Name: 体外ファブリとポンペ病の薬理学的シャペロン応答性をテストする酵素測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶファブリー病とポンペ病の薬理学的シャペロン応答性を評価する細胞培養ベースの酵素測定法。高い再現性を持つこの手法は、リソソーム貯蔵症の治療薬開発と遺伝子型・表現型相関の研究に有用です。

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著者は、優れたテクニカル サポートのマンディ Loebert とティナの Czajka を認めたいと思います。編集のヘルプ言語ありがとうフローラ羅 (ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、米国)。

1. 変異体 pcDNA3.1/GLA および pcDNA3.1/GAA 構造の作製
注: GLAおよびGAA塩基配列 (cd) のクローニングの戦略は、報告された以前15,18をされています。
<ol>
	<li>サイト指示された突然変異誘発を使用してサイト指示された突然変異誘発
	<ol>
		<li>使用参照シーケンス NM_000169.2 と NM_000152.4 GLAおよびGAAの遺伝子の突然変異誘発のためのテンプレートとしてそれぞれ。センスとアンチセンスのプライマーを個別に突然変異を導入する長さ中央それぞれのシーケンスの修正の 1 つを運ぶ商業プロバイダーによって合成高純度塩無料プライマー (25-37-mers) のセットがあります。無料プライマー設計ツールを使用してプライマー デザイン19をサポートします。</li>
		<li>反応混合物を反応液の標準的条件と、製造元から提供された PCR 条件を使用します。<ol>
			<li>ミックス 5 μ L 反応バッファー、10 x 10 の二重鎖テンプレート プラスミド (pcDNA3.1/GLA または pcDNA3.1/GAA) の ng 125 各プライマーの ng、提供 dNTP の混合物の 1 μ L、3 μ L の脱イオン水 (最終反応ボリュームの適切なボリュームで DMSO 試薬: 50 Μ L)。最後に、2.5 U の DNA ポリメラーゼを追加し、上下にピペッティングで混ぜます。ネガティブ コントロールとしてのプライマーのサンプルに沿って運ぶ。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>次のプログラムを使用して PCR を開始: 1:95 ° C 1 分ステップ 50 2:95 ° C、s、ステップ 3時 60分 50 ° C s、ステップ 4:68 ° C で 8 分、18 回手順 2-4 を繰り返し、ステップ 5:68 ° C で 10 分間。<ol>
			<li>PCR、 Dpnの 1 μ L を追加します私制限酵素 (10 U/μ L) とさらに 1 h の 37 ° C で反応、バイアルを孵化させなさい。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>変換および目的のクローンのスクリーニング
	<ol>
		<li>製造元の推奨事項に従って ultracompetent 細胞の因数を変換します。使用 SOC 培地 (トリプトン 2% (w/v)、酵母エキス 0.5% (w/v)、塩化ナトリウム 10 mM KCl 2.5 mM、121 ° C で滅菌、MgCl2 10 および 20 の mM の最終濃度までブドウ糖の無菌ろ過ソリューションをそれぞれ追加) メーカーの代わりに媒体。手順の後 LB のサンプルの突然変異のプレート 250 μ L プレート含む 100 μ g/mL アンピシリンと 18 h の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>確実に形質転換体数 &#62; 10 と反応の結果は少なくとも 3 倍多く植民地にプライマーなしコントロールの反応は、例えば、発光プレートを使用してコロニー カウントを容易にします。3 コロニーをピックアップし、流体培養基 LB 培地で一晩培養 3 mL を準備します。</li>
		<li>次の日は標準的なキットでプラスミッドの準備を行い T7 を使用してシーケンス全体を分析 (5ʹ TAA TAC GAC TCA CTA タグ GG-3ʹ) 標準サンガー経由 (5ʹ タグ AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) bghr あるプライマーの配列。</li>
		<li>分子生物学の適切なツールを使用して、シーケンスを分析します。望ましい突然変異が検出された場合、さらにシーケンス NM_000169.2 (α-ガラクトシダーゼ A) と比較して異常なしまたは NM_000152.4 (酸性 α-グルコシダーゼ) を見て、トランスフェクション グレード プラスミッドの浄化のためのクローンを選択します。</li>
		<li>分光光度計で吸光度を測定することによって DNA の純度を決定します。 注: 許可の 260/280 吸光度比を持つプラスミドの純度をもたらす準備のみ &#62; 1.8 細胞培養します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HEK293H 細胞の培養
<ol>
	<li>高グルコース (4.5 g/L) Dulbecco´s Modified イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンの HEK293H 細胞を維持します。セルをおいて、5% CO2雰囲気下で 37 ° c の定温器を water-jacket。</li>
	<li>80-90% の密度に細胞を養います。</li>
	<li>培地を吸引し、生理食塩水 (PBS) Ca2 +と Mg2 +なしをバッファリングされるリン酸を使用してを洗ってください。</li>
	<li>0.05% を追加することにより通路トリプシン-EDTA し 37 ° C、5% CO2で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>恒久的な文化を維持するために新しい T75 フラスコに新鮮な媒体および種子内のセル 1:15 を分割します。以上 25 通路でセルを使用しないでください。</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA と pcDNA3.1/GAA プラスミド トランスフェクションと HEK293H 治療
<ol>
	<li>24 時間、トランスフェクション前は、Ca2 +Mg2 +を持つ PBS で一度コート t75 フラスコ細胞培養用フラスコの HEK293H セルを洗浄します。収穫の 10% を 500 μ l 添加 DMEM 培を使用して 24 よく培養プレートの空洞中 0.05% トリプシン-EDTA 上記細胞と種子 1.5 x 105 FBS 抗生物質なし。</li>
	<li>製造元のマニュアルによるとトランスフェクション プロトコルを実行します。通常、無血清 DMEM の 100 μ L に 1 μ g のプラスミド DNA とトランスフェクション試薬の 2.5 μ L の混合物を使用します。室温で 20 分間インキュベートし、その後伝の方法でセルに追加します。</li>
	<li>37 °C/5% CO2で 4 時間の期間の後のトランスフェクション試薬を含む培地を取り除き、10% 新鮮な DMEM を 500 μ l 添加 FBS/1% ペニシリン/ストレプトマイシン。 注: この手順では、1-Deoxygalactonojirimycin 塩酸塩 (DGJ) または塩酸 1 ‐ デオキシノジリマイシン (DNJ) 可能性がありますに追加培意図した場所 (20 μ M の最終濃度を得るために 10 mM の水性原液を使用 DGJ、DNJ).新鮮な DGJ または DNJ は、プラスミド トランスフェクション後 42 h を追加しました。</li>
</ol>
4. 細胞収穫と α-ガラクトシダーゼ A または酸性 α-グルコシダーゼ活性の測定
<ol>
	<li>セル収穫
	<ol>
		<li>収穫の日、インキュベーターからセルを削除し、培地を吸引します。Ca2 +と Mg2 +を PBS で 2 回細胞を慎重に洗います。 注: DGJ と DNJ は、それぞれ α-ガラクトシダーゼの α-グルコシダーゼ阻害剤と残ったテストが無効になるために、この手順は重要です。</li>
		<li>セルの上に直接脱イオン水の 200 μ L を追加します。リンスのプレートから細胞と 1.5 mL の反応管にそれらを転送します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凍結融解による均質化
	<ol>
		<li>適切な泡ラックと 5 の渦にサンプルを置く s、換散をより効率的に。交互に 10 の液体窒素でサンプルを置く s と解凍が完了 (5 分) になるまで室温水のお風呂に。</li>
		<li>5 回この手順を繰り返すし、10,000 × g で 5 分間のサンプルをスピンします。</li></ol></li></ol>上澄みと新しい反応管にピペットを保持します。
	
	
	<li>ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いた蛋白質の集中の決定
	<ol>
		<li>各サンプルについては 40 μ L の脱イオン H2O を含む新鮮なチューブを準備し、10 μ L のサンプルを追加します。ボルテックスによって簡単にソリューションをミックスし、96 well プレート (各 3 通サンプル) の空洞に 10 μ L を転送します。脱イオン H2O 標準曲線を取得する次のように 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) 原液を希釈: 50 μ L H2O/50 μ L BSA;60 μ L H2O/40 μ L BSA;70 μ L H2O/30 μ L BSA;80 μ L H2O/20 μ L BSA;90 μ L H2O/10 μ L BSA;100 μ L H2o.</li>
		<li>BCA 試薬 200 μ L を追加することによって、反応を開始 (試薬 A と試薬 B は 50: 1 の比率で混合) し軌道シェーカー (300 の rpm) に若干の動揺の下で 37 ° C で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。560 で吸光度を測定プレート リーダーで nm。 注: サンプルは通常 1 μ L あたり 1.5 μ g タンパク質間含まれています。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人工 - メチルウンベリフェリルグリコシド基板 (4 マグカップ) 酵素活性の測定
	<ol>
		<li>(Α-ガラクトシダーゼ A) の 0.05 または (酸性 α-グルコシダーゼ) の 0.5 μ g/μ L タンパク質ソリューションを取得する新鮮な 1.5 mL 反応管にピペットで移しなさい各サンプルの計算量を希釈します。渦 5 s をもう一度と、96 にこの希釈ピペット 10 μ L のサンプルはウェル プレート (重複の各サンプル)。</li>
		<li>それぞれの基質溶液 20 μ L を追加することで反応を開始します。 Α-ガラクトシダーゼ a: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-ガラクトピラノシド (4 MU gal) 0.06 M リン酸クエン酸バッファー pH 4.7 に。 酸性 α-グルコシダーゼの: 2 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド α-d-グルコピラノシド (4-MU-glu) 0.025 M 酢酸ナトリウム, pH 4.0 で。</li>
		<li>1 h 軌道シェーカー (300 の rpm) に若干の動揺の下で 37 ° C で暗闇の中での酵素反応を孵化させなさい。1.0 M、pH 10.5 調整グリシン-水酸化ナトリウム緩衝の 200 μ L 添加による反応を停止させます。</li>
		<li>4-メチルウンベリフェロン (4 MU) 0.01 mg/mL の在庫からの標準曲線を次のとおり準備します。 100 μ L H2O/いいえ 4 MU;80 μ L H2O/20 μ L 4 MU;60 μ L H2O/40 μ L 4 MU;40 μ L H2O/60 μ L 4 MU;20 μ L H2O/80 μ L 4 MU;H2O/100 μ L 4 MU、96 ウェルに各希釈ピペット 10 μ L (重複) のプレート、ボリュームと pH を調整するために各ウェルに 1.0 M 水酸化ナトリウム、グリシン緩衝の 200 μ L を追加。</li>
		<li>蛍光リーダーの酵素活性測定は適切なフィルター セットを搭載した、蛍光リーダー デバイスの適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 注: 両方 4 マグカップ基板 4 mu α-ガラクトシダーゼ A または酸性 α-グルコシダーゼに露光中に削減されます。リリース 4 MU は、測定できる 360 と 465 nm 励起と放射の波長, マイクロ プレート蛍光リーダーを使用して螢光色素です。</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
<li>Meiji Pharmaceutical University. , <a target="_blank" href="http://fabry-database.org">http://fabry-database.org</a> (2017).</li>
<li>Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , <a target="_blank" href="http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en">http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-galactosidase+A+enzymes+identified+in+Fabry+disease+patients+with+residual+enzyme+activity%3A+biochemical+characterization+and+restoration+of+normal+intracellular+processing+by+1-deoxygalactonojirimycin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin.</a> Biochem J. 406, 285-295 (2007).</li>
<li>Tajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+studies+on+Pompe+disease+and+a+%26%2334%3Bpseudodeficiency+of+acid+alpha-glucosidase%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical studies on Pompe disease and a &#34;pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34.</a> J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Clinical+Consequences+of+Novel+%CE%B1-Galactosidase+A+Mutations+in+Fabry+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease.</a> Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+lysosomal+storage+diseases+with+pharmacological+chaperones%3A+from+concept+to+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics.</a> EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).</li>
<li>Yasuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry+disease%3A+characterization+of+alpha-galactosidase+A+double+mutations+and+the+D313Y+plasma+enzyme+pseudodeficiency+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele.</a> Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).</li>
<li>Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+of+the+GLA+gene+in+Japanese+patients+with+Fabry+disease+and+their+functional+characterization+by+active+site+specific+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone.</a> Hum Mutat. 29, 331(2008).</li>
<li>Andreotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+Fabry+disease+with+pharmacological+chaperones%3A+from+in+silico+predictions+to+in+vitro+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests.</a> Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).</li>
<li>Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+chaperone+AT2220+increases+the+specific+activity+and+lysosomal+delivery+of+mutant+acid+alpha-glucosidase%2C+and+promotes+glycogen+reduction+in+a+transgenic+mouse+model+of+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease.</a> PLoS One. 9, e102092(2014).</li>
<li>Siekierska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Galactosidase+aggregation+is+a+determinant+of+pharmacological+chaperone+efficacy+on+Fabry+disease+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants.</a> J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+enhancement+of+mutated+alpha-glucosidase+activity+in+fibroblasts+from+patients+with+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease.</a> Mol Ther. 15, 508-514 (2007).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacogenetic+approach+to+identify+mutant+forms+of+%CE%B1-galactosidase+A+that+respond+to+a+pharmacological+chaperone+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease.</a> Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+alpha-galactosidase+a+mutations+as+a+basis+for+a+new+classification+system+in+fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease.</a> PLoS Genet. 9, e1003632(2013).</li>
<li>Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+assay+to+test+pharmacological+chaperones+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).</li>
<li>, <a target="_blank" href="https://www.google.ch/patents/US9095584">https://www.google.ch/patents/US9095584</a> (2017).</li>
<li>Lukas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+enhancers+for+the+treatment+of+Fabry+and+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease.</a> Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp ">http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp </a> (2017).</li>
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<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

記載プロトコルは、代謝の遺伝性ライソゾーム病の酵素損傷評価のための強力な結果を提供します。この原稿は、議定書の改正発行以前15です。最も重要な変更を伴う逼迫 (すなわち、ベクター構築準備の過程で)、(すなわち、HEK293H 細胞のメンテナンス、トランスフェクション条件)、細胞培養のプロトコル、高の標準化結果の再現性に著しく貢献した実験繰り返し (少なくとも 5) の数です。完全に、両方のターゲット遺伝子は突然変異誘発のため簡単にアクセスされているし、突然変異の多様性は並列で組み立てることができます。HEK293H 細胞内の内因性酵素活性がごくわずか 1/50 (α-ガラクトシダーゼ A) と 1/20 (酸性 α-グルコシダーゼ) 過剰発現の野生型遺伝子のことを考慮した比較的高いシグナル/ノイズ比を実現しました。したがって、野生型と変異体酵素の優れた分解能があります。両酵素の活性測定法の総蛋白質量が異なるが適用されたことに注意してください (0.5 〜 5 μ g、それぞれ) 酸性 α-グルコシダーゼ活性が桁違いに α-ガラクトシダーゼ A のそれより...

1 ダース ライソゾーム疾患 (Lsd) に関連する主な遺伝子の突然変異の結果として各種グリコシダーゼ機能不全があります。ファブリ (OMIM #301500)、ポンペ (OMIM #232300) 病、1,2,3が報告されている以上 500 と 200 のミスセンス変異で、それぞれ総突然変異数の約 60% に対応します。多数の新しい遺伝子の変形はまだ識別されている、多くの未知の意義。広範な生化学的研究で明らかにGLA遺伝子の完全な損失関数に-に特定の遺伝子がつながらない (OMIM * 300644) ファブリー病が熱力学的に支持された折りたたみ状態4 に到達する失敗に対応する酵素が発生.これは、結果、ER 保存、関数的な酵素の低下を引き起こす。同様の結論は、ポンペ病5を含む他の Lsd で描かれています。さらに、分子酵素変異株については、診断の6LSD の進行が突然変異の性質に基づいて個々 のプロセスであることを示唆している時に突然変異の臨床的な解釈を促進できます。したがって、従来通常 2、3 の異なる臨床型分類は臨床カウンセリングと治療方針の決定を合理化するために再評価されるべき。
酵素補充療法 (ERT) は両方の病気です。ERT はただし、脳や骨格筋などの影響を受ける組織/臓器の効力を制限されています。また、専門家レビュー チームは、その治療効果を損ないます免疫原性の応答を引き出すことができます。薬理学的シャペロン (Pc) は、いわゆる応答性遺伝子変異を有する患者のための魅力的な治療法代わりです。Pc は正しいタンパク質フォールディングと順番防ぐ小胞体 (ER) の保持と小胞体関連分解酵素の安定化のための分子足場として機能します。また、Pc は経口的に投与することができます、可能性のある血液脳関門を通過することができます。したがって、PCT は、特定の遺伝子を持つ患者を治療するためのより現実的なオプションかもしれません。Lsd で PC アプリケーションの広範なレビュー、Parenti7によって優秀なレビューを参照してください。
何百もの突然変異体の対立遺伝子を引き起こす病気の発見は、前臨床薬物検査に挑戦し、従順な患者個別化医療のアプローチのための単純な高速で、高度に標準化された評価が必要になります。LSD 遺伝子突然変異の有害な影響を評価するために、PCT の従順な患者を予測する候補者突然変異をテストするのには、高速かつ信頼性の高い酵素活性測定できる HEK293H 細胞で過剰発現の高い標準化されたシステムだった開発しました。同様の過剰発現システムは、ファブリとポンペ病 COS 78,9,10、11、HeLa 細胞12HEK293 のいずれかを使用して以前記載されている13 ,14,15,16糖加水分解遺伝子の細胞。
非常に同じような方法は「疾患の薬理学的シャペロン治療へ反応を予測する方法」として特許を取得されても17セルの関連性を示す文化システム臨床実践に統合されることができます。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL 部位特異的変異導入キット&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, USA</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Primer GLA[R301Q]-frw: 5&acute;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&acute;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&acute;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&acute;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&acute;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&acute;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-CCA ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&acute;-TTG GGG GGA CCA CCC AGG CGG CCA C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&acute;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&acute;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany</td><td>n.a.Tryptone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>103,753</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Potasium chloride</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,049,360,500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glucose monohydrate</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,083,422,500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,064,980,500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Citric</td><td>acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1,065,860,500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1,062,640,050</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>シグマ・アルドリッチ、ミュンヘン、ドイツ</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td>カール<td>・ロート、カールスルーエ、ドイツ</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB 中</td>型 <td>カール・ロート、カールスルーエ、ドイツ</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>ZymoResearch, Freiburg, Germany</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H cell line</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&急性;s モディファイド イーグル ミディアム&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, USA</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Germany</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート (24 well)</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>831,836</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 96 well plate</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Germany</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal reaction tubes, 1,5mL&nbsp;</td><td>Sarstedt、N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich、ミュンヘン、ドイツ</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-デオキシガラクトノジリマイシン塩酸塩&nbsp;</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-デオキシノジリマイシン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Germany</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germany</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Germany</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone</td><td>SigmaAldrich, Munich, Germany</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &α;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Germany</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &α;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Germany</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator type T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany</td><td>n.a.Luminous</td><td></td></tr> <tr><td>Plate Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Genetic Analyzer&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Germany</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>bacterial shaker</td><td>GFL, Burgwedel, Germany&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 centrifuge</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Germany</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro 分光光度計</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom</td><td>n.a.water-jacket</td><td></td></tr> <tr><td>incubator&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Germany</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 touch mixer</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, USA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 冷蔵マイクロチューブ遠心分離機</td><td>Hermle, Tuttlingen, Germany&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr><tr><td>超純水装置</td><td>シーメンス、ベルリン、ドイツ</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>サーモシェーカー PST-60HL-4 オービタルシェーカー</td><td>バイオサン、リガ、ラトビア</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml;nnedorf, Switzerland</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Microprocessor pH Meter</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><tr><td> Cell Counter + Analyser System Model TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan データ分析ソフトウェア v6.6</td><td>Tecan, M&auml;nnedorf, Switzerland</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA;USA</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abbreviations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = forward; rev = reverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = 該当なし</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体外ファブリとポンペ病の薬理学的シャペロン応答性をテストする酵素測定

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

複雑な臨床試験デザイン、コストが高い、低い患者数でリソソーム貯蔵障害 (Lsd) のようなまれなイネの病気を治療するために個人化された薬の使用に挑戦します。何百もの突然変異体の対立遺伝子は、Lsd のほとんどに関与しています。病気は重症度に応じて異なる臨床型を 2、3 に普通分類されます。さらに、遺伝子型の解析は臨床転帰を予測し、患者のケアに通知を助けることができます。そこで、クローン ファブリとポンペ病の突然変異を過剰発現する HEK293H 細胞に基づく単純な細胞培養の試金。似たようなアッセイは、ファブリー病の従順な変異の薬理学的シャペロン療法 (PCT) を識別するために臨床試験として最近導入されています。本稿では、PCT の対象患者を識別するファブリとポンペ病の allelic 変形の迅速な形質の評価を可能にする新規 pharmacochaperones の開発に役立つ可能性があります修正された細胞培養の試金について説明します。

突然変異誘発の手順 GLA遺伝子突然変異誘発性を評価するために突然変異は次のカテゴリの 1 つに分類されました。突然変異を生成するこの方法では、 GLAの突然変異の約 66.5% が最初の試行で得られたことを明らかにしました。さらに 25% をわずかに変更された第 2 PCR 後取得でした。
カテゴリー 1: 突然変異誘発 PCR は最初の試行で効果的です。
カテゴリー 2: 最初の突然変異誘発 PCR (プレートなしの挿入変異に植民地) に失敗しました。同じプライマーを用いた繰り返し設定、アニール温度の上昇によって有効 68 ° C であった。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

再現性の高い、高速、かつ効率的に薬理学的シャペロンと呼ばれる「オーファン」薬の新規クラスのテスト前臨床をする需要があります。新規の薬理学的シャペロン薬と同様に、対象となる患者の画面に、高度に標準化、シンプルで汎用性の高い細胞培養技術を用いた試験を行った。

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

この修正された細胞培養プロトコルの全体的な目標は、ファブリー病とポンペ病の対立遺伝子分散の表現型を迅速に評価することです。この方法は、予後や治療上の決定など、リソソーム蓄積症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再現性が高く、ドラッグシャペロンなどの新薬の開発に役立てることができることです。部位特異的突然変異導入を行うには、まず参照配列NM 00169.2およびNM 00152.4をGLA遺伝子およびGAA遺伝子の突然変異誘発のテンプレートとして使用します。無料のプライマーデザインツールを使用して、プライマーデザインをサポートします。次に、商業プロバイダーによって合成された高純度の無塩プライマーのセットを用意し、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、それぞれの配列修飾の1つをその長さの中心に運び、突然変異を個別に導入します。反応混合物を50マイクロリットルの容量で調製し、メーカーが提供する標準条件およびテキストプロトコルに記載されているようにPCRプログラムを実行します。PCRに続いて、1マイクロリットルのDpn1制限酵素を添加し、反応バイアルを摂氏37度で1時間インキュベートし続けます。血漿DNAをコンピテントE.coli細胞に形質転換し、テキストプロトコルに従って所望の形質転換のプラスミドを調製した後、適切な分子生物学ツールを使用して配列を分析します。目的の変異が検出され、α-ガラクトシダーゼAのNM 000169.2または酸性α-ガラクトシダーゼのNM 000152.4と比較して、それ以上の配列異常が見られない場合は、トランスフェクショングレードのプラスミド精製用のクローンを選択します。分光光度計で吸光度を測定することにより、DNAの純度を決定します。テキストプロトコルに従ってT75培養フラスコでHEK293H細胞を培養した後、トランスフェクションの24時間前に、カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSを使用して細胞を1回洗浄します。0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を収穫し、24ウェル培養プレートの空洞で10%FBSを添加した500マイクロリットルのDMEMを使用して、5つの細胞に10の1.5倍を播種します。細胞トランスフェクションは、メーカーのマニュアルに従って行ってください。100マイクロリットルの無血清DMEMに溶解した1マイクログラムのプラスミドDNAと2.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬の混合物を使用します。溶液を室温で20分間インキュベートし、その後、液滴状に細胞に加えます。摂氏37度、CO2濃度5%で4時間放置した後、トランスフェクション試薬を含む培地を取り出し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む500マイクロリットルの新鮮なDMEMを加えます。このステップのオプションとして、目的の場所でDGJまたはDNJを培地に追加します。収穫の日に、インキュベーターから細胞を取り出します。次に、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを使用して、細胞を2回注意深く洗浄します。DGJとDNJは両方の酵素の阻害剤であり、したがって、残ったものはテストを無効にするため、この手順は重要です。洗浄後、200マイクロリットルの脱イオン水を細胞の上に直接加えます。次に、プレートから細胞をすすぎ、1.5ミリリットルの反応チューブに移します。サンプルを適切なフォームラックに置き、5秒間ボルテックスして溶解をより効率的にします。次に、解凍が完了するまで、サンプルを液体窒素と室温のウォーターバスの間で10秒間交互に行います。均質化手順を5回繰り返した後、サンプルを10、000gで5分間回転させます。次に、上清を新しい反応チューブに移します。BCAアッセイを実施するには、40マイクロリットルの脱イオンH20を含む各サンプル用の新しいチューブを準備し、10マイクロリットルのサンプルを追加します。各溶液を短時間ボルテックスして混合し、各サンプルの10マイクロリットルを3倍にして96ウェルプレートの空洞に移します。標準曲線を調製するには、2ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのBSAストック溶液を希釈し、テキストプロトコルに従って脱イオンH2Oを脱イオンします。試薬Aと試薬Bを合体させた後、BCA試薬溶液200μLを加えて反応を開始し、試料を37°C、300rpmの暗所でオービタルシェーカーで1時間インキュベートします。次に、プレートリーダーで560ナノメートルの吸光度を測定します。サンプルには通常、1マイクロリットルあたり1〜1.5マイクログラムのタンパク質が含まれています。各サンプルの計算量を希釈し、ピペットで新しい1.5ミリリットルの反応チューブにピペットで移して、溶液1マイクロリットルあたり0.05マイクログラムのα-ガラクトシダーゼAまたは0.5マイクログラムの酸性α-グルコシダーゼを得ます。サンプルを再度5秒間ボルテックスし、この希釈液の10マイクロリットルを96ウェルプレートにピペットで移します。反応を開始するには、それぞれの基質溶液を20マイクロリットル加えます。α-ガラクトシダーゼAの場合、0.06モルリン酸クエン酸緩衝液(pH 4.7)に2ミリモルの4-メチルウンベリフェリルα-Dガラクトピラノシドまたは4-MU-galを添加します。酸性α-グルコシダーゼの場合は、0.025モル酢酸ナトリウム、pH 4.0に2ミリモルの4-メチルウンベリフェリルα-Dグルコピラノシド、または4-MU-gluを追加します。.オービタルシェーカーで、37°C、300rpmの暗闇で酵素反応を1時間インキュベートします。次に、200マイクロリットルの1.0モルpH 10.5調整グリシンナトリウム水酸化物緩衝液を追加して反応を終了します。テキストプロトコルに従って、0.01ミリグラム/ミリリットルのストックから4-MUの標準曲線を調製し、10マイクロリットルの溶液を96ウェルプレートに二重にピペットで移します。容量とpHを調整するために、200マイクロリットルの1.0モルグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を各ウェルに加えます。最後に、適切なフィルターセットを装備した蛍光リーダーで酵素活性を測定します。そして、蛍光リーダーデバイスに適したソフトウェアを使用してデータを分析します。GLA遺伝子の突然変異導入の効率を評価するために、変異を3つのカテゴリーに分類し、最初の試みで約66.5%得られたことを明らかにしました。わずかに修正された2回目のPCR後にさらに25%が得られる可能性があります。カテゴリー3では、プライマーの再設計など、目的のクローンを得るためにより多くの努力が必要でした。この表は、α-ガラクトシダーゼA変異3種、酸性α-グルコシダーゼ変異3種、またはDGJおよびDNJによる治療の酵素活性測定結果を示しています。データは基質代謝回転の絶対値として表示され、相対値は野生型酵素に正規化されています。絶対酵素活性データは、空のpcDNA 3.1ベクターをトランスフェクトした細胞を使用して、HEK293H細胞の内因性酵素活性を補正しました。酵素活性値は、対応する実験から野生型酵素に正規化され、異なる変異体間の相対値の偏差が説明されます。一度習得すれば、この実験の細胞培養後の画分(ハンズオン時間のほとんどを占める)は、4時間以内に行うことができます。その開発後、この技術は、リソソーム蓄積症の分野の研究者がファブリー病とポンペ病の遺伝子型と表現型の相関関係を調査する道を開きました。このプロトコルは、リソソーム蓄積症における新薬の開発に役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。...

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学ぶファブリー病とポンペ病の薬理学的シャペロン応答性を評価する細胞培養ベースの酵素測定法。高い再現性を持つこの手法は、リソソーム貯蔵症の治療薬開発と遺伝子型・表現型相関の研究に有用です。

体外ファブリとポンペ病の薬理学的シャペロン応答性をテストする酵素測定

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