標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

この前臨床プラットフォームの全体的な目標は、標的療法に対する獲得耐性を促進するメカニズムを特定し、特徴付けるための標準的な手順を提供することです。この方法は、腫瘍学におけるゲノムドライブの実装に役立ち、特に腫瘍の不均一性と標的療法に対する獲得耐性に関与する複数のメカニズムに関する重要な問題に対処します。この技術の主な利点は、標的療法に対する耐性メカニズムのin-vitro調査を可能にする時間と費用対効果の高いアプローチです。

この技術の意味合いは、新たな標的療法にとって肺抵抗性が依然として困難であるため、がん治療にまで及びます。この方法は、標的療法の耐性に関与するメカニズムについての洞察を提供することができますが、従来の化学療法剤の有効性を研究するためにも使用できます。一般に、この方法を使用するオペレーターは、薬剤耐性サブクローンの生成によろめきますが、これは標準化が最も難しいステップです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、HER陽性胃がん細胞株におけるトラスツズマブに対する獲得耐性メカニズムを特徴付けたときでした。この手法の視覚的なデモンストレーションは、遺伝子ノックダウンによる感度の回復など、in vitro薬剤耐性モデルの生成と検証にはいくつかの技術が必要であるため、非常に重要です。この手順を開始するには、NCI N87細胞を25平方センチメートルの培養フラスコに播種します。

各フラスコの培地にトラスツズマブ1ミリリットルあたり10マイクログラムを加えます。細胞が成長を再開するまで、この開始用量に細胞をさらします。.約2週間で細胞増殖が再開した後、細胞をトラスツズマブの1ミリリットルあたり100マイクログラムの濃度用量に曝露します。.

トラスツズマブの濃度を徐々に増加させ続け、各曝露前に細胞が増殖を再開するまで、ミリリットルあたり400マイクログラムの濃度に達するまで待ちます。細胞株は、異なる薬物に対して異なる感受性を示す場合があります。この問題の1つの解決策は、血漿ピーク濃度の約10倍の用量から始めて、細胞が成長し続けるまで、細胞を徐々に増加する薬物用量にさらすことです。

次に、細胞を24枚のマルチウェル培養プレートに播種します。播種した細胞を、100マイクログラム/ミリリットルから400マイクログラム/ミリリットルに増加させる標的療法阻害剤濃度に曝露します。CO2インキュベーターで摂氏37度のインキュベーターで15日間インキュベートします。

この後、培地を取り出し、10ミリリットルのPBS-1Xで細胞をすすぎます。PBS-1Xを取り外し、2〜3ミリリットルの固定液を追加します。20分後、固定溶液を取り出し、各ウェルに0.5%クリスタルバイオレット溶液を2ミリリットル加えます。

室温で2時間インキュベートします。次に、ピペットを使用してクリスタルバイオレット溶液を慎重に吸引します。プレートを水道水に浸して、残っている残留物を洗い流します。

室温で最大2日間風乾します。次に、4倍の倍率で倒立顕微鏡を使用して、50を超える細胞を含むコロニーをカウントします。テキストプロトコルに概説されているように、相対抵抗IC50比を計算します。

まず、テキストプロトコルに概説されているように、トリプシン処理により単一細胞懸濁液を調製します。血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して、細胞をカウントします。次に、各条件について、10〜5個の細胞を2.5倍に播種します。

次に、各遺伝子標的siRNAオリゴヌクレオチドまたはネガティブコントロールsiRNAオリゴヌクレオチドをMinimal Essential Transfection Mediumで12.5マイクロリットル希釈します。カチオン性リポソームトランスフェクション試薬をオリゴヌクレオチドと1:1の比率で添加します。室温で20分間インキュベートします。

この後、700マイクロリットルのトランスフェクションミックスを各T-25フラスコに加えます。摂氏37度で1〜3日間インキュベートします。RT-PCRおよびウェスタンブロット解析を使用して、遺伝子ノックダウンを確認します。

次に、細胞を24枚のマルチウェル培養プレートに播種します。細胞を100マイクログラム/ミリリットルから400マイクログラム/ミリリットルに増量する標的療法阻害剤に曝露します。遺伝子ノックダウンの有効性を得るためには、siRNAオリゴヌクレオチドが標的発現の減少に特異的でなければなりません。

この目的のためには、同じ標的遺伝子であったsiRNAの測定値を設計したツールが有用である。CO2インキュベーターで摂氏37度のインキュベーターで15日間インキュベートします。培地を取り出し、10ミリリットルのPBS-1Xで細胞をすすぎます。

PBSを取り外した後、2〜3ミリリットルの固定液を追加します。次に、固定液を取り出し、0.5%クリスタルバイオレット溶液を追加します。室温で2時間インキュベートします。

ピペットを使用して、クリスタルバイオレット溶液を慎重に吸引します。次に、プレートを水道水に浸します。室温で最大2日間風乾します。

この後、倒立顕微鏡を4倍の倍率で使用して、50を超える細胞を含むコロニーをカウントします。この研究では、HER2を高レベルで発現し、トラスツズマブに感受性のある3つの胃がん細胞株を、標的治療薬を含む培地で増殖させます。このことから、安定な耐性表現型を特徴とする3つのサブクローンが得られる。

サブクローンの中で、HR NCI N87は最も耐性が高いと見られ、相対抵抗IC50は28.57に達します。タンパク質および遺伝子発現の解析は、遺伝子IQGAP1がHR NCI N87サブラインの耐性表現型において極めて重要な役割を果たすという仮説を支持しています。ここに示すように、IQGAP1タンパク質レベルは、耐性サブクローンの方が親細胞の5倍です。

また、IQGAP1遺伝子発現は、HR NCI N87サブラインでは元のサブクローンよりも2.5倍です。次に、IQGAP1遺伝子サイレンシングを実施して、トラスツズマブ耐性表現型の発現におけるその役割を評価します。クローン作法は、IQGAPの重要性の仮説をさらに裏付けています。

ここで見られるように、遺伝子サイレンシングはトラスツズマブに対する細胞の感受性を回復させ、IC50値を1ミリリットルあたり7マイクログラムに低下させます。この手順について私が考えることは、薬剤耐性細胞のサブクローンを得ることは一般的に容易ではないことを心に留めておくことが重要です。また、この方法には潜在的な故障リスクがあります。

この手順により、標的療法に対する獲得耐性を駆動する異なるメカニズムを特徴とするクローンのいくつかの細胞を得ることが可能です。標的療法耐性のin-vitroモデリングのための標準的な手順の開発により、腫瘍学の研究者は、最新世代の治療法に対する最大の批判である薬剤耐性を克服するための新規薬剤対応標的を調査できるようになるはずです。