Name: 単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学ぶマウスの坐骨神経と後根神経節から細胞を単離し、フローサイトメトリーで免疫細胞を解析する方法。複数マーカーを同時使用し、神経炎症と免疫病理の研究に応用可能です。

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本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG; によって支えられました。SFB1118)。著者は、解剖のほとんどを実行し、親切この知識を送信するためのアクセル エアハルトと流れの cytometer の技術的な面で支援するため博士フォルカー ・ エクスタインに感謝したいと思います。

野生型 c57bl/6 マウス (男性; 10-12 週) 標準的な 12 時間明暗サイクルで保たれ、標準的な食事ダイエットと水への無料アクセスを提供していた。すべての動物実験が関連するガイドラインに基づきローカル動物のケアおよび使用委員会によって行われ、カールスルーエ、ドイツ (G216/10) 地域の権限でローカル動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. マウスの灌流
<ol><li>犠牲マウス (C57BL/6;男性;10 12weeks) CO2を使用してまたはローカル規則に従って。 注: レトロ軌道出血は、EDTA コーティング 1.5 mL チューブを用いた制御白血球を取得する実行できます。この方法で出血は、犠牲の直後にのみ効率的です。さらに、腹膜腔洗浄 (PCL) は、制御のマクロファージ、37 ° C で血流を妨げる可能性があります血の冷たい凝集を避けるために事前に加熱された PBS を使用してを取得する実行できます。</li>
	<li>70 %v/v エタノールと自由に腹部の毛皮を噴霧し、繰り返しを綿ガーゼでティッシュで拭くしてマウスを消毒します。縦切開で腹部の皮膚を切開、鋏は使いよう 】 を使用します。</li>
	<li>曲線、鈍のはさみを使用して、胸郭の全体の長さに沿って切開を拡張し、横隔膜切開、胸腔内を公開します。離れて慎重に胸骨を解除ことができますまで側に同じような切口を作る。</li>
	<li>心臓や大血管のクリアな視界、蝶 23 ゲージの針、50 mL シリンジに接続して挿入は、心臓の左室に氷冷 PBS でいっぱい。</li>
	<li>下行大動脈を損傷することがなく、できるだけコンセントの同様に大きい作成するアイリスはさみを使用して心臓の右心房に切開を行い約を介してプッシュする注射器をゆっくり低下させる30 mL の PBS。滲出液は、明確な実行必要があります。肝臓や腎臓のクリアは、良い血流の指標として使用できます。</li>
</ol>2. 坐骨神経および後根神経節の郭清
注: 坐骨神経の解剖、臀筋大殿が削除されると、マウスは、上記の皮膚下に位置腹側下肢を伸ばしながら。
<ol><li>両側背側大腿から筋肉組織を分離することによって全体の坐骨神経を解剖し、脊柱に沿って神経をフォロー アップ。脊柱から、すぐにもう一方の端で膝の上が終了する神経をカットします。 注: は、破砕や鉗子で引っ張るなど神経の過剰な処理を避けてください。</li>
	<li>鉗子を使用して摘出受ける、氷冷 PBS と氷上店の 1 mL を含む 1.5 mL チューブへの神経あたり約 2 cm を転送します。 注: 神経は、氷で夜通し保存することができます。 注: 使用鉗子、メス、後根神経節の郭清のため、子宮頸、胸部、腰椎の脊髄地域を公開する残りの背部皮膚をそっと剥がして下層軟部組織から皮膚をデタッチします。鈍はさみのペアを使用して頭蓋骨の根元の切断によって頭部を取除き。</li>
	<li>脊柱の前方側に接続、内臓をデタッチする前と、両側に脊柱に近い平行リブをカットします。大腿骨をカットし、カットに対する大腿骨のレベルで横で脊柱を削除します。アイリスのはさみを使用するは、筋肉、脂肪、および背骨から他の軟部組織に切り取る。</li>
	<li>脊柱を背側を上に置き、3 位置で切り取られる骨脊柱管にはさみの先端を押し込んで、尾側から始まる、それを開くにします。9 位置に手順を繰り返します。 注: それは DRG の損傷を避けるために正確にカットすることが重要です。</li>
	<li>サイド ・ ツー ・ サイドからの切断を繰り返して吻側の端に達するし、脊髄を完全に公開します。解剖顕微鏡を用いた、脊髄脊椎内 Drg を検索する使用ことができる脊髄神経を公開するを削除します。</li>
	<li>アイリス ハサミ、Drg を削除する神経および結合組織をクリッピング、脊柱管に DRG を引っ張って後根に優しく揺さぶることにより腰椎の drg コードを削除します。 注: それは坐骨神経に貢献する L4 L6 DRG にコレクションを制限することが可能です。</li>
	<li>鉗子を使用して、約 1 mL の氷冷 PBS を含む 1.5 mL チューブに、Drg を転送および氷の上保存します。 注: 神経は、氷で夜通し保存することができます。</li>
</ol>3. 坐骨神経および後根神経節の消化
<ol><li>デオキシリボヌクレアーゼ、氷の上の店の 100 μ g/mL を添加した消化メディア (DMEM、10 mM HEPES、5 mg/mL BSA、1.6 mg/mL コラゲナーゼ型 4) を準備します。 注: マウス (坐骨神経 + DRGs) ごとに必要な消化中の量は 1 mL です。-20 ° C で消化メディアの因数を格納できる準備が整うと、</li>
	<li>500 μ L の消化メディアを含む独立した 1.5 mL チューブに 1 つのマウスから坐骨神経や drg コードを転送します。坐骨神経のため、材料を刻んで春はさみを使用してください 15-20 個セットと穏やかな攪拌 (≤ 450 rpm) と 20 分のための 37 ° C で揺れインキュベーターで組織懸濁液をインキュベーションしています。</li>
	<li>任意の不完全な消化組織を機械的に分離する 1,000 μ L ピペット チップを介して細胞懸濁液を繰り返しカップ刻んだ。 注: 懸濁液を滴定しなさいにくい場合、ピペットの先端を平滑末端を作成するハサミでカットします。穏やかな攪拌 (≤ 450 rpm) で 20 分の 37 ° C の組織懸濁液を孵化させなさい。</li>
	<li>1,000 μ L ピペット チップを製粉を繰り返し、穏やかな撹拌 (≤ 450 rpm) で 37 ° C でさらに 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>FACS バッファー (10 %fcs と 1 mM EDTA を添加した PBS) を準備し、氷の上保存します。リンス、FACS バッファー 140 μ m のメッシュ サイズ ステンレス製画面に漬 60 × 15 mm シャーレ氷の上。 注: それは有核細胞の収量の大幅な損失につながる、ナイロン スクリーン フィルターは避けてください。</li>
	<li>氷上鈍い鉗子が付いて、シャーレで開催されるように 140 μ m スクリーン フィルターを繰り返し組織懸濁液を通過します。ペトリ皿から細胞懸濁液を収集し、氷の上に格納されている新しい 1.5 mL チューブに転送。</li>
	<li>繰り返される製粉 1,000 μ L ピペット チップでを介してフィルターに残っている任意の不完全な消化組織をプッシュします。FACS バッファーの 500 μ L で 2 回画面フィルターを洗浄し、ペトリ皿ステップ 3.6 から細胞懸濁液とを組み合わせることで結果として得られる細胞懸濁液を収集します。 注: 使用される流れの cytometer が破片に敏感の場合ステップ 3.7 から細胞懸濁液通過できるか 70 μ m スクリーン フィルター;ただし、これは有核細胞の収量の損失につながる可能性があります。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。</li>
	<li>必要な (150 μ L FACS バッファー染色パネルごと) にある染色の数によって、FACS バッファーの 150 350 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリー用坐骨神経と蛍光に分類された抗体に DRG の染色
<ol><li>氷の上 96 ウェル プレートで V 字に坐骨神経の後根神経節細胞懸濁液 100 μ L を転送します。 注: 単一染色性細胞、彼らは区別から特定する光電子増倍管 (PMT) 電圧ゲインと同様、補償に関してフローサイトメトリーを設定するために必要なコントロールを提供するように使用されるすべての抗体のために必要です非特異的結合。坐骨神経および DRGs からの限られた材料のため血の白血球と単一染色コントロール、染色として使用できます (手順 1.1 1.2) PCL からマクロファージを坐骨の染色と並行して実行する必要がありますのDrg の神経.</li>
	<li>残りのプールは細胞懸濁液 (1 サンプルあたり約 50 μ L) 坐骨神経または DRG サンプル、無染色のコントロールとして機能するからです。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離します。ビンをプレートを反転し、手首の鋭い映画に適用上澄みを廃棄し、軽くペーパー タオルで乾燥。</li>
	<li>表面汚損のため (MHC クラス II-ビオチン、CD11b-PerCP/Cy5.5 CD45 A647) 興味の抗体を含む FACS バッファーの 20 μ L で各細胞ペレットを再懸濁します、インキュベート、30 分間氷の上の光から保護します。 注: (1) 最適な抗体の希釈は、製造元の製品情報によると希釈系列を実行して使用する前に決定をする必要があります。(2) 非特異的染色は、製造元の指示に従ってこの段階で Fc ブロックと孵化によって減らすことが(3) のアイソタイプ コントロール染色一般的に必要はありません直接共役、fluorophore とおよび/または興味の菌株が異なる集団を生成するときの一次抗体を使用する場合。</li>
	<li>各ウェルに FACS バッファーの 130 μ L を追加し、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心前述の (ステップ 4.3) と FACS バッファーの 150 μ L で 2 回細胞ペレットを洗浄、上澄みを廃棄します。 注: 非一次抗体またはビオチン標識一次抗体を使用する場合、この時点、fluorophore に活用される適切な二次試薬を追加できます、4.4 4.5 の手順が繰り返されます。このプロトコルの場合は、ストレプトアビジン-PE/Cy7 またはストレプトアビジン PerCP が MHC クラス II CD68 APC と F4/80-PE/Cy7 との組み合わせ、CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 との組み合わせでそれぞれ検出する使用されました。</li>
	<li>最後の洗浄工程後の固定は、100 μ L の PBS (pH 7.4) で 4% パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。10 分間氷の上プレートをインキュベートし、4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離前述 (ステップ 4.3) として上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 150 μ L で一度細胞ペレットを洗浄します。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護手袋、眼鏡などを着用してください。 注: は、FACS バッファーと 2 日前まで 4 ° C で、光から保護されたストアの 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。細胞内染色する必要がない場合は、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離後ステップ 4.11 に進みます</li>
	<li>細胞内染色の FACS buffer+0.5% 洗剤の 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、15 分 4 ° C で 5 分間遠心する 400 x g でプレートの光から保護、室温でインキュベート前述 (ステップ 4.3) として上澄みを廃棄し、FACS バッファー + 0.5% 洗剤の 150 μ L で一度細胞ペレットを洗浄します。名所 (CD68 APC、CD206 PE) 抗体を含む FACS buffer+0.5% 洗剤の 20 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、インキュベート、30 分間室温で、光から保護されています。</li>
	<li>各ウェルに FACS buffer+0.5% 洗剤 130 μ L を追加し、4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心前述の (ステップ 4.3) と FACS バッファー + 0.5% 洗剤の 150 μ L で 2 回細胞ペレットを洗浄、上澄みを廃棄します。 メモ: 非一次抗体またはビオチン標識一次抗体を使用する場合、適切な二次の試薬、蛍光体に共役を追加できますこの時点と 4.9 4.10 の手順を繰り返します。</li>
	<li>2 日前まで 4 ° C で、光から保護 FACS バッファー + 0.5% 洗剤とストアの 150 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>150 μ L FACS バッファー + 0.5% 洗剤 5 μ G/ml DAPI を添加した細胞ペレットを再懸濁します、光から保護、室温で 5 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 400 x g でプレートを遠心分離します。前述したように清 (ステップ 4.3) を破棄します。</li>
	<li>150 μ L の PBS とラベルの FACs チューブへの転送では、細胞ペレットを再懸濁します。分析のための準備ができるまで、光から保護、室温で保存します。 注: PBS に再懸濁後、細胞を分析し、時間、以内、DAPI がゆっくりと信号の損失につながる DNA から分離してしまうので。</li>
</ol>5 フローサイトメトリーおよびサンプルの実行のセットアップ
<ol><li>確実に流れの cytometer は適切なレーザーを装備、使用細胞を染色する蛍光物質を測定するフィルターを設定します。これは、システムの既定の cytometer 構成下で決定できます。このプロトコルの場合セルを行った 3 つのレーザーを搭載したフローサイト (405 nm、488 nm、および 633 nm) 5 フルオロ ≤ の検出を可能にします。</li>
	<li>興味の蛍光物質の検出のための適切なチャネルを選択します。すべての蛍光シグナルは最高対数増幅検出されます。</li>
	<li>サンプルの適切な流量を選択します。このパラメーターは、使用しているシステムによって異なることが、経験的に定められるべきであります。このプロトコルの場合 MED は-HI (35-60 μ L/分) の流量は針の目詰まりを防ぐために使用されました。</li>
	<li>サンプルごとに収集するイベント/セルの合計数を選択します。イベントの最小数は、1,000,000 をする必要があります。</li>
	<li>対 SSC A のグローバル ワークシート下散布プロットを作成する FSC の FCS A. 対利息の各 fluorophore の同様イベントおよび選択した fluorophores の平均蛍光強度 (MFI) の数を表示する統計ビューを作成します。</li>
	<li>最小の細胞が散布の低い左 10% に収まるようには、SSC、FSC A チャンネルの電圧を設定します。背景の蛍光性と坐骨神経または DRGs。 散布に基づいて親 (P1) ゲートを決定するから無染色のコントロールから最小サンプル蛍光 DAPI 専用からプロットを決定するコントロールの汚損。 注: これはありませんコレクション ゲートのため一部、PNS の DAPI + 人口の異種の性質に。</li>
	<li>興味の fluorophores の各プロット FSC 散布図を使用して、無染色のコントロールのセルは、それぞれ散布の低い四半期の中で落ちるように、電圧を調整します。ゲートごとにそれぞれマーカー/fluorophores の肯定的なそれらのセルを定義するこの地域上に作成されます。ゲートの配置は、単一染色コントロール (手順 4.1) の実行によって確認されます。 注: 発光スペクトルを重複する補償することができますこの時点で実行または適切な分析ソフトウェアを遡及的に適用されます。</li>
	<li>流れの cytometer は、説明されているように、設定されている、サンプルを実行できます。</li>
	<li>実行後残りのサンプル材料を破棄し、さらに分析の FCS ファイルはエクスポートできます。</li>
</ol>

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</ol>

著者はこの研究に関して利害の対立があります。

坐骨神経には、軸索の周りのミエリンのコンテンツのためのコレステロールなどの脂質の大部分が含まれています。以来、脂質の特性は温度によって変化、異なる温度で異なる結果を得られるかもしれない。、細胞を保護するには、氷の上消化後このプロトコルのすべてのステップを行った。結果の再現性のために、整合性を推奨しながら 3.6、3.7 室温での手順を実行して歩留まりを増加することがあります。3.8 の段階で神経は十分に消化されないされている場合神経の小片がメッシュで表示されます。不十分な消化の場合消化メディアと繰り返し手順 3.2 3.6 の 250 μ L を含む新しい 1.5 mL チューブに移すことでメッシュの保持材料を再消化されることができます。場合の利回りは、貧しい人々、セル中断のサンプル トリパン ブルー色素の光学顕微鏡の下で見られるべき (ステップ 3.6) メッシュ スクリーンを通過した後。実行可能な非-青、セルが棒のような構造体は、軸索の断片とともに表示されます。実行可能なセルが存在しない場合、消化条件や材料の不適切な取り扱いを引き起こした壊死。大規模な集計が表示されている場合にのみに遠心分離によって材料を収集し、消化 (ステップ 3...

免疫細胞、循環から PNS を入力する CD45 と CD11b、式によって定義されている神経の整合性を維持し、再生と変性の1の両方の役割を果たすに役立ちます。大食細胞 (マウス CD68 の発現によって定義された) より MHC の発現、炎症性表現型に向かって傾斜することができますクラス II および CD86 (M1)、表面にまたは抗炎症表現に向かってより多くの細胞内の CD206 を表現する (M2)2.大食細胞の表現型の傾斜は、動的なプロセスを通して Akt シグナル3、(M1) 病原体に対する防御の大食細胞と組織再生 (M2) の役割のさまざまなタスクを反映した規制です。損傷した神経の再生は最初神経4、5、および抗炎症におけるマクロファージによって髄鞘の残骸の貪食能を必要とする (CD68+CD206+) M2 マクロファージにおける軸索伸長を促進するために示されている、PNS6。募集または大食細胞を抑える、PNS や貪食障害能力障害再生と神経の恒常性を維持。MHC クラス II を表現する炎症性の M1 マクロファージは M2 マクロファージの貪食性ほどの能力であり、神経の炎症、いくつか神経変性疾患7の病因に関与しています。
神経住民免疫系の損傷の結果として発生する変更は定量的、CD45 の損失けんしょう、+白血球 (CD45 の浸潤を増加または+ケースの炎症で白血球)、や定性的なようM2 から M1 型マクロファージ表現型の変更します。PNS の免疫細胞は、凍結切片またはパラフィン包埋材料8を使用して場合によって伝統的に分析されています。もし興味のセルの局在を決定するために必要です。ただし、多くの場合数量を使用して信頼性と選択バイアスに対する脆弱性定量化を作る組織の狭いセクションのセルの比較的小さい数を数えてに依存します。大食細胞の表現型の定量が必要です少なくとも少なくとも 2 つのマーカー、特に CD206 と MHC ながら免疫細胞の特定のサブセットの識別のため細胞外および細胞内のマーカーの同時検出が必要です、クラス II です。場合によって免疫細胞の特定のサブセットの特性が制限し、不完全な要求をすることができます最もよく利用できる顕微鏡は少なくとも 2 色チャネル、かに (FITC)、フィコエ リスリン (PE) などに限られています。複数のスライドを持つ必要性は、染色し、並行分析関心の同じ領域から派生します。したがってこの時間がかかるのしない必要が大規模なサンプル セットの分析にそれ自身を貸します。さらに、興味のマーカーのほとんどが細胞外、パラフィンまたは cryoconserved にも埋め込まれています、組織で検出は膜の完全性の破壊とエピトープのマスキングと同様の損失のため問題が発生することができます。アセトン ・ メタノール9などの溶剤の使用からの興味の抗原。
対照的に、フローサイトメトリー、光を測定して単一細胞懸濁液中の蛍光特性、光のビームを通過する細胞集団の解析のためのより実用的で包括的な手段を提供します。組織のデジタル画像を生成するのではなく、フローサイトメトリー、セルの相対的なサイズおよび前方散乱 (FSC)、粒度/内部の複雑さと呼ばれる反射のインデックスを含めるパラメーターの設定の自動定量評価を提供していますか側方散乱 (SSC) と相対蛍光強度、セルは、共役抗体などの適切な蛍光でラベル付けされていますを提供します。典型的な流れの cytometer から成っている 2 つ、空冷レーザー;アルゴン レーザーは 488 で青い光を作り出す nm とヘリウム ネオン レーザーは 633 で光を生成する nm。この組み合わせは表面や細胞内コンパートメント内の少なくとも 5 つの目標の同時に、により検出と測定。高度な流れの cytometers は選択した螢のピーク発光波長が大きく重複しないを提供すること、一度に最大 8 つの異なる蛍光色素の検出を可能にする複数のレーザーで構成できます。
フローサイトメトリーによる解析、興味の組織する必要があります最初酵素によって消化される一般的にはコラゲナーゼ、単一細胞懸濁液を生成します。以前のマウスの坐骨神経の解析は、各マウスから得られた組織量が少ないため、難しかったです。さらに、軸索を髄鞘の高脂肪の内容細胞回復を阻害して大量の破片が生成されます。坐骨神経の準備と消化のためにここに記載されているメソッドは、バレッタらのシュワン細胞の隔離のプロトコルから適応されました。7、およびマウスの間の変動を減らすために十分な流れフローサイトメトリー解析のための個々 のマウスの神経細胞を分離することを目的。生組織ダイジェストで単一のセルの識別の DAPI を使用してよくセル損失につながる軸索の残骸を削除する必要性を回避できます。収量を増加脂肪の残骸内細胞のリリースで洗剤の豊富なバッファー エイズで数回洗浄に閉じ込められました。このプロトコルに従って単一のマウスから両方のフルレングスの坐骨神経の消化が ≥30、000 の単一核イベントを生成し、少なくとも 3 倍の数は、DRG から取得されました。CD45 の割合+白血球坐骨神経ダイジェスト約の合計セル コンテンツの約 5% であったDRG ダイジェストの 5-10%。CD45 の大半+坐骨神経細胞大食細胞マーカー、CD68 と CD206 を表明しました。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6</td><td>マウス チャールズ リバー</td><td>C57BL/6NCrl</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (+1g/L グルコース、グルタミン、ピルビン酸)</td><td>サーモ</td><td>31885023</td><td>この材料の供給源は重要ではありません</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 4 型</td><td>Worthington Biochemical Corp., US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS004188 ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1g</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)、熱不活性化</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>クローン M1/70</td></tr> <tr><td>に対する抗体MHC class II, biotinylated</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Antibody against CD45-A647</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Antibody against CD68-APC</td><td>Biolegend</td><td>137007</td><td>Clone FA/11</td></tr><tr><td>Antibody against CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td>141706</td><td>Clone C068C2</td></tr><tr><td>Antibody against F4/80-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>クローンBM8</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-PE/Cy7</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>405206</td><td>CD45-A647およびCDllb-PerCP/Cy5.5</td></tr>スト<tr><td>レプトアビジン-PerCP</td><td>バイオレジェン</td>ド<td>405213</td>で<td>MHCII-ビオチンを検出するために使用されます CD68-APCおよびF4/80-PE/Cy7</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>でMHCII-ビオチンを検出するために使用されますPBSで50倍に希釈し、4°Cで保存します。C in the dark</td></tr><tr><td>細胞解離ふるい - ティッシュグラインダーキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1</td><td></td></tr><tr><td>V-Shaped, 96ウェルプレート</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M8185</td><td></td></tr><tr><td>5ml ポリストリエン丸底チューブ, 12x75mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>60x15mm ペトリ皿</td><td>Greiner/Sigma</td><td>Z643084</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

末梢神経系 (PNS) で神経居住者免疫細胞が正常な神経で神経細胞の整合性を維持するため不可欠です。PNS の免疫細胞は怪我と病気、神経機能と再生能力に影響を受けます。神経免疫細胞は、蛍光抗体法 (IF) によって分析される一般的。一方、神経の免疫細胞の場所を決定する場合に不可欠な半定量的なだけあり、メソッドが同時に分析することができるマーカーの数および発現の程度に限定。この研究では、cytometry 流れは坐骨神経や個々 のマウスの後根罹 (Drg) に白血球浸潤の定量的解析に使われました。DAPI を使用して単一細胞分析を行った、いくつかのタンパク質は表面または細胞内のいずれかの式を同時に行った。このプロトコルに従って扱われた 1 つのマウスからの両方の坐骨神経には、≥ 30,000 単一核イベントが生成されます。坐骨神経の全セルの内容の 5%、DRG の約 5-10%、CD45 の表現によって決定される坐骨神経の白血球の割合は約だった。フローサイトメトリー マーカーの数を同時に測定するための柔軟性は、シュワン細胞、血管など、神経の中に存在他の細胞集団が、このプロトコルは PNS 内免疫細胞の人口に主に焦点を当てて、します。、、線維芽細胞と血管内皮細胞も分析できますこのメソッドを使用します。このメソッドは、したがって全身に及ぼす神経毒性学など神経障害や糖尿病などの慢性疾患の遺伝学的モデル、PNS の勉強の新しい手段を提供します。

フルレングスの坐骨神経すべての主要な後根神経節から細胞を懸濁液六つの健康的な c57bl/6 マウスからプロトコルに従って準備、汚損のための 3 つの等しい因数に分かれています。DNA を汚す DAPI 染色カウンターは、単一細胞集団 (図 1 a-B、上部のパネル) の検出が可能です。洗浄、フローサイトメトリーによる解析の前に、DAPI は単一核イベントまたはシングレットの FSC 軸上離散の人口の選択は、無核の破片の蛍光強度程度に減少しました。PNS からシングレットは FSC の大規模な範囲、SSC (図 1) に分散されていると、コレクションのゲートは適用されません。不完全を含む FSC 軸のハイエンドの材料組織を消化、一重項の人口 (図 1 a-B) ...

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々 のマウスの神経から免疫細胞のフローサイトメトリー解析のため十分な細胞を提供する準備のためのメソッドについて説明します。

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

この手順の全体的な目標は、細胞のフローサイトメトリー分析を実行できるように、後根神経節から十分な細胞を、個々のマウスから坐骨神経を取得することです。一般的に、この方法に不慣れな人は、末梢神経物質が消化されるときに大量の破片を生成するため、苦労するでしょう。この方法の主な利点は、複数のマーカーを同時に使用して複数の細胞タイプを識別できることです。この技術の意味は、神経障害中の炎症と免疫病理学の診断にまで及びます。この方法は、マウスモデルに洞察を与えることができますが、わずかな変更を加えれば、ヒトやブタの神経などの他の生物にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、消化によって生成される大量の破片のために苦労します。マウスあたりのニューロン材料が限られているため、解剖および細胞解離のステップを実行するのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Steve Lacroixの研究室で坐骨神経から白鳥細胞を分離するプロトコルを見たときでした。まず、付属のテキストプロトコルで説明されているようにマウスを準備し、下肢を伸ばしながら腹側を下にして配置します。次に、一対の鉗子を使用して、坐骨神経全体を両側に解剖します。まず、筋肉組織を大腿上部から分離し、脊柱に沿って神経をたどります。脊柱から出る神経を切断し、もう一方の端で膝のすぐ上を切断します。次に、切除した神経を1.5ミリリットルの氷冷PBSを含む1ミリリットルのチューブに移します。神経を氷の上に保管します。次に、後根神経節を分離します。両側の脊柱と平行で、脊柱に近い肋骨を切断することから始めます。次に、後側の大腿骨の高さと前側の頭蓋骨の近くで脊柱を横方向に切ります。脊柱を切除し、虹彩はさみを使用して、脊椎からすべての筋肉、脂肪、およびその他の軟組織を切り取ります。次に、腹側を上にして脊柱を留置し、ハサミの片方の先端を12時の位置で脊柱に滑り込ませ、骨を切り取って尾側の端から開きます。背骨全体が切られるまで進み、背骨が半分になるまでこの手順を6時の位置で繰り返します。脊椎の2つの半分を分離し、サンプルを解剖顕微鏡の下に置きます。脊髄を切除して脊髄神経を露出させ、次に背根をそっと引っ張って脊柱管に引き込むことにより、腰椎後根神経節を見つけて除去します。次に、虹彩はさみを使用して、後根神経節の周りの神経と結合組織をクリップします。鉗子を使用して、後根神経節を1.5ミリリットルのチューブに移し、氷上に保存します。後根神経節を特定し、損傷を与えることなく抽出し、脊髄神経から解放するには、運動とスキルが必要です。消化培地を準備し、デオキシリボヌクレアーゼ1ミリリットルあたり100マイクログラムを補給し、氷上に保存します。次に、500マイクロリットルの消化媒体を、坐骨神経と後根神経節の各チューブに追加します。坐骨神経の場合は、スプリングハサミを使用して材料を15〜20回切り刻み、組織懸濁液を摂氏37度の振とうインキュベーターで20分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、1, 000マイクロリットルのピペットチップを介して細胞懸濁液を繰り返し粉砕し、不完全に消化された組織を機械的に解離します。1, 000マイクロリットルのピペットチップでトリチュレーションを繰り返します。次に、サンプルを摂氏37度でさらに10分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。氷冷したFACSバッファーを準備し、それを使用して、メッシュサイズ140ミクロンのステンレス鋼スクリーンを氷上の60ミリメートルのシャーレにすすぎ、浸します。次に、鈍い鉗子を使用して140ミクロンのスクリーンフィルターをペトリ皿に保持し、組織懸濁液をフィルターに繰り返し通過させます。細胞懸濁液をペトリ皿から回収し、氷上に保管されているのと同じ1.5ミリリットルのチューブに移します。フィルター上に残っている不完全な消化組織を、1, 000マイクロリットルのピペットチップで繰り返しトリチュレーションして押し込みます。次に、スクリーンフィルターを500マイクロリットルのFACSバッファーで2回すすぎ、1.5ミリリットルチューブ内の細胞懸濁液と組み合わせます。サンプルの消化が不完全で、金属メッシュを通過すると、細胞損失が発生し、フローサイトメトリー解析が不可能になる可能性があります。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨てます。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。この洗浄ステップを一度繰り返し、最終細胞ペレットを150〜350マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。これで、細胞を染色する準備が整いました。コンピュータで、目的の蛍光色素を検出するための適切なチャンネル、サンプルの適切な流速、およびサンプルごとに収集されるイベントの総数を選択します。イベントの最小数は 100 万にする必要があります。次に、グローバルワークシートの下に、サイドスキャッターAとフォワードスキャッターA、および対象となる各蛍光色素分子とフォワードスキャッターAの散布図を作成します。また、選択した蛍光色素のイベント数と平均蛍光強度を表示する統計ビューを作成します。親ゲートP1を、DAPIのみの染色コントロールからの散布図に基づいて決定します。サンプルをフローサイトメトリーに添付し、acquireをクリックします。DAPIとFSCのプロットを観察し、DAPI+集団が見えるまでDNAパシフィックブルーチャネルの電圧を下げます。四角形ゲート ツールを使用して、DAPI+母集団の周囲にボックスを描画します。これは P1 ゲートを表します。各蛍光色素の散布図を選択し、DAPI+イベントのみを表示します。これは、各蛍光色素のバックグラウンド蛍光を表しています。長方形のゲーティングも使用して、各蛍光色素の散布図に、y軸上の103から始まるボックスを描画します。このゲートは、指定された各マーカーの正のイベントが見つかる領域を表します。DAPIのみの染色コントロールを使用して、各蛍光色素の電圧を調整します。サンプルをフローサイトメトリーに添付し、acquireをクリックします。各蛍光色素の DAPI+ ポピュレーションの位置を観察し、ポピュレーションが長方形のゲートの外側に来るようにそれぞれの電圧を調整します。フローサイトメーターをセットアップしたら、サンプルを実行し、さらに分析するために前方散乱ファイルをエクスポートします。フローサイトメトリーによる解析前にDAPI染色を洗い流すと、非核デブリの蛍光強度が低下しました。これにより、不完全に消化された組織を含む前方散乱軸の上位の材料を、シングレット集団の選択から除外することができました。全体として、2つの完全な坐骨神経から30, 000以上のシングレットを定期的に取得でき、後根神経節からは200, 000以上のシングレットを取得できます。坐骨神経からは、シングレットの約5%がその表面にCD45を発現しているのに対し、約5%から10%が後根神経節でCD45を発現していることがわかり、これらの細胞を造血起源の白血球と定義している。CD45陽性シングレットの大部分は、MHCクラスIIも徐々に発現していました。しかし、後根神経節では、CD11bを使用してミクログリア様細胞を検出できます。このミクログリア集団は坐骨神経には存在しません。坐骨神経節と後根神経節では、シングレットの2%から5%がCD68を発現していました。坐骨神経では、CD68陽性マクロファージの約60%80%がCD206を発現していました。一方、CD68陽性者の割合は小さく、後根神経節でCD206を共発現した。この手順を実行するときは、一貫した結果を得るために、一貫した温度を維持することが重要です。開発後、この技術により、糖尿病の分野の研究者は、マウスの糖尿病を誘発するために使用されるストレプトゾトシンの毒性効果を調査することができました。このビデオを見れば、末梢神経組織に対してフローサイトメトリーを行う方法について十分に理解できるはずです。パラホルムアルデヒドの取り扱いは危険な場合があり、手袋や安全ゴーグルの着用など、常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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マウス脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製

出典: Hidmark, A. S., 他 フローサイトメトリーを用いた1匹のマウスの単一坐骨神経および後根神経節の免疫細胞の解析。 J. Vis. Exp. (2017).

フローサイトメトリーを用いたマウス神経組織における免疫細胞の解析

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虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

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ここで、マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓の研究をするこれらの細胞をフローサイトメトリーを排水から単一セルを準備するためのプロトコルを提案する.さらに、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いた T...

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変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。...

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。...

フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。...

出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

学ぶマウスの坐骨神経と後根神経節から細胞を単離し、フローサイトメトリーで免疫細胞を解析する方法。複数マーカーを同時使用し、神経炎症と免疫病理の研究に応用可能です。

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

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