全な坐骨神経から30, 000以上のシングレットを定期的に取得でき、後根神経節からは200, 000以上のシングレットを取得できます。

坐骨神経からは、シングレットの約5%がその表面にCD45を発現しているのに対し、約5%から10%が後根神経節でCD45を発現していることがわかり、これらの細胞を造血起源の白血球と定義している。CD45陽性シングレットの大部分は、MHCクラスIIも徐々に発現していました。しかし、後根神経節では、CD11bを使用してミクログリア様細胞を検出できます。このミクログリア集団は坐骨神経には存在しません。

坐骨神経節と後根神経節では、シングレットの2%から5%がCD68を発現していました。坐骨神経では、CD68陽性マクロファージの約60%80%がCD206を発現していました。一方、CD68陽性者の割合は小さく、後根神経節でCD206を共発現した。

この手順を実行するときは、一貫した結果を得るために、一貫した温度を維持することが重要です。開発後、この技術により、糖尿病の分野の研究者は、マウスの糖尿病を誘発するために使用されるストレプトゾトシンの毒性効果を調査することができました。このビデオを見れば、末梢神経組織に対してフローサイトメトリーを行う方法について十分に理解できるはずです。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは危険な場合があり、手袋や安全ゴーグルの着用など、常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。