シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

このビデオの全体的な目標は、ショウジョウバエの間接飛行筋のミトコンドリア超微細構造を研究するためのシリアルセクション電子断層撮影法の応用を決定することです。この方法は、構造細胞生物学の分野における重要な問題、例えば、構造やミトコンドリアとの機能的関係などに答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞の超微細構造が3次元で明らかにされることです。

実験を開始するには、氷上で5匹のDrosophola標本を麻酔し、各フライをリン酸緩衝液の4%低融点アガロース1ミリリットルに浸します。アガロースが氷の上で固まるのを待ちます。次に、振動ブレードミクロトームを使用して、アガロースゲルに包埋されたDrosopholaを厚さ100マイクロメートルのスライスに切片化します。

スライスを2.5%グルタルアルデヒドを含む固定液にゼロポイント1モルリン酸緩衝液に浸します。組織切片を3滴のリン酸緩衝液で洗浄し、続いて20%BSAを含む2滴のリン酸緩衝液で洗浄します。セクションを高圧凍結またはHPF用の金キャリアに置き、バッファーと20%BSAを充填します。

次に、キャリアを含むサンプルをユーザーマニュアルに従って高圧冷凍庫にロードします。凍結後、キャリアを液体窒素下でホルダーから放出し、マイナス140°Cに冷却した自由置換装置に移します。アセトンに2%グルタルアルデヒド、2%四酸化オスミウム、0.1%酢酸ウラニルを含むFSカクテルで遊離置換プロトコルを実行します。

室温で試料をレジンに埋め込みます。その後、樹脂を摂氏65度で16時間重合します。標本ブロックをトリミングして、組織を含む目的のブロック面を露出させます。

次に、10ナノメートルの金粒子を1%BSAで30分間前処理します。金粒子をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、懸濁します。カーボンフィルムでコーティングされた銅スライドグリッドに金粒子を重ねて、フィデューシャルマーカーを作成します。

ウルトラミクロトームを使用して、厚さ200〜250ナノメートルのシリアル切片を切断します。次に、細いセクション用の完全なループを使用して、スロットグリッド上のシリアルセクションを収集します。切片をReynoldsクエン酸鉛で10分間染色します。

セクションの上部に、基準金粒子の2番目の層を重ねます。グリッドを2軸トモグラフィーホルダーにロードし、200キロボルトで動作する透過型電子顕微鏡に挿入します。顕微鏡をユーセントリックフォーカスに合わせます。

自動データ収集ソフトウェアをセットアップし、マルチスケールイメージング設定で電子ビームを調整および位置合わせし、トモグラフィー収集設定の下で炭素膜のない空き領域でカメラの暗い参照と明るい参照を取得します。次に、低倍率でグリッドアトラスを収集します。トモグラフィー収集のターゲットとしてシリアルセクション上のミトコンドリアを選択し、各ターゲットの軸Aに2度刻みで負の60度から正の60度のチルトシリーズを取得します。

最後に、2番目のチルトシリーズを収集します。試料ホルダーを90度回転させます。新しい地図帳を取得します。

対応する位置を選択し、各ターゲットの軸B上の傾斜シリーズを取得します。この方法を用いて、ミトコンドリアの全体積を覆う連続切片からの2D顕微鏡写真および3D断層撮影法を作製しました。結合されたシリアルセクション断層撮影は、z軸が垂直に表示される縦断面を作成するように投影されます。

シリアルセクション電子線トモグラフィーを応用して、ミトコンドリアクリステのエネルギー状態と老化を反映した構造的特徴を解析した。ミトコンドリアの電子断層撮影再構成のスライスは、z軸を介して層膜間のスイッチを明らかにします。左利きのスパイラルを3Dで示す断層撮影セグメンテーション。

Cristaeのスイッチングパターンを分析し、セグメンテーションモデルで色をレンダリングしました。断層撮影スライスは、クリステ膜を横切る側マトリックスの合流性を示しています。断層撮影のセグメンテーションモデルが生成され、横方向のマトリックスの合流点と代表的な結晶が示されました。

このビデオを見れば、あらゆる細胞構造を3次元で研究するために適応する可能性のあるシリアルセクション電子断層撮影の方法についてよく理解できるはずです。