同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

この実験の全体的な目標は、取り込まれたリボヌクレオチドの位置を単一ヌクレオチドの分解能レベルでマッピングし、ヒトミトコンドリアDNAに存在するリボヌクレオチドの数を定量化することです。この方法は、DNAの完全性、DNA複製メカニズム、DNA修復メカニズム、およびこれらのメカニズムのいずれかの欠陥がどのように病気を引き起こすかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、ミトコンドリアDNAに取り込まれたリボヌクレオチドの位置と数の両方を1回の実験で決定できることです。

この方法は、ヒトミトコンドリアDNAのリボヌクレオチド含量に関する洞察を提供しますが、他のモデル生物の核DNAおよび配列ゲノム中のリボヌクレオチド含量の研究にも適用できます。この実験では、以前にHeLa細胞から単離され、テキストプロトコルのセクション2および3に記載されているゲノムDNAを使用します。DNAを消化するには、マイクロチューブで以下を慎重に混合します。

1マイクログラムのDNA、5マイクロリットルの10Xバッファー3.1、1マイクロリットルのHincII、およびヌクレアーゼフリー水で最終容量は50マイクロリットルです。摂氏37度で30分間インキュベートします。消化が完了したら、各サンプルに1.8容量の常磁性ビーズを加え、ピペッティングで慎重に混合し、室温で10分間インキュベートします。

チューブを磁気ラックに5分間置いてビーズをペレット化し、上清を取り出して廃棄します。ペレットを150マイクロリットルの70%エタノールで約30秒間洗浄し、上清を取り出して廃棄します。200マイクロリットルの70%エタノールでさらに30秒間洗浄を繰り返します。

サンプルを室温で約15〜20分間乾燥させます。次に、マグネティックラックからチューブを取り外します。各ペレットを45マイクロリットルの溶出緩衝液で溶出し、ピペッティングで慎重に混合し、5分間インキュベートします。

磁気ラック上のビーズをペレット化し、各DNAサンプルの45マイクロリットルを新しいチューブに移します。単離または精製されたDNAの45マイクロリットルごとに、5マイクロリットルの3モル水酸化カリウムまたは5マイクロリットルの3モル塩化カリウムを追加し、合計50マイクロリットルを作成します。8つの反応を次の表にまとめます。

摂氏55度のハイブリダイゼーションオーブンで2時間インキュベートし、次にサンプルを氷上で5分間インキュベートします。pH 5.2で10マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと125マイクロリットルの冷、100%エタノールを加えてDNAを沈殿させ、氷上で5分間インキュベートします。DNAを4°Cで21, 000倍のGで5分間遠心分離してペレット

上清を捨て、各DNAペレットを250マイクロリットルの冷水、70%エタノールで洗浄し、再度遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを開いたチューブ内で約5〜10分間乾燥させ、目に見える液体が蒸発するまで待ちます。最後に、20マイクロリットルの溶出バッファーを加え、DNAペレットを室温で30分間溶解させます。

この手順は、各サンプルの反応ミックスをマスターミックスとして調製することから始めます。各サンプルについて、2.5マイクロリットルの10x T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー、2.5マイクロリットルのATP、および3つのプライムホスファターゼマイナスT4ポリヌクレオチドキナーゼ1マイクロリットルを追加します。各DNAサンプルの19マイクロリットルを新しい200マイクロリットルのチューブに移し、サーモサイクラーで摂氏85度で3分間変性させます。

次に、DNAサンプルを氷上で冷却し、調製した反応混合物を6マイクロリットル各サンプルに加えます。反応をインキュベートし、摂氏37度で30分間、続いて摂氏65度で20分間混合して反応を停止します。前述したように常磁性ビーズを用いてDNAを精製しますが、14マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。

反応ミックスをあらかじめマスターミックスとして調製し、サンプルごとに以下を含んでください。5マイクロリットルの10x T4 RNAリガーゼ反応バッファー、5マイクロリットルの塩化ヘキサミンコバルト(III)、0.5マイクロリットルのARC140オリゴヌクレオチド、0.5マイクロリットルのATP、および25マイクロリットルの50%PEG 8000。ピペッティングでよく混ぜます。

精製した各DNAの13マイクロリットルを新しい200マイクロリットルのチューブに移し、サーモサイクラーで摂氏85度で3分間変性させます。氷上でDNAを冷却し、各サンプルに36マイクロリットルの反応混合物を加え、ピペッティングで混合し、短時間スピンダウンします。各反応に1マイクロリットルのT4 RNAリガーゼを加え、ピペッティングで混合し、短時間スピンダウンします。

サンプルを室温で暗所で一晩インキュベートします。一本鎖DNAライゲーションが完了したら、前に示したようにDNAを精製しますが、0.8容量の常磁性ビーズを使用し、ビーズを10分間ペレット化します。20マイクロリットルの溶出バッファーで溶出し、各DNAサンプルの20マイクロリットルを新しい200マイクロリットルのチューブに移します。

0.8容量の常磁性ビーズで精製を繰り返し、14マイクロリットルの溶出バッファーで溶出します。各サンプルについて、2マイクロリットルの10x T7 DNAポリメラーゼ反応バッファー、2マイクロリットルのARC76/77、2マイクロリットルのdNTP、および0.8マイクロリットルのBSAからなるマスターミックスとして反応ミックスを調製します。精製したDNA12.8マイクロリットルを新しい200マイクロリットルのチューブに移し、サーモサイクラーで摂氏85度で3分間変性させます。

氷上でDNAを冷却し、各サンプルに6.8マイクロリットルの反応混合物を加え、ピペッティングで混合し、短時間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートします。各反応に0.4マイクロリットルのT7 DNAポリメラーゼを添加し、室温で5分間インキュベートします。常磁性ビーズを用いてDNAを精製した後、11 μLの溶出バッファーで溶出します。

PCR増幅を開始するには、7.5マイクロリットルのARC49、7.5マイクロリットルのユニークインデックスプライマー、および25マイクロリットルの2Xホットスタートレディミックスで構成される新しい200マイクロリットルのチューブで、各サンプルに対して反応ミックスを別々に調製します。各反応に10マイクロリットルのDNAサンプルを加えます。以下の条件でライブラリを増幅します。

氏95度で45秒間変性し、その後、摂氏98度で15秒、摂氏65度で30秒、摂氏72度で30秒間の18サイクル、そして摂氏72度で2分間の最終的な離角で終了します。増幅後、サンプルを摂氏4度に保持します。テキストプロトコルに記載されているようにライブラリを精製し、20マイクロリットルのTEバッファーで溶出します。

デジタル電気泳動システムを使用して、各ライブラリの品質と平均フラグメントサイズを決定します。水酸化カリウムまたは塩化カリウム処理後の適切なライブラリープロファイルの代表的な結果を示します。各ライブラリの濃度を計算した後、テキストプロトコルのセクション9および10で説明されているように、シーケンシングのために異なるインデックスプライマーで増幅された最大24のライブラリを同モル量で引きます。

TEバッファーを最終容量25マイクロリットル、濃度10ナノモルに添加します。シーケンシング後、テキストプロトコルのセクション11で指定されているバイオインフォマティクスデータ解析を実行します。これらのグラフは、塩化カリウム処理後の軽鎖および重鎖ヒトミトコンドリアDNAのすべてのHincII部位で要約されたリードを示しています。

全体の約70%が切断部位に局在する5つのプライムエンドを検出し、HincII消化の高効率を実証しました。埋入リボヌクレオチドでDNAを加水分解するために水酸化カリウムでライブラリを処理すると、HincIIでの読み取り数が約40%に減少しますミトコンドリアおよび核DNAの相対的なリード数は、カバレッジの違いを明らかにし、鎖バイアスを除去するための適切な標準化の重要性を示しています。リードカウントをHincIIに正規化すると、重鎖または軽鎖のミトコンドリアゲノムあたりのリボヌクレオチドの数を定量的に測定できます。

各リボヌクレオチドの水酸化カリウム処理後のリードは、各鎖の配列組成に正規化され、1とは異なる比率を示し、リードの非ランダム分布を示し、明確なリボヌクレオチドパターンと高いライブラリー品質を示唆しています。埋め込まれたリボヌクレオチドの部位での読み取りをHincII部位のリード、およびゲノムヌクレオチド含有量に正規化すると、1, 000の相補塩基あたりに組み込まれる各リボヌクレオチドの数の定量的測定が生成されます。このプロトコルは、一度マスターすれば、適切に実行すれば2日で完了します。

この手順を試みる際には、DNAを高度に維持し、ライブラリ調製中に二本鎖切断が発生しないように注意することが重要です。この手順に続いて、リボヌクレオチドの定量データを確認するために、他の方法を実行することができます。このビデオを見れば、次世代シーケンシングを使用したリボヌクレオチドとDNAのマッピングと定量のためのライブラリの調製方法について十分に理解できるはずです。

水酸化カリウムのような化学物質を扱うことは危険な場合があり、この手順を実行するときは常に目の保護具や手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。