体外ファブリとポンペ病の薬理学的シャペロン応答性をテストする酵素測定

再現性の高い、高速、かつ効率的に薬理学的シャペロンと呼ばれる「オーファン」薬の新規クラスのテスト前臨床をする需要があります。新規の薬理学的シャペロン薬と同様に、対象となる患者の画面に、高度に標準化、シンプルで汎用性の高い細胞培養技術を用いた試験を行った。

この修正された細胞培養プロトコルの全体的な目標は、ファブリー病とポンペ病の対立遺伝子分散の表現型を迅速に評価することです。この方法は、予後や治療上の決定など、リソソーム蓄積症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、再現性が高く、ドラッグシャペロンなどの新薬の開発に役立てることができることです。

部位特異的突然変異導入を行うには、まず参照配列NM 00169.2およびNM 00152.4をGLA遺伝子およびGAA遺伝子の突然変異誘発のテンプレートとして使用します。無料のプライマーデザインツールを使用して、プライマーデザインをサポートします。次に、商業プロバイダーによって合成された高純度の無塩プライマーのセットを用意し、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、それぞれの配列修飾の1つをその長さの中心に運び、突然変異を個別に導入します。

反応混合物を50マイクロリットルの容量で調製し、メーカーが提供する標準条件およびテキストプロトコルに記載されているようにPCRプログラムを実行します。PCRに続いて、1マイクロリットルのDpn1制限酵素を添加し、反応バイアルを摂氏37度で1時間インキュベートし続けます。血漿DNAをコンピテントE.coli細胞に形質転換し、テキストプロトコルに従って所望の形質転換のプラスミドを調製した後、適切な分子生物学ツールを使用して配列を分析します。

目的の変異が検出され、α-ガラクトシダーゼAのNM 000169.2または酸性α-ガラクトシダーゼのNM 000152.4と比較して、それ以上の配列異常が見られない場合は、トランスフェクショングレードのプラスミド精製用のクローンを選択します。分光光度計で吸光度を測定することにより、DNAの純度を決定します。テキストプロトコルに従ってT75培養フラスコでHEK293H細胞を培養した後、トランスフェクションの24時間前に、カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSを使用して細胞を1回洗浄します。

0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を収穫し、24ウェル培養プレートの空洞で10%FBSを添加した500マイクロリットルのDMEMを使用して、5つの細胞に10の1.5倍を播種します。細胞トランスフェクションは、メーカーのマニュアルに従って行ってください。100マイクロリットルの無血清DMEMに溶解した1マイクログラムのプラスミドDNAと2.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬の混合物を使用します。

溶液を室温で20分間インキュベートし、その後、液滴状に細胞に加えます。摂氏37度、CO2濃度5%で4時間放置した後、トランスフェクション試薬を含む培地を取り出し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む500マイクロリットルの新鮮なDMEMを加えます。このステップのオプションとして、目的の場所でDGJまたはDNJを培地に追加します。

収穫の日に、インキュベーターから細胞を取り出します。次に、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを使用して、細胞を2回注意深く洗浄します。DGJとDNJは両方の酵素の阻害剤であり、したがって、残ったものはテストを無効にするため、この手順は重要です。

洗浄後、200マイクロリットルの脱イオン水を細胞の上に直接加えます。次に、プレートから細胞をすすぎ、1.5ミリリットルの反応チューブに移します。サンプルを適切なフォームラックに置き、5秒間ボルテックスして溶解をより効率的にします。

次に、解凍が完了するまで、サンプルを液体窒素と室温のウォーターバスの間で10秒間交互に行います。均質化手順を5回繰り返した後、サンプルを10、000gで5分間回転させます。次に、上清を新しい反応チューブに移します。

BCAアッセイを実施するには、40マイクロリットルの脱イオンH20を含む各サンプル用の新しいチューブを準備し、10マイクロリットルのサンプルを追加します。各溶液を短時間ボルテックスして混合し、各サンプルの10マイクロリットルを3倍にして96ウェルプレートの空洞に移します。標準曲線を調製するには、2ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのBSAストック溶液を希釈し、テキストプロトコルに従って脱イオンH2Oを脱イオンします。

試薬Aと試薬Bを合体させた後、BCA試薬溶液200μLを加えて反応を開始し、試料を37°C、300rpmの暗所でオービタルシェーカーで1時間インキュベートします。次に、プレートリーダーで560ナノメートルの吸光度を測定します。サンプルには通常、1マイクロリットルあたり1〜1.5マイクログラムのタンパク質が含まれています。

各サンプルの計算量を希釈し、ピペットで新しい1.5ミリリットルの反応チューブにピペットで移して、溶液1マイクロリットルあたり0.05マイクログラムのα-ガラクトシダーゼAまたは0.5マイクログラムの酸性α-グルコシダーゼを得ます。サンプルを再度5秒間ボルテックスし、この希釈液の10マイクロリットルを96ウェルプレートにピペットで移します。反応を開始するには、それぞれの基質溶液を20マイクロリットル加えます。

α-ガラクトシダーゼAの場合、0.06モルリン酸クエン酸緩衝液(pH 4.7)に2ミリモルの4-メチルウンベリフェリルα-Dガラクトピラノシドまたは4-MU-galを添加します。酸性α-グルコシダーゼの場合は、0.025モル酢酸ナトリウム、pH 4.0に2ミリモルの4-メチルウンベリフェリルα-Dグルコピラノシド、または4-MU-gluを追加します。.オービタルシェーカーで、37°C、300rpmの暗闇で酵素反応を1時間インキュベートします。

次に、200マイクロリットルの1.0モルpH 10.5調整グリシンナトリウム水酸化物緩衝液を追加して反応を終了します。テキストプロトコルに従って、0.01ミリグラム/ミリリットルのストックから4-MUの標準曲線を調製し、10マイクロリットルの溶液を96ウェルプレートに二重にピペットで移します。容量とpHを調整するために、200マイクロリットルの1.0モルグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を各ウェルに加えます。

最後に、適切なフィルターセットを装備した蛍光リーダーで酵素活性を測定します。そして、蛍光リーダーデバイスに適したソフトウェアを使用してデータを分析します。GLA遺伝子の突然変異導入の効率を評価するために、変異を3つのカテゴリーに分類し、最初の試みで約66.5%得られたことを明らかにしました。

わずかに修正された2回目のPCR後にさらに25%が得られる可能性があります。カテゴリー3では、プライマーの再設計など、目的のクローンを得るためにより多くの努力が必要でした。この表は、α-ガラクトシダーゼA変異3種、酸性α-グルコシダーゼ変異3種、またはDGJおよびDNJによる治療の酵素活性測定結果を示しています。

データは基質代謝回転の絶対値として表示され、相対値は野生型酵素に正規化されています。絶対酵素活性データは、空のpcDNA 3.1ベクターをトランスフェクトした細胞を使用して、HEK293H細胞の内因性酵素活性を補正しました。酵素活性値は、対応する実験から野生型酵素に正規化され、異なる変異体間の相対値の偏差が説明されます。

一度習得すれば、この実験の細胞培養後の画分(ハンズオン時間のほとんどを占める)は、4時間以内に行うことができます。その開発後、この技術は、リソソーム蓄積症の分野の研究者がファブリー病とポンペ病の遺伝子型と表現型の相関関係を調査する道を開きました。このプロトコルは、リソソーム蓄積症における新薬の開発に役立ちます。