Name: 造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ造血幹細胞の発達における重要な調節因子をAGM（大動脈生殖巣中腎）外植培養を用いて探索する方法。DNA発現解析とコロニー形成能測定により、哺乳類のHSC生物学と機能を解明します。

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Suwei Gao は、図の準備のヘルプを感謝いたします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (81530004、31425016) および科学省と中国の技術 (2016YFA0100500) からの助成金によって支えられました。J. l. が、実験を行い; 原稿を起草F. l. は、原稿を編集します。著者は両方とも読み、最終原稿を承認します。

動物科目を含むすべてのプロシージャは、中国科学院動物研究所の北京、中国の倫理審査委員会によって承認されている。
 1 材料準備 <ol><li>定置滅菌、0.65 μ m フィルター紫外線光線の紫外線の下で生産 4 h 用クリーン ベンチ内でランプをレイと 2 h マークの後にフィルターを裏返して。 。
	注: UV ライトを使用して、適切な保護を着用します</li>。
	<li>滅菌オートクレーブ殺菌剤 30 分のための 121 ° c でステンレス メッシュします 。
	注: 気液界面でフィルターをサポートするステンレス メッシュのある特定の高さが必要し、スチール メッシュ ( 図 1 A) にワイヤーとそれを実現すます</li>。
	<li>長期的な M5300 に 10 μ M の最終濃度に希釈フルオキセチン文化メディアとミックスに均等にします 。
	注: 6 ウェル プレート 2 mL M5300 長期培養培地は各ウェルに適したです。10 -6 M でヒドロコルチゾンを媒体に選択的に希釈できる</li>。
	<li>6 ウェル プレートや料理に 10 μ M でフルオキセチンを添加した培地を転送し、媒体に滅菌のステンレス メッシュを入れて</li>。
	<li>は、殺菌のためガラス細胞培養皿のたびに 2 回 3 分の沸騰水で 0.65 μ m フィルターを洗ってください。[スケマティック 図 1 A のように、それぞれの洗浄、入れフィルター リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 分とウェット フィルター ステンレスの上に場所をメッシュ気液界面に立ってを後センター] にします 。
	注: 無菌状態を達成するためにオートクレーブ滅菌器で生成水を沸騰と温度低下を避けるために機器をタイムリーにオートクレーブ滅菌器から取り除いてください</li>。
</ol> 2。AGM 外植体文化 <ol><li>は慎重に鉗子で E10.5 または E11 で胚から AGM の領域を分離します。
	<ol><li>解剖はさみで妊娠マウスから子宮を除去し、子宮の胚の区別します</li>。
		<li>卵黄嚢、臍帯、胎児の体から内臓をふき取りなさい</li>。
		<li>背側神経組織や周囲の筋肉組織を慎重に削除します</li>。
		<li>カットは、前部と後部の肢のサイトで鉗子で組織をオフ、胚体から AGM 地域を区切ります。 図 1B C を示す模式図と解剖 AGM の形態</li>。
	</ol></li> <li>2 〜 3 日の 37 ° C で 5% CO 2 液体空気インターフェイス ( 図 1 A) 文化でフィルターに別々 に切り裂かれた議事録を外植体します 。
	注: はないスチール メッシュのワイヤーに切り裂かれた AGM を配置し、フィルターは、気液界面培養中かどうかを確認します。AGM、以外にも卵黄嚢と胎仔肝することができますはまた培養するこのシステム 7 と</li>。
</ol> 3。発現解析 <ol><li>mRNA レベル <ol><li>1 mL の PBS に培養された議事録を収集し 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離</li>
		<li>上清を除去した後フェノールの単相性ソリューションで収集した定時から総 RNA を抽出、メーカーによると &#39; の指示</li>。
		<li>総 RNA (2 μ g) は、逆 M MLV 逆転写酵素を使用して、テンプレートとして cDNA を取得するを転写。定量的リアルタイム PCR の試金は SYBR グリーンで実行され、Gapdh は内部統制として使用されます</li>。
	</ol></li> <li>蛋白質のレベル <ol><li>3.1.1 の手順で上記のように培養 AGM を収集します</li>。
		<li>セル換散バッファーと培養の AGM から蛋白質の準備 (10 mM トリス塩酸、10 mM の NaCl、および 0.5% NP 40) 13 プロテアーゼ阻害剤と前述の蛋白質のレベルを検出する西部のしみのための使用を含む説明</li>。
	</ol></li></ol> 4。文化 (CFU-C) アッセイでのコロニー形成単位 <ol><li>2-3 日培養後 1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離機に AGM 地域を収集し、37 で 200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) との関連付けを解除° C 
	注: コラゲナーゼ単一細胞懸濁液を生成するために必要な時間は約 20 分です。AGM を格納筒を振るごとに 5 分は消化プロセスを加速できます。200 μ L 0.1% コラゲナーゼは各 AGM 用、200 μ L 10% 血清反応を停止するために使用します</li>。
	<li>文化 M3434 超低添付ファイル 24 ウェル プレート中の単一細胞を懸濁液します 。
	注: 汚染を避けるためには、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液選択追加できます媒体に。M3434 媒体は粘性、ため針なし 1.0 cc 注射器が細胞と培地を混合する使用されます</li>。
	<li>後 7 - 10 日間培養 5% CO 2 の 37 ° C でコロニー形成単位の赤芽球 (BFU E)、CFU granulo, 単球 (CFU-GM) と CFU-顆粒球、バーストを含む赤血球、巨核球 (CFU ジェム) マクロファージの種類ごとの数識別形態に基づいて、倒立顕微鏡 ( 図 2 C) を獲得します</li>。
</ol> 5。生体内で移植アッセイ 植を培養、<ol><li>コロニー形成単位脾臓 (CFU-S) 試金 <ol><li>後 2 - 3 日議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 のと孵化によって単一細胞を懸濁液の準備分</li>
		<li>男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの致死照射 (x 線の 9 Gy) を行う細胞の注入の前に 4-5 h</li>。
		<li>照射マウスを入れてその活動を制限する落</li>。
		<li>静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く</li>。
		<li>0.5 の胚と同等 (ee) または 1 ee 単一セル中断 AGM の静脈内に注入照射マウスの尾静脈 1.0 cc 注射器です 。
		注: セル PBS を中断している、受信者ごとの 0.5 mL PBS、適切な音量。25 ゲージまたはサイズ 26 ゲージの針は、1.0 cc 注射器で注入に使用されます。注射器に空気を導入することができます。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します</li>。
		<li>11 日ポスト移植を収集、ブアンで受信者のマウスの脾臓を修正 &#39; s ソリューション (1.22% ピクリン酸飽和溶液 15 mL、2 mL 40% メタノールと酢酸 1 mL) 1-2 日の別の 1 〜 2 日の 80% のアルコールで洗浄。肉眼的脾臓における目に見えるコロニーをカウントし、ee あたりのコロニーの数を決定します 。
		&#8203; 注: ブアン &#39; s 定着剤、摩耗の適切な保護します</li>。
	</ol></li> <li>長期的な移植アッセイ <ol><li>後 2-3 日培養外植体議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 分と孵化によって単一細胞を懸濁液の準備</li>
		<li>致命的な照射 (x 線の 9 Gy) 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの細胞の注入の前に 4-5 時間を実行します</li>。
		<li>照射マウスを入れてその活動を制限する落</li>。
		<li>静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く</li>。
		< l私 > 0.5 胚と同等 (ee) を挿入または 1 ee 1.0 cc 注射器で照射マウスの尾静脈に静脈内 AGM のセル中断のシングルします。AGM は 2 × 10 5 骨髄細胞 (CD45.1 背景) と受信者ごと 1 ee の用量で注入される 。
		注: 空気を導入していない注射器に。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します</li>。
		<li>4 ヶ月間は、移植後、受信者の骨髄を収集し、FACS による再構成の試金のためにそれを使用します。持つ受信者のみ &#8805; 10% ドナー由来のキメリズムが成功した再構成を展示すると見なされます</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
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<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
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<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

著者は金融利害の対立があります。

骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad+ CD45- CD41+) と II 型 (VE cad+ CD45+) 前 HSCs が再構成能力20を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSCs の利点を取って移植アッセイ4,20の受信者を再構築できます。さらに、マウス胚の子宮内開発により KO マウスの造血の障害者を救出する生体内で実験が実行する便利です。AGM 植文化は代替システム、中13,15に (成長因子とサイトカ...

造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。
体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド7の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発10、11,12,13,におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。14します。 重要なことは、また変異胚13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。

<table><tbody><tr><td>デュラポア0.65&マイクロ;mフィルター</td><td>ミリポア</td><td>R5BA63787</td><td>AGM外植片培養</td></tr><tr><td>M5300 長期培養培地</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM外植片培養</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>M-MLV逆転写酵素</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>逆転写</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>定量的リアルタイムPCR</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>タンパク質抽出</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>AGM組織の消化</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-Cアッセイ</td></tr><tr><td>超低アタッチメント 24ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-Cアッセイ</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2マウス</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-Sアッセイ</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1マウス</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>長期移植</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGMコレクション</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM外植片培養</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>長期移植</td></tr><tr><td>抗CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>長期移植</td></tr><tr><td>UVランプ</td><td>北京江朝元バイオテクノロジー株式会社</td><td>039-14402</td><td>パワー:30W</td></tr><tr><td>ステンレス鋼メッシュ</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>開口径:2.5mm</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma</td><td>H0396</td> を選択<td>的に M5300 培地に希釈</td></tr></tbody></table>

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。

最近の出版物は、血管内皮細胞由来セロトニン AGM13pro のアポトーシスを阻害することによって造血の生存を促進する報告しました。HSC におけるセロトニンの促進効果を確認、フルオキセチンが含まれていた。選択的セロトニン再取り込み阻害剤 (SSRI)、としてフルオキセチンは、末梢組織16,17,18にセロトニンの再吸収を阻害する実証されています。文化システムの変化、AGM を使用して、上に示した手順に従って、フルオキセチンの HSC の開発に及ぼす影響を調べた。式解析それぞれ HSC 開発19、フルオキセチン治療 AGMs mRNA および蛋白質レベルでの極めて重要な遺伝子として定義されている Runx1 の発現増加を示した (図 2</strong...

このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

この実験の全体的な目標は、大動脈-生殖腺-中腎外植片培養を使用して、造血幹細胞発生の重要な調節因子を調査することです。この方法は、哺乳類のHSC発生の調節に関与する因子をどのように特定するかについて、HSC生物学および機能分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、これらの調節因子をDNA発現解析とHSCのコロニー形成能および再構成能によって検証できることです。一般に、この方法に不慣れな個人は、体幹領域の周囲の組織からAGMを正確に分離するには習得する練習が必要なため、苦労するでしょう。手順を開始する前に、ウェルごとに2ミリリットルの新たに調製されたフルオキセチン添加培地を含む6ウェルプレートの個々のウェルにステンレス鋼メッシュを配置します。実験ウェル1つにつき1つのUV滅菌0.65マイクロリットルフィルターを、新鮮な沸騰水を入れたガラス細胞培養皿に入れて3分間洗浄し、各洗浄後にフィルターを室温PBSの容器に2分間浸します。次に、各ウェルの気液界面の各スチールメッシュに1つのフィルターを配置します。次に、解剖ハサミを使用して、妊娠11日目の胚マウスから子宮を剥ぎ取り、子宮から胚を採取します。解剖ハサミを使用して、卵黄嚢、臍帯、内臓を胚体から取り除きます。そして、背側の神経組織と周囲の筋肉組織を慎重に取り除きます。鉗子を使用して、前肢と後肢から組織を取り除きます。そして、AGM領域を胚体から分離します。次に、各AGMを各ウェルの気液界面にある1つのフィルターに配置します。培養物を摂氏37度、CO2 5%のインキュベーターに入れます。2〜3日後、AGMサンプルを200マイクロリットルのコラゲナーゼを含む個々の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、摂氏37度で約20分間、5分ごとに振とうしながら解離します。消化の終わりに、外植片あたり200マイクロリットルの血清で反応を停止します。各チューブの内容物全体を、ウェルあたり500〜600マイクロリットルのM3434培地を含む24ウェル超低アタッチメントプレートの個々のウェルに移します。各ウェルの細胞を針のない1ミリリットルの注射器で混合します。プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。各ウェル内のコロニー形成ユニットの数は、7〜10日間の培養後にスコアリングできます。今示したように、AGM培養の2〜3日後のin vivo AGM外植片移植では、8〜10週齢の雄C57黒色マウスに9つの灰色の放射線を致死的に放射します。4〜5時間後、示されているように、サンプルごとに200マイクロリットルのコラゲナーゼで収穫した外植片を解離します。得られた単一細胞懸濁液の0.5〜1つの胚相当物を、レシピエント動物1匹につき1ミリリットルの注射器にロードします。最初に照射したマウスを拘束具に入れ、75%エタノ

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

造血のための3D培養系は、ヒト臍帯血および白血病骨髄細胞を用いて記述されています。方法は、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた多孔質のポリウレタン合成足場の使用に基づいています。この足場は、細胞の広い範囲に対応するために適応可能である。...

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

このプロトコルは、マウス胚性甲状腺の解剖と、半多孔質フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上の外植片の培養について説明しています。このシステムは、野生型またはノックアウト胚の甲状腺発生中に発生する形態形成または分化イベントの研究に理想的であり、機能獲得および機能喪失実験に適しています。...

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

ex vivoの直立液滴培養は、現在のin vitroおよびin...

使い方<em&gt;エクスビボ</em&gt;全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します

このプロトコルは、マウス胚からのmetanephric基盤を単離および培養するための方法を記載する。...

マウス胎児腎臓の解剖および培養

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。...

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

この資料では、新規生体外でそしてovo実験手順を組み合わせることによって器官の形成を研究する古典的なウズラ鶏キメラ...

初期と後期-段鳥モデルにおける器官形成を探索する 2 段階のアプローチ: 胸腺、副甲状腺腺器官パラダイム

この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。...

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。...

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

学ぶ造血幹細胞の発達における重要な調節因子をAGM（大動脈生殖巣中腎）外植培養を用いて探索する方法。DNA発現解析とコロニー形成能測定により、哺乳類のHSC生物学と機能を解明します。

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

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