造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション
2017年11月3日
このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。
この実験の全体的な目標は、大動脈-生殖腺-中腎外植片培養を使用して、造血幹細胞発生の重要な調節因子を調査することです。この方法は、哺乳類のHSC発生の調節に関与する因子をどのように特定するかについて、HSC生物学および機能分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、これらの調節因子をDNA発現解析とHSCのコロニー形成能および再構成能によって検証できることです。
一般に、この方法に不慣れな個人は、体幹領域の周囲の組織からAGMを正確に分離するには習得する練習が必要なため、苦労するでしょう。手順を開始する前に、ウェルごとに2ミリリットルの新たに調製されたフルオキセチン添加培地を含む6ウェルプレートの個々のウェルにステンレス鋼メッシュを配置します。実験ウェル1つにつき1つのUV滅菌0.65マイクロリットルフィルターを、新鮮な沸騰水を入れたガラス細胞培養皿に入れて3分間洗浄し、各洗浄後にフィルターを室温PBSの容器に2分間浸します。
次に、各ウェルの気液界面の各スチールメッシュに1つのフィルターを配置します。次に、解剖ハサミを使用して、妊娠11日目の胚マウスから子宮を剥ぎ取り、子宮から胚を採取します。解剖ハサミを使用して、卵黄嚢、臍帯、内臓を胚体から取り除きます。
そして、背側の神経組織と周囲の筋肉組織を慎重に取り除きます。鉗子を使用して、前肢と後肢から組織を取り除きます。そして、AGM領域を胚体から分離します。
次に、各AGMを各ウェルの気液界面にある1つのフィルターに配置します。培養物を摂氏37度、CO2 5%のインキュベーターに入れます。2〜3日後、AGMサンプルを200マイクロリットルのコラゲナーゼを含む個々の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、摂氏37度で約20分間、5分ごとに振とうしながら解離します。
消化の終わりに、外植片あたり200マイクロリットルの血清で反応を停止します。各チューブの内容物全体を、ウェルあたり500〜600マイクロリットルのM3434培地を含む24ウェル超低アタッチメントプレートの個々のウェルに移します。各ウェルの細胞を針のない1ミリリットルの注射器で混合します。
プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。各ウェル内のコロニー形成ユニットの数は、7〜10日間の培養後にスコアリングできます。今示したように、AGM培養の2〜3日後のin vivo AGM外植片移植では、8〜10週齢の雄C57黒色マウスに9つの灰色の放射線を致死的に放射します。
4〜5時間後、示されているように、サンプルごとに200マイクロリットルのコラゲナーゼで収穫した外植片を解離します。得られた単一細胞懸濁液の0.5〜1つの胚相当物を、レシピエント動物1匹につき1ミリリットルの注射器にロードします。最初に照射したマウスを拘束具に入れ、75%エタノールに浸した綿棒で尾を拭いて尾静脈の血管拡張を促進します。
1つのシリンジの内容物全体を拡張した尾静脈に静脈内注射します。.針を抜いた後、消毒用綿棒を使用して出血を止めます。その後、動物をケージに戻し、次の動物を注射します。
養子縁組の移植から11日後、脾臓は、目に見える脾臓コロニーの巨視的列挙のためにBouinの溶液に固定することができます。フルオキセチンを添加したAGM培養物は、mRNAおよびタンパク質発現レベルでのHSC発生の極めて重要な遺伝子であるRunx1の発現増加を示しています。フルオキセチンは、バースト形成ユニット赤血球、コロニー形成ユニット顆粒単球、コロニー形成ユニット顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球など、AGMにおけるHSCのコロニー形成能力も大幅に向上させることができます。
さらに、AGM外植片から単離されたフルオキセチン処理HSCのin vivo移植は、放射線を照射した成体レシピエント動物の脾臓におけるコロニー数の増加をもたらす。このビデオを見れば、AGMの単離方法と、AGM内でのHSC開発の重要なレギュレーターを特定するためのAGM外植片培養の実施方法について十分に理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、造血幹細胞（HSC）の発達を研究するために、培養した大動脈-生殖腺-中腎（AGM）領域を用いた発現解析およびコロニー形成能（CFU）アッセイの手法について解説します。これは、HSCの生物学に関与する調節因子やシグナル伝達経路を調査するための有効なシステムです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 造血幹細胞生物学
- 細胞培養技術
- 発生における調節因子
背景
- AGM領域は、哺乳類におけるHSCの発達に極めて重要である。
- HSCの調節機構を理解することは、再生医療の進歩につながる可能性がある。
- コロニー形成アッセイは、HSCの機能を評価するために不可欠である。
- 周囲の組織からAGMを分離するには、熟練した技術と練習が必要である。
研究目的
- HSC分化の重要な調節因子を調査すること。
- HSC調節に関与する因子を特定すること。
- HSCの生物学および機能に関する理解を深めること。
使用した手法
- AGM外植片培養法。
- 調節因子の検証のためのDNA発現解析。
- HSC能を評価するためのコロニー形成アッセイ。
- 長期再構築研究。
主な結果
- HSCの発達に影響を与える主要な調節因子の同定。
- DNA発現解析による因子の検証。
- 培養したHSCにおけるコロニー形成能の実証。
- HSCの生物学に関与するシグナル伝達経路に関する知見。
結論
- AGM培養システムは、HSCの発生研究に有効です。
- 調節因子の解明は、治療戦略に寄与します。
- 本手法は、造血に関する今後の研究のためのプラットフォームを提供します。
よくある質問
産業界における重要性
AGM外植片培養システムは、生殖細胞系列のノックアウトモデルを必要とせずにメカニズムの研究を可能にすることで、造血幹細胞（HSC）研究における主要なボトルネックを解消します。このアプローチは、生理学的に適切な胚ニッチにおいて薬理学的または遺伝学的なレスキュー実験を可能にし、初期創薬におけるターゲット検証およびリスク低減を支援します。これにより、HSC分化の重要な調節因子の特定における予測信頼性が高まり、造血に焦点を当てた治療領域におけるポートフォリオ決定に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：KO背景でのレスキュー実験を通じて、HSC制御における因子の関与を検証し、治療仮説の検討を可能にする。
- 運用的価値：DNA発現の変化やコロニー形成などの機能的アウトプットを検証するための再現性のあるシステムを提供し、コストのかかるin vivoモデルへの依存度を低減する。
- 予測的価値：分子摂動を再構築能などの機能的なHSCアウトプットに結びつけることで、メカニズム面でのリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：CFU-E、CFU-GM、および巨核球コロニーを含む定量的な多細胞リードアウトを生成し、化合物がHSC分化に及ぼす影響を評価します。
- 運用的価値：7〜10日後のコロニー形成能スコアリングによりHSCの機能評価を標準化し、化合物ライブラリ全体でのアッセイのスケールアップを可能にします。
- トランスレーショナル価値：検証済みのHSC集団を後続の移植研究に向けて準備し、創薬から前臨床検証への橋渡しを行います。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：胚性造血ニッチを維持することで疾患との関連性を保持し、哺乳類のHSC分化メカニズムの研究を可能にする。
- 運用的価値：放射線照射したレシピエントにおける再構成能が実証された移植可能なHSCを生成し、発見から前臨床研究までの継続性をサポートする。
- リスク軽減：コストのかかるin vivo研究の前に標的の機能的に検証することを可能にし、go/no-go判断の信頼性を向上させる。
パイプラインおよびワークフローへの統合
AGM外植片培養は、標的同定からリード最適化、そして前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合し、特に造血および再生医療プログラムにおいて有用です。
- 発見生物学：HSCの出現および拡大に影響を与えるシグナル伝達経路や転写調節因子の仮説検証を促進します。
- スクリーニング：用量反応解析やヒット確認をサポートする、蛍光または顕微鏡ベースの定量的なコロニー出力を提供します。
- 分析：mRNA/タンパク質発現（例：Runx1）、コロニー形態、およびin vivo再構築ユニットによる多パラメータ評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：競合的移植モデルにおける長期再構築の証明を通じて、メカニズム的な知見を前臨床の継続性に結びつけます。
- 企業における再利用：幹細胞および血液疾患の治療領域における複数のプロジェクトにわたる、反復的なターゲットバリデーションのための再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 発達段階的に正確なシステムにおいて、分子介入を機能的なHSC表現型に結びつけることで、ターゲットの信頼性を向上させます。
- 運用的価値： 標準化された外植片の分離、培養、および解離プロトコルを通じて再現性を高め、機能アッセイにおけるばらつきを低減します。
- 戦略的価値： HSCターゲットの早期段階でのリスク低減を可能にし、メカニズム的な知見の不足による後期段階での失敗を最小限に抑えることで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： ターゲットランキングのためのHSCの自己複製能および分化能に関する機能的なデータを提供し、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 周囲の組織による混入なくAGM領域を単離するには、胚解剖および微小外科的手法に関する専門知識が必要です。
- CO2インキュベーター、低接着プレート、培地および試薬の滅菌ろ過を含む、無菌的な細胞培養インフラに依存します。
- データの比較可能性を確保するため、外植片の配置、コラゲナーゼ消化時間、およびコロニー判定基準について、チーム間での標準化が必要です。
- 非マウスモデルへの適応は、種特異的な胚のタイミングや組織へのアクセスしやすさによって制限される可能性があり、各システムでの検証が必要となります。
- 実用上の制約として、AGM単離のための胚のウィンドウ（マウスではE10.5–E11.5）が狭いため、探索キャンペーンにおけるスループットやスケジューリングに影響します。
