レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析

この方法論の全体的な目標は、レンズフリーのビデオ顕微鏡法によってモニターされた接着細胞の大規模な集団のダイナミクスを取得し、分析することです。ですから、この手法は、生物学の多くの分野で、細胞増殖や細胞膀胱炎、薬物スクリーニング、またはさまざまなバイオプロセスモニタリングの研究に興味深いと考えています。したがって、この手法はラベルフリーで、非常に簡単です。

しかし、大きな細胞集団の研究には非常に効果的です。細菌を検出する分野から哺乳類の細胞をイメージングする分野にシフトしたとき、この方法のアイデアは何ですか。その後、生物学者が、回路をインキュベーターに直接タイムラプス取得する必要があることは役に立ちました。

次に、インキュベーターと互換性のあるカスタマイズされたレンズフリービデオ顕微鏡を構築し、非常に広い視野に存在する何千もの細胞の画像を取得するためのホログラフィック再構成アルゴリズムを開発しました。この手順は、6ウェルガラスの底板にフィブロネクチンを室温で1時間コーティングすることから始めます。1時間後、余分なフィブロネクチンを取り除き、6ウェルガラスの底板をPBSで洗い流します。

このデモンストレーションでは、DMEMで増殖したHela細胞とグルタミン培地、活性化ウシ胎児血清中の10%の熱、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンが使用されています。培養プレートごとに2万個の細胞を播種します。底がガラスの容器を使用することが重要です。

レンズフリーの撮影品質のために。培養プレートをレンズフリービデオ顕微鏡の上のインキュベーターに置きます。このタイムラプス撮影に用いたレンズフリーのビデオマイクロスコープは市販されています。

撮像面積29.4平方ミリメートル、画素ピッチ1.67マイクロメートルの金属酸化物半導体イメージセンサーを搭載しています。多波長照明は、細胞から約5cmの距離にある150μmのピンホールの上方に位置するマルチチップ発光ダイオードデバイスによって提供されます。タイムラプス撮影を開始する前に、カバープレートに結露がないことを確認することが重要です。

結露すると、取得の画質が低下するためです。培養プレートのカバーに結露が発生した場合は、カバーを清掃してください。ビデオレンズフリー顕微鏡は、市販のデータ収集ソフトウェアで制御します。

これは、タイムラプス取得とホログラフィック再構成の両方を実行します。ソフトウェアインターフェースに必要な入力パラメータを入力します。フレームレートを 10 分ごとに 1 回、細胞培養タイプを接着型、実験期間を 3 日間に設定します。

タイムラプス撮影を開始します。この画像は、1 フレームの 29.4 平方ミリメートルの領域に青チャネルで取得した raw データの全視野の例を示しています。パネルBはパネルAの詳細であり、パネルCはパネルBの詳細です.ホログラフィック再構成アルゴリズムは、レンズフリーの取得を自動的に処理して、細胞培養の位相画像を取得します。

フェーズ アンラップ前のセルの例の画像を示し、その後にフェーズ アンラップ後の画像を示します。セルトラッキングは、単一粒子の自動トラッキングのためのオープンソースのフィジープラグインであるTrackMateアルゴリズムを使用して行われます。ロード後、フィジーへのフルタイムラプス取得と、テキストプロトコルで説明されているアルゴリズムの設定、入力パラメータの設定を行います。

ブロブの推定直径を 15 ピクセル、検出器のしきい値を 0.25、リンクの最大距離を 15 ピクセル、ギャップを閉じる最大距離を 15 ピクセル、トラック内のスポットの数を 3.5 に設定します。細胞追跡アルゴリズムの最初のステップは、レンズフリー取得における細胞の検出です。セルトラッキングアルゴリズムの結果が表示され、すべてのセルトラックが50フレーム、つまり約8時間にわたって表示されます。

中央速度に対応するカラーコード付き。下部パネルは、上部パネルから見た黄色の長方形の詳細な画像です。ここには、細胞追跡の代表的なビデオクリップを示します。

セルトラッキングプロセスの最後に、分析ボタンを選択して、結果を3つのテキストファイルの形式で生成します。このデータに基づいて、テキストプロトコルおよび補足コードファイルに詳述されているように、専用のアルゴリズムを使用して細胞セグメンテーションを実行し、細胞分裂を検出します。すべてのシングルセル測定値をフルタイムラプス取得でまとめると、いくつかのメトリクスの散布図が時間の関数として生成されます。

全視野内の細胞の総数は、2.7日で2000から15000に増加します。時間点の数を掛けると、検出されたセルの大規模なデータセットが得られます。それぞれが、乾燥質量、面積、平均厚さ、主要なアクセス長、アスペクト比などの座標と形態学的特徴によって特徴付けられます。

細胞追跡アルゴリズムと細胞セグメンテーションアルゴリズムの組み合わせにより、単一細胞レベルでの速度論的測定が可能になります。この例は、約 66 時間続くセル トラックの解析を示し、黄色で囲んだ時点で 4 つの細胞分裂を示しています。いくつかの指標は、時間:細胞表面積、乾燥質量、平均厚さ、および細胞運動性の関数として計算されました。

2.7日間の観察における細胞周期の持続時間の分布は、agouzianに近かった。平均16.5時間です。自動的に測定される細胞周期の長さは、手動で測定されたものとよく相関しています。

細胞の初期乾燥質量、最終乾燥質量、細胞周期中の平均成長率など、他のパラメータも調べました。一度習得すると、タイムラプス取得の完全なデータ分析は、CPU構成とハードウェアのパフォーマンスにもよりますが、数時間で実行できます。この手順を試みる際には、初期細胞濃度を慎重に行うことが非常に重要です。

初期細胞濃度が大きすぎると、細胞追跡アルゴリズムは細胞軌道を適切に定義できません。しかし、細胞濃度が低すぎると、完全な分析の統計も低すぎます。この手順に続いて、生物学、基礎生物学、または走化性の分野で他の質問に答えるために、細胞追跡分析のような自動化された分析を実行することができます。

この新しい技術は、細胞系譜のモニタリングへの道を開き、細胞周期を研究するための興味深い洞察をもたらすことを願っています。このビデオを見れば、レンズフリーのビデオ顕微鏡によるタイムラプス取得の方法と、大量の細胞集団の分析方法について十分に理解できるはずです。