Name: Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶペンチレンテトラゾール誘起キンドリング法によるマウスてんかんモデルの作製と行動解析。129SVマウスを用いて発作誘導と社会的記憶・恐怖記憶の評価を行い、てんかん関連神経精神発達障害のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 24700349、24659093、25293239、JP18H02536、17 K 07086、文部科学省科研費助成番号 25110737、23110525、アメッド許可番号 JP18ek0109311、洗心医療研究財団と日本によって支えられた部分的てんかん研究の基礎。

すべての実験手順は、動物のケアおよび使用委員会の東京都医科学研究所によって承認されました。生後 8 - 16 週齢のマウスはお勧めします。任意の交は、実験のため許容されます。C57bl/6 マウス BALB/c とスイスのアルビノ マウス、ptz カメラより敏感に対し ptz カメラより耐性があります。C57BL/6 は、この研究で使用されました。Ptz カメラの脆弱性は、マウスの年齢によっても異なります。若いマウスと比較して、古いマウスは、PTZ35より耐火物。このメソッドに使用される動物の数が異なることが、少なくとも 6-10 動物が条件ごとに必要です。
1. PTZ の準備
<ol><li>2 mg/mL PTZ 滅菌 0.9% (w/v) 塩化ナトリウムを溶解します。当日使用の ptz カメラを準備します。</li>
</ol>2. PTZ の注入
<ol><li>9:00 と 12:00 (正午) の間のすべての実験を実行します。</li>
	<li>動物の体重を測定します。</li>
	<li>慣れのため観察室に動物を配置します。</li>
	<li>(3 分) の馴化期間中 PTZ 動物や、以前に決定された投与の体重に基づく注射剤の量を計算します。 注: たとえば、35 mg/kg ptz カメラを使用すると、PTZ の 0.875 mg は 25 グラムの重量を量るマウスに必要な (35 mg/kg × 0.025 kg = 0.875 mg)。2 mg/mL PTZ ソリューションの 437.5 μ L 注入してしたがって、(0.875 mg/2 mg/mL = 0.4375 mL)。PTZ の注入量は、マウスの遺伝子型とひずみに依存します。野生型 c57bl/6 マウス最初の試験、30-35 mg PTZ/kg 体重の投与量を使用することをお勧めします。Ptz カメラの感度は、マウス使用株報36,37に依存します。注射の投与量は、実験の目的によって異なります。</li>
	<li>動物の腹部の左または右の象限に 27 g 針に接続されている 1 mL 注射器で PTZ を腹腔内注入します。正中線に注入することは避けてください。<ol>
<li>同じ位置に繰り返し注射を避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ (図 1 a)、投与後 30 分間、動物の行動を観察し、分類スコア異常行動を次のように。可能であれば、特にになったら発作重症度スコア 3 以上は、24 h、または、少なくともさらに 6-10 時間の投与後、観察の下で動物を飼います。<ol>
<li>任意の軽度の発作または 30 分観察期間を超えて動物の行動の変化に注意してください。これは長期観察期間てんかんの慢性のいわれのない発作の世代で PTZ の subconvulsive 線量の特に重要な影響に対処することです。</li>
		<li>さらに、発作の重症度に関連するメジャーな発作期間の変更として各観測発作の発作期間。また、PTZ 注射後最初の発作に待ち時間は、収集するもう一つの重要な指標です。発作頻度、期間、および待機時間を監視、発作後の分子研究のため重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ の毎日 (図 1 a) を挿入します。注射の数は、実験の目的によって異なります。代表的な例は次のとおりです。<ol>
<li>動物はスコア 5 (強直間代発作) の発作を経験したら、完全に燃やし動物を生成するには、追加の 3 政権内注入を終了します。3 つの連続した政権の奪取のスコアが向上しない場合この場合、注射投与量を増加します。それぞれの動物は異なる番号と PTZ 注射の用量を受信できます。</li>
		<li>PTZ、抗てんかん薬の評価、遺伝子改変マウスの表現型の研究などへの脆弱性を評価するすべての条件の数と PTZ 注入量を修正します。すべての動物に PTZ 注入; の同じ数を与える合計 8 に 12 の注射をお勧めします。動物が死亡した場合発作スコアは 6 として示されるべきであります。</li>
		<li>高発作を維持するために必要な注射の用量を決定するてんかん発作が発生する病理組織学的変化を研究する 10 以上の注射用 (4 または 5) を獲得します。この場合、総噴射数は 25 から 30 の範囲する必要があります。発作スコア 5 に達すると注入量を減らします。発作スコア 3 以下が縮小した場合は、注射投与量を増やします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 発作のスコア
<ol><li>動物の行動を観察し、スコアを記録します。<ol>
<li>分類し、続く38,39 (図 1 b)、てんかんの行動のスコアします。 0: 正常な動作、異常無し。 1: 固定、腹の上に横たわる。 2: 頭うなずいて、顔、前肢または後肢ミオクローヌス。 3: 継続的な全身のミオクローヌス、ミオクロニー ピクピク、尾がかたく開催。 4: 飼育、トニックの奪取、その側に落ちる。 5: 野生急いでとジャンプ、その裏に落ちて、強直間代発作です。 6: 死。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラシーン スコア40、実験の状況に基づく行動基準を変更します。</li>
</ol>4. 発作後分析
<ol><li>今回の分析<ol>
<li>灌流固定<ol>
<li>準備<ol>
<li>4% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を 0.1 M リン酸緩衝液 (7.4) に溶かしてください。約 70 ° C に 1 M 水酸化ナトリウム (50 mL PFA ソリューションの 1 M 水酸化ナトリウム約 1 μ L) のドロップを追加するソリューションを加熱します。</li>
				<li>準備冷えた 4 %pfa とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。</li>
				<li>針と管の蠕動性ポンプを設定します。残留をクリアするための管を通って約 20 mL の水を実行します。次に、氷冷 PBS で管の開口端を置きます。</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial 血流と固定の脳の準備<ol>
<li>深く小さな瓶で 50 %isoflurane/50% エタノールとマウスを麻酔します。</li>
				<li>仰臥位で、前肢と後肢の先端を固定することでマウスを維持します。</li>
				<li>腹部の腹側正中線をカットし、横隔膜を公開します。</li>
				<li>横隔膜を肋骨の縁に沿ってカットします。その後、リブとボディの両方の側面をカットします。ロックの鉗子で剣状突起をつまみ、胸郭を片脚します。針で固定または鉗子でつまんで、剣状突起の位置を維持します。心を公開します。</li>
				<li>左心室に針を挿入し、はさみを使用して右心房に切れ込み。内部の壁に穴を開けることができると心臓に針をあまりプッシュしないように注意してください。</li>
				<li>(約 15 ~ 20 mL/分) 血液を洗浄するための針を通して氷冷 PBS の着実な流れを開始します。</li>
				<li>体から血液を選択解除すると、泡の添加せず 4% パラホルムアルデヒド溶液 (約 60 mL) にチューブを移動します。灌流を停止します。</li>
				<li>背面の首と背骨を切り取って頭の皮膚とはさみを解剖で頭蓋骨の背の部分をはがします。</li>
				<li>眼窩間属の骨を切り、頭蓋骨の背の部分を完全に削除します。</li>
				<li>後方から jugal 骨と脳の間のギャップを作成し、脳の下に三叉神経と視交叉をカットします。慎重に脳を削除し、4% を含むバイアルに PFA。12-16 h のための 4 ° C で脳を修正後。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>脳スライス標本<ol>
<li>脳に対する凍害保護作用を可能にするソリューションに沈むまで 20% スクロース/PBS に固定脳を転送します。</li>
			<li>必要なスライス方向と脳の必要な部品に基づく固定脳をカットします。</li>
			<li>Cryomicrotome を設定します。位置にブレードをセットし、温度-20 ° C 未満にミクロトーム ステージを維持</li>
			<li>カット済みの脳をステージに配置、20% スクロース/PBS で脳をコートします。スクロース/PBS ソリューションが徐々 にフリーズする、まで脳が完全に冷凍 20% スクロース/PBS で埋め込まれているステージで、脳を覆っています。</li>
			<li>組織をブレードをスライドさせて、脳 (30 μ m 厚) をスライスします。PBS にスライスを転送し、4 ° C でそれらを保つ</li>
		</ol>
</li>
		<li>蛍光免疫組織化学<ol>
<li>0.1% で必要なスライスを洗うトリトン X 100/PBS (PBST) 室温 (RT) で 3 回、10 分間。</li>
			<li>2% ヤギ血清または 5% ウシ血清アルブミン (BSA) に 1-2 時間室温で PBST にそれらをインキュベートし、スライスをブロックします。</li>
			<li>4 ° C で 1 に 7 overnights 2% ヤギ血清または 5 %bsa を用いた PBST の一次抗体の濃度が適切な抗体溶液内のスライスを孵化させなさい</li>
			<li>10 分間、室温 3 回 PBST でスライスを洗う</li>
			<li>光保護 RT で 1-2 時間 PBST で二次抗体の濃度が適切な二次抗体の解決でスライスを孵化させなさい。</li>
			<li>スライド ガラスの上にスライスをマウントし、メディアをマウント、カバーガラスでカバーします。</li>
			<li>蛍光顕微鏡とスライスを観察します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>3 商工会議所テスト<ol>
<li>準備<ol>
<li>少なくとも 2 2-6 ヶ月歳 129/Sv マウス「見知らぬ人のマウス」にマウスとして同性の準備します。分析の前にケージの中のすべてのマウスを慣らします。各トレーニング セッションの檻の中にマウスを置くし、15 分間マウスを残してください。</li>
			<li>件名マウスを使って各慣れのフェーズの前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって全体の器具や両方のケージをきれい。</li>
			<li>3 商工会議所装置の 2 つの側面の部屋で空のケージを置き、部屋間のドアを開きます。</li>
			<li>件名マウスを慣らすしセンター室で件名マウスを置きます、マウスは両方のケージを調査に加えて、ケージを恐れているかもしれない追加 5 分対象動物はありませんまで自由に装置を通して移動するマウスを許可します。20 分のケージを調査し、この分析方法では使用しないでください。そのような動物は、ケージを回避し、ほとんどケージの近くに来る。</li>
			<li>動物センター室に移動後と 5 分センター室を自由に移動マウスの扉を終了します。この期間中にケージに慣らすにケージで 129/Sv のマウスの 1 つを置きます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>社会性解析<ol>
<li>件名マウス馴化期間の直後にこの分析を実施します。</li>
			<li>129/Sv マウスを含んでいるかごを置き「見知らぬ人 1 ケージ」、側面の部屋の 1 つのと呼ばれる「オブジェクト ケージ」、他側の商工会議所でと呼ばれる空のケージを配置します。</li>
			<li>ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。</li>
			<li>10 分間自由に移動し、次の行動のパラメーターを記録する件名マウスを許可します。見知らぬ人 1 ケージを回避し、残りの部屋の 1 つの隅にマウスで示されているように、件名マウスが見知らぬ人 1 ケージ内マウスを恐れて、動物は分析のため使用しないでください。 各商工会議所、見知らぬ人 1 部屋、オブジェクト室内楽、そしてセンター室で) 時間を過ごした。 各ケージ、見知らぬ人 1 ケージおよびオブジェクト ケージの調査にかかった時間 b)。(マウスはマウスをくんくんかいでケージを調べてまたは toughing マウスまたはケージとして分類されます) c) (省略可能) 各商工会議所に入り口の数 d) 総走行距離旅 (オプション)</li>
			<li>マウスのセンター室に移動後、は、ドアを閉じます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目新しさは社会分析<ol>
<li>社会性解析の直後に、この分析を実施します。</li>
			<li>両方のケージ 70% エタノールで拭いてください。</li>
			<li>「見知らぬ人 2 ケージ」と部屋の 1 つの場所見知らぬ人 2 ケージと呼ばれるケージ内の 1 つの別の 129/Sv マウスを置きます。「見知らぬ人 1 ケージ」と呼ばれる、他のケージで見知らぬ人 1 マウスに、他の部屋で見知らぬ人 1 ケージを置きます。</li>
			<li>ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。</li>
			<li>10 分間自由に移動する被写体マウスを許可し、社会性解析について同じ行動パラメーターを測定します。 注: 1 見知らぬ人と見知らぬ人 2 マウスをランダムに選択する必要があります。見知らぬ人 1 室とオブジェクト商工会議所と同様、見知らぬ人 1 室と見知らぬ人の 2 室は、ランダムに決定する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>文脈恐怖差別<ol>
<li>ご利用いただけます<ol>
<li>各ご利用いただけます公判前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。</li>
			<li>マウスが、特定の条件でエアコン装置 (装置の形状、壁の色、床材、臭気、照明、バック グラウンド ノイズの音量が事前確認)。たとえば、ここで使用されるエアコン装置だった明確なプレキシ ガラス壁、金属格子床、エタノール臭、100 ルクスの明るさ 65 dB 背景ホワイト ノイズと正方形の装置です。</li>
			<li>0.1 mA 2 の電気ショックの擬似ランダムのタイミングでフット ショックによるマウスの状態 s x 3 倍に 5 分のコースも。</li>
			<li>ご利用いただけます後自宅のケージにマウスを返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>メモリ評価<ol>
<li>それぞれの評価の前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。</li>
			<li>次の日以下のエアコン、ショック状態と同じ装置の上にマウスを置くし、5 分にわたって凍結時間を測定します。</li>
			<li>後で同じ日に装置にマウスを置くし、5 分アセスメント中に凍結時間を測定します。白プレキシ ガラス壁、板の床、臭気、30 ルクスの明るさと 70 dB ホワイト ノイズ三角装置をここで使いました。</li>
			<li>同じ条件と新規の条件の凍結時間を比較します。通常のメモリの能力を持つマウスは、新規の状態でよりも同じ状態でもっと固定されます。凍結は、以上の 2 のための動物の定義された不動 s。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここでは、てんかんの薬理学的動物モデルの確立のため広くアクセス プロトコルを提案します。Ptz カメラを介した化学たきは長い歴史を持つ、てんかん41の病理組織学的および細胞の病理学の調査のための一般に受け入れられたモデルです。てんかんの化学的キンドリング モデルは Suzdak とヤンセン、1995年42以前見直されました。薬理学的発作誘導、PTZ、とくに、重症発作を誘発簡単でシンプルな方法です。注入量の変化は、発作の重症度と相関します。したがって、PTZ 用量を変更して、結果の動作を調べることによっていくつかの試験に適切な投与量を識別することは非常に簡単です。
多くの研究者がノックアウトまたはノックイン マウスてんかんモデルとして作成し、自発性発作43,44を示すマウスの生産に成功しているしようとしました。ただし、薬理学的発作誘導はまだてんかんの良いモデルを考慮します。...

てんかんは、慢性神経疾患再発発作によって特徴付けられる、人々 の約 1% に影響を与えます。てんかん患者におけるてんかんと発作の生成の基になるメカニズムは、臨床試験で完全に明らかにできません。したがって、適切な動物モデルがてんかん1の調査のために必要です。
さまざまなてんかん動物モデルは、てんかんの生理学を調査し、抗てんかん薬2,3を識別するために使用されています。これらのモデルの間では、薬理学的発作誘導、てんかん4の病理学の調査のための動物モデルを生成するために使用する一般的な方法です。このメソッドは、安価で簡単です。電極を介したたきは、一般的に使用される方法が、この手順のコストが高いとメソッド反復発作5を誘導する手術や電気のスキルが必要です。
薬理学的誘導は、タイミングと発作の数をコントロールしやすいためにも便利です。自発的な発作を示す遺伝的マウスモデルもてんかんの研究に使用されます。しかし、これらの遺伝的モデルで発作が発生するタイミングと頻度を予測不可能6可能性があります。監視システムは遺伝子改変マウス6のてんかんの行動を観察する必要があります。
カイニン酸、ピロカルピン、pentylenetetrazole (PTZ) は、発作を誘発する薬7として広く使用されます。カイニン酸はグルタミン酸受容体のアゴニスト、ピロカルピンがコリン作動性受容体を活性化します。PTZ は、γ アミノ酪酸 (GABA) の受容体拮抗薬8。PTZ は、神経活動の増加につながる抑制性シナプスの機能を抑制します。この規制は、動物9の一般化された発作を引き起こします。カイニン酸とピロカルピンの単回投与は、急性発作、特にステータスてんかん重積 (SE)10,11を引き起こすことができるおよび慢性特発性と再発発作12を促進するカイニン酸やピロカルピン-仲介された SE,13。 脳波 (EEG) 録音と行動分析が自発的再発性発作が注射12,13の後の月を観察が示されています。PTZ の痙攣投与量の単回投与は、急性発作を誘導します。ただし、PTZ の単一投与後慢性特発性発作は促進するために困難です。PTZ の慢性投与は、反復発作14を誘導する必要があります。いずれかの方法で繰り返し発作の発生は急性発作の世代よりもより類似している人間のてんかんの病理を誘導することができます。PTZ、場合各注射を呼び起こす、発作と発作の重症度は、各注入と段階的により深刻になります。最後に、低用量の PTZ 注射は重度の強直間代発作を誘発します。このフェーズでは、各注入は重篤な発作を連想させます。さらに、発作の待ち時間と実行時間注射のコースに変更もできます。強直発作に待ち時間はしばしば15をたき付けの後者の段階で短くなります。さらに、発作悪化長期発作期間16と一緒に伴われます。発作の重症度を調節する分子メカニズムを解明、待機時間、および期間は、抗てんかん薬17,18,19をスクリーニングするため便利です。
発作は、PTZ の単一の全身投与によって引き起こされる一般的と回復は非常に速く、30 分4,5以内。したがって、発作の数は PTZ キンドリング モデルでより制御可能です。ただし、脳波モニタリングは PTZ を介した発作20後 12 h まで一般化されたスパイクを見ることができることを示しています。したがって、点火機構のより正確な分析のためのまたはミオクロニー強直発作21後 24 時間観察下動物のまま好ましく。
PTZ 注入の前後に抗てんかん薬のエトスクシミド、バルプロ酸、フェノバルビ タール、vigabatrin、retigabine3など管理が発作重症度3,22の悪化を軽減します。 23。同様に、ノックアウト マウス マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 924などの発作の増悪に関与して欠如遺伝子が、FGF 2225と neuritin26, を使用することを複数の PTZ 注射後減らされた発作の重症度を展示する示されています。さらに、てんかん発作はこのメソッドの後に病理組織学的変化を観察しています。側頭葉てんかん患者、苔状線維が発芽して27,28, 異常な顆粒ニューロン移行29、アストログリオーシス30, 神経細胞のような頭脳で典型的な所見があります。海馬31,32海馬硬化33年死去。同様の変化は、てんかんモデル動物で観察されます。利用可能なメソッドの中で化学的キンドリングの PTZ を介したはてんかん動物モデルを生成する、再現性のある良いと安価な方法です。ピロカルピンを介した SE モデルで発作のコントロールが難しく、多くのマウスが死ぬか SE34を開発する失敗します。対照的に、死亡率と発作の重症度は、PTZ モデルでより制御されます。また、PTZ、カイニン酸よりも安価、マウス脳外科のスキルは薬剤の投与は必須ではありません。

<table><tbody><tr><td>ペンチレンテトラゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>MANAC</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>CLEA Japan</td><td></td><td>C57Bl/6NJcl, 産後 8 週 オス</td></tr><tr><td>シリンジ (1mL)</td><td>テルモ</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>針(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)</td><td>テルモ</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>体重計</td><td>メト</td><td>ラーPE2000</td><td>この商品は販売終了製品です。FX-2000iとほぼ同等で、A&のFXi-12-JAを搭載D会社。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>ナカライ テスク</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>ペリスタティックポンプ</td><td>ATTO</td><td>SJ1211</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ナカライ テスク</td><td>30404-45</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td> ヤ<td>マト</td><td>REM-700</td><td>この商品は生産終了品です。REM-710とほぼ同等</td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>フェザー</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>抗シナプ</td><td>スポリン抗体 シナプスシステム</td><td>102 002</td><td></td></tr><tr><td>抗ZnT3抗体</td><td>シナプスシステム</td><td>197 002</td><td></td></tr><tr><td>アンチダブルコルチン</td><td>サンタクルス</td><td>sc-8066</td><td>こちらの商品は生産終了商品です。同等品(sc-271390)の試験は行っておりません。</td></tr><tr><td>文脈的恐怖判別試験装置</td><td>オハラ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三室試験装置</td><td>室町</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) は、GABA 受容体の拮抗薬です。Subconvulsive 線量の連続注射化学たき、てんかんモデルの開発に使用されているに対し、動物に PTZ の腹腔内投与は高用量で急性、重症発作を誘発します。PTZ の低用量注射なし痙攣発作を誘発します。ただし、PTZ の繰り返し低用量注射はけいれん発作を引き起こす閾値を低下します。最後に、PTZ の連続の低用量投与は重度の強直間代発作を誘発します。このメソッドは、単純なてんかんのけいれん発作を反復を含む慢性疾患として定義される病態の調査に広く適用できます。プロトコルをたきこの化学物質は、動物の反復的な発作を引き起こします。この方法では、ptz カメラを介した発作やてんかん発作の悪化の程度への脆弱性が推定されました。これらの利点は、抗てんかん薬、てんかん関連遺伝子をスクリーニングするためのこのメソッドの使用につながっています。さらに、このメソッドは、てんかん患者の脳の組織学的変化は、化学焚かれ動物の脳にも表示されますので、てんかん発作後神経損傷を調査する使用されています。したがって、このプロトコルは、便利なてんかんモデル動物の作成に便利です。

PTZ の反復注射は、発作の重症度の増加を誘導します。6 c57bl/6 マウスを施した PTZ と別の 6 マウスは対照群として生理食塩水で扱われました。PTZ 投与量は 35 mg/kg と 10 注射を投与します。発作のスコアは、発作や異常行動を生理食塩水注射 (図 2) でない誘発したに対し、PTZ 注射で徐々 に増加。ボンフェローニ テスト続く分散分析は、PTZ 投与群と生理食塩水投与群間に有意差を示した。
反復発作は異常な軸索分岐形成 (苔状線維芽) と海馬顆粒細胞の異常な移行を促進します。マウスは、(投与量は 24 mg/kg と重度の発作による死亡を引き起こすことがなくマウスで重度の発作を維持するために 35 mg/kg の間調整された) 25 注射用 PTZ と扱われました。マウスの脳は、最後の注射後 3 週間を修正しました。制御脳は、PTZ 注射前に修正されました。脳スライ...

このプロトコルは pentylenetetrazole と化学的キンドリングの方法を記述しててんかんのマウス モデルを提供します。このプロトコルはマウスのてんかん発作後発作誘導と病態への脆弱性を調査するも使用できます。

Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

この方法は、てんかんの深い分析に役立ちます。発作は、神経精神発達障害に関与している可能性のある脳の組織学的変化を誘発します。この手法の主な利点は、PTZの自己会話的用量が、他の現在の方法よりも制御可能な発作を誘発できることです。注射の準備を開始するには、PTZあたり2ミリグラム/ミリグラムを滅菌済みの0.9パーセント塩化ナトリウムに溶解します。.動物の体重を量り、観察室に3分間の馴染ませます。次に、1ゲージの針に取り付けられた27ミリリットルの注射器を使用して、PTZを動物の腹部の左右の象限に腹腔間注入します。最後に、PTZ注射後の動物に異常な行動がないか観察します。対象マウスと同性の生後2〜6か月の129 SVマウスを少なくとも2匹入手して、見知らぬマウスにします。見知らぬ人のマウスはそれぞれ別々に飼う必要があります。各トレーニングセッションで、マウスをケージに入れて15分間慣れさせます。70%エタノールで表面を拭いて、両方のケージの装置全体を清掃します。次に、空のケージを3チャンバー装置の2つのサイドチャンバーに置き、チャンバー間のドアを開けます。対象のマウスを慣れさせるために、対象のマウスを中央のチャンバーに置き、マウスが両方のケージを調査するまで、さらに5分間、マウスが装置内を自由に動くようにする。動物が中央の部屋に移動した後、ドアを閉め、マウスが中央の部屋で5分間自由に動くようにします。この期間中に、129匹のSVマウスのうちの1匹をケージに入れてケージに慣れさせます。対象マウスの慣れ期間の直後に、129SVマウスを含むケージ(Stranger Oneケージと呼ばれる)を一方のサイドチャンバーに置き、空のケージ(オブジェクトケージと呼ばれる)をもう一方のサイドチャンバーに配置します。ドアを開けて、対象のマウスの行動を監視します。対象のマウスを10分間自由に動かし、4つの動作パラメータを記録します。その1は、各部屋で過ごした時間、ストレンジャー・ワンの部屋、オブジェクトの部屋、そして中央の部屋です。その2、各ケージ、ストレンジャーワンケージ、オブジェクトケージの調査に費やした時間。3番は各部屋への入り口の数、4番は総移動距離です。マウスが中央の部屋に移動したら、ドアを閉めます。ケージを拭いた後、別の129 SVマウスをケージの1つ(Stranger Twoケージと呼ばれる)に配置し、Stranger Twoケージをチャンバーの1つに配置することにより、社会的新規性分析を開始します。Stranger OneマウスをStranger Oneケージと呼ばれるもう一方のケージに入れ、Stranger Oneケージをもう一方のチャンバーに置きます。最後に、ドアを開けて、対象のマウスの動作を監視します。対象のマウスを10分間自由に動かし、社会性分析で説明したのと同じ行動パラメータを測定します。まず、特定の条件でマウスをコンディショニング装置に入れます。たとえば、透明なプレキシガラスの壁、金属製のグリッド床、エタノール臭、100ルクスの明るさ、65デシベルのバックグラウンドホワイトノイズを備えた正方形の装置です。0.1ミリアンペアの電気ショックを2秒間の擬似ランダムタイミングで5分間に3回、足で衝撃を与えてマウスをコンディショニングします。その後、コンディショニング後にマウスをホームケージに戻します。コンディショニングの翌日、マウスをショック状態と同じ装置に入れ、5分間の凍結時間を測定して記憶評価を行います。同じ日のうちに、マウスを新しい装置に入れ、5分間の評価で凍結時間を測定します。最後に、同じ条件と新しい条件の凍結時間を比較します。その結果、PTZ注射により発作スコアが徐々に上昇したのに対し、生理食塩水注射では発作や異常な行動は誘発されなかったことが示された。さらに、反復発作は、異常な軸索枝形成または苔状線維の発芽と海馬の顆粒細胞の異常な移動を促進しました。PTZ治療マウスは正常な社会性を示した。マウスは、オブジェクトチャンバーよりもストレンジャーワンチャンバーで多くの時間を過ごし、オブジェクトケージを調査するよりもストレンジャーワンケージを調査しました。PTZ治療マウスは異常な社会的新規性を示し、社会的記憶の障害を示しています。PTZ治療を受けたマウスは、文脈的恐怖テストでも記憶障害を示しました。この手順に続いて、モリスウォーターメイズや他の記憶テストなどの他の方法を実行して、てんかん発作の影響を受ける記憶能力の障害に関する追加の質問に答えることができます。この技術の開発は、てんかん分野の研究者が、モデル動物を用いて発作誘発性精神神経発達障害のメカニズムとして探求する道を開くものです。

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Research

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Neuroscience

神経科学

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