Name: 標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ標的治療薬剤耐性のメカニズムをin vitroで特定・特性化する手法。薬剤耐性サブクローンの樹立と遺伝子ノックダウンによる感受性回復を用い、がん治療における耐性克服戦略の開発に貢献します。

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著者の原稿を編集のため博士ベロニカ ザノーニを感謝したいです。

注: このプロトコルは、具体的にはトラスツズマブ HER 陽性胃癌細胞株の抵抗性獲得機構の解析に調整されています。必要なすべての実験室の器械は、材料表で報告されます。
1. 対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代
注: これは、最も重要かつ異なる細胞を表わすかもしれないない別の感度にターゲットを絞った治療阻害剤独立して腫瘍 histotype や薬物濃度からという事実のために、プロトコルの手順を標準化することは困難使用されます。
<ol><li>文化 NCI N87 セル RPMI 培牛胎児血清 (10%) とグルタミン (2 mM, 1%)、37 ° C で単分子膜としての線、25 cm2培養フラスコにシードします。</li>
	<li>先発の線量としてトラスツズマブの各のフラスコ 10 μ g/mL の培養液を追加します。彼らは成長を再開するまでは、先発の線量に細胞を公開します。 注: 標的治療阻害剤の先発の線量は 10 倍、血漿中のピーク濃度よりも低いはずです。血漿中のピーク濃度は、通常次の標準療法の複数用量患者血中薬物濃度の最高レベルです。この値は、薬物動態に関する研究から取得することができます。</li>
	<li>トリパン ブルー色素排除法と細胞の成長を監視します。(通常 2 〜 3 週間の期間) 後細胞の成長を再開すると、トラスツズマブの 10 倍高い線量集中する細胞を公開します。</li>
	<li>(約 2 週間) 後の高い薬物濃度 (少なくとも 2.5 - 4 倍プラズマ ピークよりも高い) の存在にもかかわらず、成長細胞維持までトラスツズマブ (から 400 μ g/mL に 100 μ g/mL) 量が徐々 に増加する細胞を公開します。</li>
	<li>
濃度の培養液でターゲット療法阻害のあらゆる変化で標的治療への抵抗のレベルを評価するクローン形成法を実行し、相対抵抗 IC50インデックス (RR IC50) を次のように定義します。
	<ol>
<li>24 ウェル培養皿 500 細胞を播きます。 注: 5 ウェルズは、条件セットごとに準備されなければなりません。</li>
		<li>100 μ g/mL 400 μ G/ml までターゲット療法 (トラスツズマブ) 阻害剤の濃度を上げるに細胞を公開します。</li>
		<li>15 日間の 37 ° C で CO2インキュベーター内のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>インキュベーション後、修正し、次のようにサンプルを染色します。<ol>
<li>10 mL の 1x PBS の媒体とリンスのセルを削除します。1x PBS を削除し、固定液 (酢酸酸: メタノール、1:7、(巻/巻)) の 2-3 mL を追加します。固定の解決を削除し、0.5% クリスタル バイオレット溶液を追加します。2 時間室温で孵化させなさい</li>
			<li>クリスタル ・ バイオレット液をピペットで吸引によって慎重に削除し、クリスタル バイオレット ソリューション残渣を洗い流す水道水でプレートを浸します。2 日間室温で空気乾燥します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>倒立顕微鏡 (4 倍) を使用して 50 以上の細胞のコロニーをカウントします。 注: この 2 つの独立した観測者が必要です。</li>
		<li>RR IC50をターゲット治療抵抗性 subclone セルの IC50値と元/ナイーブ細胞の値の比率として計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 検証プロトコル候補者に対象療法抵抗性遺伝子 (R 遺伝子)
注: 遺伝子発現の解析後、署名に関連付けられているターゲット療法と任意の候補遺伝子獲得抵抗性を通じて抵抗のドライバーを調査する:) RT-PCR および b) ウエスタン ブロット分析。
<ol><li>
リアルタイム RT-PCR
	<ol>
<li>細胞を用いた酸ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム混合物からの総 RNA の抽出 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>ランダム hexamer プライマーを使用して逆のトランスクリプション (RT) 反応を行い、熱 cycler を次のように設定: 46 ° C、20 分で RT、RT 不活化 1 分 95 ° C で 5 分間 25 ° C でプライミングします。</li>
		<li>20 μ L 反応の総 RNA の使用 400 ng。反応混合物を次のようにサンプルの準備: 7 μ L RNase フリー H2O、2 μ L cDNA (10 ng/μ L)、ターゲット固有の蛍光標識プローブ、x 1 μ 20 と 10 μ L 2 x ミックス含むバッファー、dNTPs、DNA ポリメラーゼ (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>各ウェル プレートに反応混合物の 20 μ L を追加し、次のプログラムを実行: 95 ° C、10 分 (1 サイクル) で、2 分の 50 ° C でステージを開催40 サイクル 95 ° c、15 秒と 1 分の 60 ° c。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部のしみ
	<ol>
<li>0.05%/トリプシン EDTA 溶液 2 mL を追加し、動作するようにトリプシンの 2 〜 3 分を許可するには、細胞懸濁液を回復します。</li>
		<li>中型含む 10% 牛胎児血清トリプシン (例えば、各 1 mL のトリプシンのための媒体の 2 mL) を中和し、1,200 x g で 5 分間遠心冷 1x PBS で破棄上清および洗浄細胞の 2 つのボリュームを追加します。</li>
		<li>5 分 1,200 × g で遠心分離し、上澄みを廃棄します。換散バッファーと細胞ペレットを再懸濁します、4 ° C、30 分でロッカーで孵化させなさい。<ol>
<li>換散バッファーの量によって異なります (例えば1 x 10 の6セルを 100 μ L); 細胞数毎回新鮮な換散バッファーを準備することを確認します。換散バッファーの準備 (氷の上を残す) の 1 ml: 975 μ M を使用して-10 μ L 100 μ M PMSF 阻害剤、15 μ L ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤は、哺乳類の溶解バッファーあたり。</li>
		</ol>
</li>
		<li>4 ° C 15 分で 13,000 × g で遠心沈降法による細胞のライセート上清タンパク質を回復します。</li>
		<li>BCA タンパク質アッセイを用いたタンパク質の濃度を決定します。</li>
		<li>蛋白質のサンプル (蛋白質の少なくとも 20-30 μ g) と 3 分間 100 ° C で熱に塩化物イオン サンプル バッファー x 4 を追加します。</li>
		<li>プレキャスト 4 20% ゲルを使用し、塩化物イオンとタンパク質溶液の 20-30 μ g、タンパク質標準サンプルごとの 5-10 μ L を読み込みます。</li>
		<li>トリス/GLICYNE/SDS 1 x バッファーと西部のしみリングを記入し、(時間停止染料はゲル、それ以外の場合、いくつかの追加分の実行の終わりに達したことを確認する) とき 110 V 30-60 分のためのゲルを実行</li>
		<li>PVDF 膜に蛋白質を転送する Electroblot (材料表参照) 半乾燥システムを使用しています。</li>
		<li>1 時間室温でシェーカーで適切なタンパク質溶液 (ミルク/BSA 5%) に浸漬して膜をブロックします。</li>
		<li>アンチ IQGAP1 一次抗体と 1: 400 ソリューションは、5% ミルク ソリューション (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>一晩冷蔵室のシェーカーの一次抗体溶液中膜を配置します。</li>
		<li>次の日、抗体溶液を破棄し、T TBS 1 x 溶液中浸漬 (1 T TBS x: 1 x Tween20 で Tris バッファーは生理食塩水を追加 0.1%) は 7 分間室温でシェーカーで。</li>
		<li>ソリューションと置換 x T-tbs 系 1 を破棄します。3 回繰り返します。</li>
		<li>標準的な西部の抗体を追加することによってしみの検出 1: 10,000 のセカンダリ マウス抗体溶液を作成 (材料の表を参照してください); シェーカーに膜を置くと2 時間室温に置いたまま。</li>
		<li>抗体溶液を破棄し、7 分間室温でシェーカーで T TBS 1 x 溶液中浸漬します。</li>
		<li>ソリューションと置換 x T-tbs 系 1 を破棄します。3 回繰り返します。</li>
		<li>化学発光液 5 分間膜を浸漬し、化学発光のイメージャの膜をイメージします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 候補 R 遺伝子ノックダウンによる標的治療阻害剤感受性の復元
<ol><li>
セル準備
	<ol>
<li>Trypsinization 単一細胞懸濁液を準備します。細胞当日 transfection を実行します。<ol>
<li>洗って NCI N87 PBS のセルし、5 ~ 10 分追加 2 RPMI 培地含む 10% 牛胎児血清トリプシン (例えば、各 1 mL のトリプシンのための媒体の 2 mL) を中和する量の 0.05% トリプシン/EDTA 溶液で 37 ° C で孵化させなさい。</li>
			<li>トリパン ブルー染色を用いた検定とセルをカウントします。各条件の T25 cm2フラスコにシード 2.5 x 105セル (60% 合流)。 注: 播種のための細胞の適切な数は、細胞倍加時間と実験の期間によって決定されます。目的は、ターゲット遺伝子ノックダウン実験の全体の持続期間のために達成するためにです。9 T25 cm2フラスコは、トランスフェクション条件とクローン形成法 (コントロール、負トランスフェクション コントロール、遺伝子ターゲット transfection のため 3 フラスコ 3 フラスコ 3 フラスコ) に最適です。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トランスフェクション
	<ol>
<li>遺伝子ターゲットを準備し、次のように各 T25 cm2フラスコのコントロール トランスフェクション ミックスを負します。<ol>
<li>各標的遺伝子の siRNA オリゴヌクレオチドまたは最小限不可欠なトランスフェクション媒体 (比率 1:55; 参照テーブルの材料) のネガティブ コントロール siRNA オリゴヌクレオチドの 12.5 μ L を希釈します。</li>
			<li>カチオン性リポソームのトランスフェクション試薬 (siRNA オリゴヌクレオチドの標的遺伝子と 1:1 の比率; 参照材料テーブル) を追加します。20 分間室温でインキュベートします。 注: トランスフェクション ミックスの容量は 700 μ L です。</li>
			<li>各 T25 cm2フラスコにトランスフェクション ミックス 700 μ L を追加します。1 〜 3 日の 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>RT-PCR および西部のしみの分析による遺伝子ノックダウンを確認します。推定 R 遺伝子ノック ダウン (繰り返し手順 1.5) コロニー形成実験を通じてターゲットを絞った治療エージェントと感度復原の影響を再確認してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

パーソナライズし、対象と治療法は、成長している熱意を誘発しているが、これらのいわゆる 'スマート' 療法として従来の化学療法薬、すなわち、薬物抵抗性の急速かつ予測不可能な獲得同じ主要なハードルに直面します。標的療法の結果を改善するためにそれらを引き起こすメカニズムの理解を通じて薬剤耐性問題を解決されなければなりません。ここでは、私たちは癌細胞ラインのモデルで標的治療薬抵抗性獲得のメカニズム解明のため広くアクセス可能な培養方法論を発表しました。
対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代は最も重要で使用、細胞間と薬剤感受性の異なる程度固有の遺伝的多様性により、このプロトコルの手順を標準化することは困難です。これらの理由から、耐性のサブクローンを取得に必要な時間が異なる場合があります。抗癌剤分子への慢性露出は通常強力な腫瘍増殖抑制を発生します。ただし、可変連続薬曝露 (8-12 ヶ月) が経過すると、細胞は対照細胞と同様の率と成長を再開します。
さらに、その遺伝子発現データを遺伝子関連ターゲット療...

分子細胞生物学の重要な発見をフォロー アップして、新規に合成された抗がん剤の分子の数は、選択的に腫瘍のタイプの広い配列で発癌性シグナル伝達経路をターゲットに開発されています。特に、腫瘍のユニークなプロパティを持つ対象の治療薬の 2 つのカテゴリ、すなわち合成化合物、遺伝子組換え抗体の臨床成功とで劇的に変化した癌治療を達成しているが知られています。ここ数十年1,2,3。
それにもかかわらず、その印象的な初期応答にもかかわらず治療に、癌患者の大半はすべての標的治療薬、モノクローナル抗体とキナーゼ阻害剤への薬剤耐性を開発しました。結果として、薬剤耐性、古典的な抗がん薬4の主要なハードルはまだ新たな標的治療5,6にとって大きな挑戦であります。
標的治療への抵抗は本質的なものがあります (つまり、プライマリ) または (すなわち、セカンダリ) 取得します。本質的な抵抗では、薬物治療7への応答の期間後に発生する二次抵抗に対しの療法への応答のde novoの欠如について説明します。後者は原始的な腫瘍の大部分の内で腫瘍細胞の小さなコホートの発生によって引き起こされるまたは遠位の不可解な解剖学的ニッチに囲まれた、90% までを展示抵抗 1 つまたは複数のターゲット治療薬。主に目標とされた療法に抵抗性の発現の基礎となる分子機構に起因ターゲット遺伝子変異とその理解はまだはるかに完全な8その他生存シグナル伝達経路の冗長活性化。
この作品は、体外サイレンシングの説明への薬剤耐性細胞のサブクローンの世代から始まって、ターゲット治療薬抵抗性獲得のメカニズムを調査するため時間と費用有効方法を提案阻害剤のテストと作業仮説を検証するために使用する重要なツールに感度を復元するために使用する手順。特に、我々 のアプローチは、胃癌トラスツズマブ (例えばハーセプチン)、HER2 タンパク質9の細胞外ドメインを対象とするヒト化モノクローナル抗体に抵抗機構の調査に使用されました。化学療法 + トラスツズマブは HER2 陽性転移性乳癌に対する標準のファーストライン治療として広く受け入れられます。治療が両方生体外で有意な活性を持つその抗 HER2 を示す最近の臨床研究のおかげで、生体内でHER2 陽性胃癌モデル10,11分子薬 HER2 をターゲットにされています。広範囲の臨床試験で検討した、いくつかはまだ進行中、胃食道がん12,13,14,15症例。
これらの研究は、トラスツズマブに16、他の標的治療阻害剤の観察されるものと同様に抵抗を発生している患者数は上昇を強調しています。特に、トラスツズマブの応答率は 47% で、トラスツズマブ + 化学療法を受けている患者の全生存中央値はわずか 2.7 ヶ月化学療法単独で17の患者よりも長くなります。これは、プライマリ トラスツズマブ抵抗は普及しているが、セカンダリのトラスツズマブ抵抗は避けられない示唆されました。このため、緊急にこの腫瘍18内腫瘍の遺伝の不均質を与えさらに問題は、胃癌 HER2 標的治療抵抗性の原因とメカニズムを解明する必要があります。
さらに、胃癌トラスツズマブへの抵抗のメカニズムはこの状態の信頼性の高い前臨床モデル代表の取得の難しさのため、部分的に説明するは困難証明しました。大島らは、トラスツズマブ19治療後小さな残留腹膜転移の繰り返された文化から成るトラスツズマブ抵抗性胃癌細胞株の生体内での選択法を報告しました。ただし、筐体の特定動物取り扱い専門、動物倫理委員会の承認の必要性は、時間とコストのかかるメソッドにすることに貢献しました。この作品で述べる方法は簡単で、広く適用できると異なる腫瘍 histotypes20の他の治療薬に抵抗性のメカニズム解明のために簡単に拡張可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol Reagentは、高品質なトータルRNAを単離したり、さまざまな生体サンプルからRNA、DNA、タンパク質を同時に単離したりするための試薬です</td></tr><tr><td>ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>iScript cDNA合成キットは、リアルタイムqPCRを用いた遺伝子発現解析用の高感度で使いやすいファーストストランドcDNA合成キットです。</td></tr><tr><td>TaqMan 遺伝子発現アッセイ</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays は、一対の非標識 PCR プライマーと TaqMan プローブで構成されており、5' 末端に Applied Biosystems FAM または VIC 色素ラベル、3' 末端にマイナーグルーブバインダー (MGB) と非蛍光クエンチャー (NFQ)</td></tr> が塗布されています。<tr><td>M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Thermo Scientific M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬は、培養哺乳類細胞から高効率の全可溶性タンパク質抽出を提供するように設計されています。</td></tr><tr><td>Halt プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) は、細胞および組織溶解物に対する完全なタンパク質サンプル保護を備えた単一の溶液の利便性を提供します。</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kitは、タンパク質標準と比較して(A562nm)総タンパク質濃度を測定するための2成分、高精度、界面活性剤対応アッセイ試薬セットです。</td></tr><tr><td>4x Laemmli サンプルバッファー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610747</td><td>SDS PAGE用のサンプル調製には、4x Laemmli サンプルバッファーを使用します。サンプルの還元には、サンプルと混合する前に、2-メルカプトエタノールなどの還元剤をバッファーに添加してください。</td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX プレキャストプロテインゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>長寿命 TGX (Tris-Glycine eXtended) ゲルは、新しい配合で、標準的な変性タンパク質の分離と天然の電気泳動の両方に使用できます。</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC ブロッティングスタンダード</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained スタンダードは、デュアルカラー、オールブルー、カレイドスコープ、デュアル Xtra の各フォーマットでご利用いただけます。4つとも同じゲル移動パターンを持ち、3つの高強度リファレンスバンド(25、50、75 kD)があります。</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glycine/SDS は、SDS-PAGE によるタンパク質サンプルの分離用のプレミックスランニングバッファーです。</td></tr><tr><td>トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパック</td><td>バイオ・ラッド</td>の<td>1704156</td><td>トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパックは、トランスブロットターボトランスファーシステムを使用してミニゲルからタンパク質を迅速かつ効率的に転写します。各真空シールされたすぐに使用できるトランスファーパックには、2つのバッファー飽和イオンリザーバースタックとプレウェットPVDFメンブレンが含まれています。</td></tr><tr><td>Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>StrepTactin-Horseradish ペルオキシダーゼ (HRP) コンジュゲートは、Precision Plus Protein Unstained Protein Standards または Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on Western Blots の化学発光または比色検出用です。</td></tr><tr><td>Immun-Star WesternC solution</td><td>バイオ・ラッド</td><td>5572</td><td>Immun-Star WesternC ソリューションは、タンパク質検出の方法であり、フェムトグラムの中間量のタンパク質を検出します。</td></tr><tr><td>ユニバーサルネガティブコントロール</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td>ネガティブコントロールsiRNAは、マウス、ラット、またはヒトの遺伝子配列と有意な配列類似性はありません。このコントロールは、細胞ベースのスクリーニングでも試験されており、細胞の増殖、生存率、または形態に有意な影響を与えないことが証明されています。</td></tr><tr><td>Opti-MEM Glutamax Medium</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM培地は、改良されたミニマルエッセンシャル培地(MEM)で、成長速度や形態を変えることなく、ウシ胎児血清の補給を少なくとも50%削減することができます。</td></tr><tr><td>サイレンサーセレクトプレデザイン&検証済みのsiRNA</td><td>Ambion 4390824</td><td></td><td>RNA干渉(RNAi)は、幅広い細胞タイプのタンパク質機能を研究するための遺伝子発現を効果的にノックダウンするための最良の方法です。</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬は、siRNA 導入のための高度で効率的なソリューションを提供します。一般的な細胞タイプ、幹細胞、初代細胞、従来はトランスフェクションが難しかった細胞タイプなど、さまざまな細胞株でこれほど簡単で効率的なsiRNA導入を提供できるsiRNA特異的トランスフェクション試薬は他にありません。</td></tr><tr><td>マウス抗IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>使用濃度: 1:400 5% 乳溶液中</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG-HRP: sc-2005</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-2005</td><td>使用濃度: 1:10000 5% 乳溶液</td></tr><tr><td>中 PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td> これは、RT-PCR MJ Research MJ Research 用の<td>セリンプロテアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td> の阻害剤です<td>PTC-200サーマルサイクラーは</td><td>、温度の均一性と最大3°Cの速度のランプを可能にします。C/秒このプロトコルは、他のサーマルサイクラーでも行うことができます</td></tr><tr><td>リアルタイムRT-PCR装置</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCRシステム</td><td>これは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬を使用して、比較CTアッセイタイプを使用して相対定量を提供する5色のプラットフォームです。プロトコルは、他のサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>マイクロボリューム分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>少量のサンプルを使用して、正確で高速な酸性核測定を提供します</td></tr><tr><td>ブロッティングシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo システム</td><td>数分でsemy-dry転送を行います</td></tr><tr><td>画像取得システムとゲルドキュメンテーション</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemidoc画像化学</td><td>発光検出に使いやすい</td>システム</tr></tbody></table>

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

過去 20 年間には、細胞毒性薬から医療がんの標的治療へのシフトを見てきました。標的治療薬より印象的な臨床効果と従来の治療法よりも最小化された副作用に示されてが、薬剤耐性の利点の主な制限となっています。臨地実習における標的薬抵抗性のいくつかの/体外・体内の前臨床モデルは、主に 2 つの戦略を使用して開発されている: 獲得抵抗性とii) の in vitro 遺伝子型をモデル化するための i) 遺伝子操作/生体内の抵抗性モデルの選択。本研究では薬剤耐性細胞のサブクローンの世代からの説明から始まって、ターゲット治療薬抵抗性獲得に責任があるメカニズムを調査するため統一的枠組を提案します。阻害剤に感度を復元するために使用するプロシージャを黙らせます。この単純な時間と費用の有効アプローチは広く適用できる、異なる腫瘍 histotypes の他のターゲット治療薬に抵抗性の機構を調査するために簡単に拡張できます。

図 1では、実験の手順のフレームワークについて説明します。HER2 とトラスツズマブ感受性の高レベルを表現する 3 胃癌細胞株 (IC50 &lt; 薬物、図 2 a、左のグラフのピーク血漿中濃度) ターゲットを絞った治療剤を含む培養液中で育った。用量には、トラスツズマブ (10 μ G/ml) のピーク血漿中濃度は開始用量として設定され、徐々 に 400 μ g/mL 8-12 ヶ月の期間にわたって増加したより 10 倍低い。その後、IC50値トラスツズマブ (図 2 a、右のグラフ) の最高血漿中濃度より低いと安定した抵抗の表現型によって特徴付けられる 3 つのサブクローンを得た。特に、最も耐 subclone、HR NCI N87 28.57 (図 2 b) RR IC50</...

これは癌管理の非常に満たされていない医療ニーズである標的治療薬抵抗性獲得のメカニズムを調査時間および費用効果の in vitroプロトコルです。

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

この前臨床プラットフォームの全体的な目標は、標的療法に対する獲得耐性を促進するメカニズムを特定し、特徴付けるための標準的な手順を提供することです。この方法は、腫瘍学におけるゲノムドライブの実装に役立ち、特に腫瘍の不均一性と標的療法に対する獲得耐性に関与する複数のメカニズムに関する重要な問題に対処します。この技術の主な利点は、標的療法に対する耐性メカニズムのin-vitro調査を可能にする時間と費用対効果の高いアプローチです。この技術の意味合いは、新たな標的療法にとって肺抵抗性が依然として困難であるため、がん治療にまで及びます。この方法は、標的療法の耐性に関与するメカニズムについての洞察を提供することができますが、従来の化学療法剤の有効性を研究するためにも使用できます。一般に、この方法を使用するオペレーターは、薬剤耐性サブクローンの生成によろめきますが、これは標準化が最も難しいステップです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、HER陽性胃がん細胞株におけるトラスツズマブに対する獲得耐性メカニズムを特徴付けたときでした。この手法の視覚的なデモンストレーションは、遺伝子ノックダウンによる感度の回復など、in vitro薬剤耐性モデルの生成と検証にはいくつかの技術が必要であるため、非常に重要です。この手順を開始するには、NCI N87細胞を25平方センチメートルの培養フラスコに播種します。各フラスコの培地にトラスツズマブ1ミリリットルあたり10マイクログラムを加えます。細胞が成長を再開するまで、この開始用量に細胞をさらします。.約2週間で細胞増殖が再開した後、細胞をトラスツズマブの1ミリリットルあたり100マイクログラムの濃度用量に曝露します。.トラスツズマブの濃度を徐々に増加させ続け、各曝露前に細胞が増殖を再開するまで、ミリリットルあたり400マイクログラムの濃度に達するまで待ちます。細胞株は、異なる薬物に対して異なる感受性を示す場合があります。この問題の1つの解決策は、血漿ピーク濃度の約10倍の用量から始めて、細胞が成長し続けるまで、細胞を徐々に増加する薬物用量にさらすことです。次に、細胞を24枚のマルチウェル培養プレートに播種します。播種した細胞を、100マイクログラム/ミリリットルから400マイクログラム/ミリリットルに増加させる標的療法阻害剤濃度に曝露します。CO2インキュベーターで摂氏37度のインキュベーターで15日間インキュベートします。この後、培地を取り出し、10ミリリットルのPBS-1Xで細胞をすすぎます。PBS-1Xを取り外し、2〜3ミリリットルの固定液を追加します。20分後、固定溶液を取り出し、各ウェルに0.5%クリスタルバイオレット溶液を2ミリリットル加えます。室温で2時間インキュベートします。次に、ピペットを使用してクリスタルバイオレット溶液を慎重に吸引します。プレートを水道水に浸して、残っている残留物を洗い流します。室温で最大2日間風乾します。次に、4倍の倍率で倒立顕微鏡を使用して、50を超える細胞を含むコロニーをカウントします。テキストプロトコルに概説されているように、相対抵抗IC50比を計算します。まず、テキストプロトコルに概説されているように、トリプシン処理により単一細胞懸濁液を調製します。血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して、細胞をカウントします。次に、各条件について、10〜5個の細胞を2.5倍に播種します。次に、各遺伝子標的siRNAオリゴヌクレオチドまたはネガティブコントロールsiRNAオリゴヌクレオチドをMinimal Essential Transfection Mediumで12.5マイクロリットル希釈します。カチオン性リポソームトランスフェクション試薬をオリゴヌクレオチドと1:1の比率で添加します。室温で20分間インキュベートします。この後、700マイクロリットルのトランスフェクションミックスを各T-25フラスコに加えます。摂氏37度で1〜3日間インキュベートします。RT-PCRおよびウェスタンブロット解析を使用して、遺伝子ノックダウンを確認します。次に、細胞を24枚のマルチウェル培養プレートに播種します。細胞を100マイクログラム/ミリリットルから400マイクログラム/ミリリットルに増量する標的療法阻害剤に曝露します。遺伝子ノックダウンの有効性を得るためには、siRNAオリゴヌクレオチドが標的発現の減少に特異的でなければなりません。この目的のためには、同じ標的遺伝子であったsiRNAの測定値を設計したツールが有用である。CO2インキュベーターで摂氏37度のインキュベーターで15日間インキュベートします。培地を取り出し、10ミリリットルのPBS-1Xで細胞をすすぎます。PBSを取り外した後、2〜3ミリリットルの固定液を追加します。次に、固定液を取り出し、0.5%クリスタルバイオレット溶液を追加します。室温で2時間インキュベートします。ピペットを使用して、クリスタルバイオレット溶液を慎重に吸引します。次に、プレートを水道水に浸します。室温で最大2日間風乾します。この後、倒立顕微鏡を4倍の倍率で使用して、50を超える細胞を含むコロニーをカウントします。この研究では、HER2を高レベルで発現し、トラスツズマブに感受性のある3つの胃がん細胞株を、標的治療薬を含む培地で増殖させます。このことから、安定な耐性表現型を特徴とする3つのサブクローンが得られる。サブクローンの中で、HR NCI N87は最も耐性が高いと見られ、相対抵抗IC50は28.57に達します。タンパク質および遺伝子発現の解析は、遺伝子IQGAP1がHR NCI N87サブラインの耐性表現型において極めて重要な役割を果たすという仮説を支持しています。ここに示すように、IQGAP1タンパク質レベルは、耐性サブクローンの方が親細胞の5倍です。また、IQGAP1遺伝子発現は、HR NCI N87サブラインでは元のサブクローンよりも2.5倍です。次に、IQGAP1遺伝子サイレンシングを実施して、トラスツズマブ耐性表現型の発現におけるその役割を評価します。クローン作法は、IQGAPの重要性の仮説をさらに裏付けています。ここで見られるように、遺伝子サイレンシングはトラスツズマブに対する細胞の感受性を回復させ、IC50値を1ミリリットルあたり7マイクログラムに低下させます。この手順について私が考えることは、薬剤耐性細胞のサブクローンを得ることは一般的に容易ではないことを心に留めておくことが重要です。また、この方法には潜在的な故障リスクがあります。この手順により、標的療法に対する獲得耐性を駆動する異なるメカニズムを特徴とするクローンのいくつかの細胞を得ることが可能です。標的療法耐性のin-vitroモデリングのための標準的な手順の開発により、腫瘍学の研究者は、最新世代の治療法に対する最大の批判である薬剤耐性を克服するための新規薬剤対応標的を調査できるようになるはずです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

前または臨床的発症次 -   - 標的治療に対する薬剤耐性は広範囲に及び抵抗のメカニズムを同定することが必要である代替臨床管理戦略を導くために重要です。ここでは、これらのメカニズムの発見を促進するためにシークエンシングを用いたin vitro での薬剤耐性株のカップルの導出にプロトコルを提示します。...

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1...

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

遺伝子機能の研究に興味の遺伝子を過剰発現安定細胞株を確立することは、株それらを介してレトロ ウイルス感染後安定したトランスフェクション ピッキング単一クローンによって行うことができます。この方法で生成される DR3 HT29 細胞が死受容体 3 (DR3) antimitotics...

抗有糸分裂治療に対するアポトーシス応答を評価するために DR3 を過剰発現細胞株の確立

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。...

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

ここで提示される、大腸HT29細胞由来の確立された癌幹細胞様細胞を維持する過剰発現ドライバ遺伝子を発見するためのプロトコルである。RNAAseqは、標的腫瘍細胞の生存に関与する潜在的なメカニズムを解明するための遺伝子発現網を調査およびスクリーニングするために実施した。...

HT29由来癌幹細胞様腫瘍球におけるドライバ遺伝子の発見

このプロトコールは、NSCLC患者由来オルガノイドモデルにおける標的シグナル伝達阻害剤に対する薬物感受性の標準化された評価を記載している。...

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

学ぶ標的治療薬剤耐性のメカニズムをin vitroで特定・特性化する手法。薬剤耐性サブクローンの樹立と遺伝子ノックダウンによる感受性回復を用い、がん治療における耐性克服戦略の開発に貢献します。

標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

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