Name: 食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: 学ぶ 食品由来病原体Vibrio parahaemolyticusを検出する電気化学的DNAバイオセンサーの開発手法。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子修飾電極を用いて感度を向上させ、食品安全性評価に応用可能な迅速検出技術を確立する。

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著者は、マレーシア ・ プトラのサポートを確認したいと思います。

注: 使用するすべての化学・生化学的試薬分析グレードのはず、さらに精製することがなく使用します。滅菌の脱イオン水を使用してのすべてのソリューションを準備します。オートクレーブ滅菌前にすべてのガラス製品。
注意: コントロール (ヒューム フード、グローブ ボックス) をエンジニア リングの使用など研究室の活動を実行するときすべての適切な安全対策を使用してくださいと個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先靴)。
1. 作製と PLA によって金ナノ粒子を使用して修飾した電極のキャラクタリゼーション
<ol><li>
PLA によって金ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
	<ol>
<li>すばやく沸騰水性塩化金酸溶液 (1 mM) の 100 mL にクエン酸ナトリウム溶液 (38.8 mM) 10 mL を追加し、周囲温度まで冷却します。黄色、黒への変更として開始し、最終的に暗いルビーとして終了する調製した金ナノ粒子溶液の色の変化を観察します。</li>
		<li>溶融プロセスのステンレス鋼の金型の PLA ペレットを置き、それらを押す手順で 10 分以下の 190 ° C の温度で予熱: PLA シート準備の一部として 1 分 2.2 MPa の圧力の下でそれらを置きます。PLA シートは、約 3 時間冷却した後使用できるようになります。</li>
		<li>活発にかき混ぜながら、室温でクロロホルム 5 mL に PLA シートの 0.68 mg 溶解します。事前に準備された金ナノ粒子溶液 10 mL で溶存の PLA を混合し、均一室温で攪拌します。均質な混合物は PLA によって金ナノ粒子と呼ばれますことができます、EDX を用いた紫外可視、x 線回折、電子顕微鏡、FESEM 特徴付けられます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
変更されたスクリーン印刷されたカーボン電極の作製と評価 注: この研究で使用される空間構成 3 電極システム: 銀/塩化銀参照電極、カーボン電極、対向電極。<ol>
<li>すぐに空間とし、空気に PLA によって金ナノ粒子の均質なソリューションのピペット 25 μ L は 24 h 使用する前にそれを乾燥します。</li>
		<li>、電極の電気化学的特性空間/PLA-, カリウム鉄シアン化物の (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) 活性表面積、電気化学インピー ダンス分光法、再現性を測定するには再現性、および安定性30。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 電気化学的 DNA バイオ センサーの開発
<ol><li>
プローブの準備 注: 一本鎖 Dna プローブと相補的な DNA のシーケンスは、国立生物工学情報 (NCBI) のデータベース センターからの情報に基づいて選ばれました。<ol>
<li>次のシーケンスに基づく商業所から凍結乾燥粉末として総合的なオリゴヌクレオチド (20 mer ssDNA プローブ、20 mer の相補的な DNA、20 mer 一致しない DNA、21 mer 非相補的な DNA) を購入します。 チオール ssDNA プローブ: 5 '-5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG -/3 ' 相補的な DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 1 つベースが一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3 拠点が一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 非相補的な DNA: 3 '5' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>分析に分けて滅菌テ ソリューション (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) を使用してすべてのオリゴヌクレオチド (100 μ M) の溶液を準備します。-4 ° C でこれを維持し、適切な希釈液を使用する直前。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
固定および交配の最適化 注: PLA 結果、空間/PLA-結果として示されると変更、スペースはこの研究のため使用され、ドロップ キャスト法は DNA の固定化および交配のために使用されました。<ol>
<li>まず、チオール ssDNA プローブ空間/PLA - 結果の 25 μ L を固定し、空気乾燥して、室温で 24 時間後、最後に示されます空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA として。3 つの要因を使用して固定化条件の最適化を決定する: ssDNA (0.2 から 1.4 μ M まで)、(210 分 30 からまで)、時間および温度 (25 から 75 ° C まで) の濃度。</li>
		<li>その後それ表すことができます最後にスペース/PLA-金ナノ粒子/dsDNA として交配イベントを行うスペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA の表面に相補的な DNA の 25 μ L をピペットします。(30 分 5 に至るまで) 時間と温度 (25 から 75 ° C まで) の 2 つの要因によって交配条件の最適化を決定します。</li>
		<li>固定化を浸すと 20 μ m MB 30 分ハイブリッド電極が 0.5 M ABS で洗浄することにより非具体的に吸着した DNA と過剰な MB を削除/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) とで洗浄し、脱イオン水。DPV を用いたメガバイトの削減のピーク電流を測定します。0.1 M PBS (pH 7) を使用する DPV 測定を実行インジケーターが含まれていません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
作製した DNA のバイオ センサーの特性評価
	<ol>
<li>結果、30 分の 20 μ m MB スペース/PLA を浸す、0.5 M abs/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) を洗浄し、測定前に脱イオン水で洗い流し。プローブ DNA、相補的な DNA、dna 塩基のミスマッチ、および非相補的な DNA のサンプルを含むすべての相互作用のと同様の手順に従います。</li>
		<li>電気化学的還元を測定します。 メモ: インターフェイス ソフトウェアを商業的に製造された Autolab を使用して DPV を測定しました。 MB の電気化学的還元に至る-0.5 V 0.005 V、0.05 V、変調振幅と 7.73 mVs-1 0.1 M PBS (pH 7) でのスキャン速度の潜在的なステップで 0.25 V、潜在的な公演の DPV 測定にはインジケーターが含まれていません。選択性、感度、再現性、および DNA の作製バイオ センサーの熱安定性をさらに検討しました。報告された結果は、3 つの複製で、平均値測定を発表されました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 実際のサンプルを使用して作製した DNA のバイオ センサーの検証
<ol><li>菌株の調製
	<ol>
<li>魚介類31,32の重要な汚染に基づいて細菌のサンプルを選択します。 注:ビブリオ参照株と他の 8 の細菌株 (カンピロバクターリステリア菌、サルモネラ菌、腸炎サルモネラ、クレブシエラ肺炎として性大腸菌 o157: h7、ビブリオ菌セレウス菌、) 一般的な食中毒の病原体は、本研究では電気化学的 DNA バイオ センサーの検証のため採用されました。</li>
		<li>彼らの生存率を維持、培養条件、表 1を参照してください彼らのそれぞれの寒天培地に細菌の日常的サブカルチャー 2 週間ごとを実施します。</li>
		<li>グリセリン凍結のプロセス中にそれらを損傷することができます氷結晶の形成を防ぐことによって細菌を保護すると、-80 ° c 20% (v/v) グリセロールを含む、それぞれ成長の流体培養基の細菌の緊張の長期保全を維持します。次に、それぞれの流体培養基にグリセロールで保存された細菌の細胞培養のループを接種します。細菌を復活させるために必要があるときは、それぞれの成長の時間と温度の流体培養基を孵化させなさい。</li>
		<li>希釈のシリーズから派生した微生物を列挙する拡散板法33、標準およびよく知られている方法を用いた腸炎ビブリオ細胞の量を決定します。<ol>
<li>腸炎ビブリオトリプチ醤油スープの文化 (TSB + 3 %nacl) 140 rpm 振動状態で 37 ° C で。その後、TSB + 3% の 9 mL に 1 mL の細菌培養を転送 10-1希釈倍率を取得するための食塩。</li>
		</ol>
</li>
		<li>全シリーズの最大 10-10希釈倍率を取得する 9 回この手順を繰り返します。次に、腸炎ビブリオの選択寒天培地カウント、それぞれの植民地に (10-1010-1から始まって) 各希釈倍率を 0.1 mL を広がってください。24 h の 37 ° C で培養したプレートを孵化させなさい。</li>
		<li>コロニー カウンターを使用して、個々 のコロニーをカウントし、(カウント CFU/戻量希釈倍率 ×) の背中をコロニー形成単位ミリリットル密度 (CFU mL-1) を取得する計算に。CFU mL-1吸光度に対する校正のプロットから細菌細胞懸濁液の単位 (CFUs) を形作っているコロニーの濃度を派生します。</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 法の準備
	<ol>
<li>煮沸溶解手順34次の変更されたゲノム DNA を抽出します。最初、ストリーク個々 の細菌の寒天にひずみし、スープ メディア、その相対成長の条件、条件を振って 140 rpm のインキュベーション後に接種します。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブに液の 1 mL 文化をピペットします。4830 x g とペレットを取得に 1 分間、4 ° C でこれを遠心します。ペレットの再懸濁液に約 500 μ L の滅菌の TE バッファーを使用します。98 ± 2 ° C 加熱ブロックで 10 分結果の懸濁液を保持し、すぐに細胞を溶解し、DNA をリリース 10 分-18 ° C で冷やします。</li>
		<li>4830 x g と明確なサスペンションを取得し、さらに使用するための-20 ° C で上澄みを維持に 3 分間、4 ° C でゲノム DNA を遠心します。260 の波長に紫外線吸収をもつ biophotometer 測定を使用して nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に濃度と抽出の純度を決定するにはゲノム DNA し、標準的な生化学的アッセイ35を使用しておよび 16S rRNA 遺伝子配列36によってそれらを確認するすべての系統を識別します。最後に、92 ° C 2 分でゲノム DNA を変性し、バイオ センサーへの応用の前に氷の水で急速に冷やします。</li>
		<li>さらに腸炎ビブリオの存在を確認 toxR 遺伝子を対象とする PCR を使用します。たちのプライマー (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' と 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3') を使用してこの手順を実行します。25 μ l の滅菌水 (15.5 μ L)、バッファー (5 μ L)、(1 μ、10 μ M) のプライマー、dNTP ミックス (1 μ L)、DNA テンプレート (2 μ L)、Taq DNA ポリメラーゼ (0.2 μ L, 10 x) から成る全反応量の PCR 増幅を最適化します。</li>
		<li>コンポーネントをよく混ぜ、増幅の 30 サイクル プログラムたちでターゲット シーケンスの PCR 増幅を手配します。私たちの研究では、各サイクルから成って 3 段階反応すなわち。、30 サイクルの変性 (94 ° C 1 分)、(63 ° C、1.5 分) をアニーリングをおよび拡張 (72 ° C、1.5 分)、最終的な拡張 (72 ° C, 7 分) 続いて続いて初期変性 (94 ° C、3 分)。</li>
		<li>増幅産物と 1.5% の agarose のゲルの電気泳動でそのサイズを決定します。市販ゲル ドキュメンテーション システムでゲル画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
	<li>コックル試料の調製
	<ol>
<li>新鮮なサンプルを取得します。 注: 私たちの新鮮な貝 (Anadara において) に serdang、セランゴール州、ウェット マーケットから得られ、分析用氷クーラー ボックスで研究室にすぐに持って来られます。サンプルを 2 つのグループ、すなわち処理と未処理グループ、こと、貝収穫された均一に収穫の開始から低温貯蔵にそれらを配置することまで想定して分割します。</li>
		<li>事前治療群で 20 ° C の DNA の抽出の前に 4 時間で紫外線の暴露に続いて、24 時間-20 ° C で保存して貝を扱います。 注: 凍結温度と制御に使用される紫外線暴露グループを殺すか、または少なくとも、当然のことながら蓄積腸炎ビブリオ貝の制限します。本研究では制御された条件の目的は、新鮮な貝の実際の状況を模倣する、70 ° C のより高い殺菌政権は適用されません。一方、彼らは研究室に到着するとすぐに前治療なし未処理のグループから直接サンプルを分析します。</li>
		<li>腸炎ビブリオATCC 17802 TSB でのひずみのサブカルチャー (3 %nacl)。TSB の適切な希釈液のめっきによる菌の生菌のレベルを決定する (3 %nacl) 104 CFU mL-1 腸炎ビブリオの菌を取得するためにカリフォルニア州に。各コックル蒸留水で洗うし、スクラブのシェルから組織を削除する層流のキャビネットで無菌の鉗子を使用する前に汚れの自由。</li>
		<li>コックル組織サンプル約 10 g を 90 ml の滅菌 TSB のホモジナイザーを用いた均質化 (3 %nacl) 60 s の追加 9 mL、試料の均質化サンプル スープに腸炎ビブリオの既知の量です。ネガティブ コントロールとしてハワイプ サンプルを使用します。腸炎ビブリオca で、サンプルの 0.1 mL をメッキすることによってしわサンプルにスパイクの細胞数の推定し、抽出、バイオ センサーと PCR の試金で使用されるサンプル DNA の微量遠心チューブに試料 1 mL を分注後。</li>
		<li>煮沸溶解手順36次の改良は、スパイクとハワイプ サンプルから、腸炎ビブリオのゲノム DNA を抽出します。DNA 濃度・純度バイオ光度測定を用いた UV 吸収波長 260 を最後に、決定 nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このタイプの電気化学バイオ センサーの開発に成功するためのフレームワークの重要な手順です。 (核酸またはここの DNA) の探触子に対して適切な生物的認識の要素の選択探触子; の検知層を構築するための化学的アプローチ生体材料;DNA の固定化および交配; の最適化実際のサンプルを使用して開発されたバイオ センサーの検証。
固定および交配条件の最適化は、コアの高感度電気化学的 DNA センサーの開発に成功します。この作品では、複雑な酸化還元に MB を使用しました。MB DNA の相互作用の様々 な原則がある: (i) MB カチオン ssDNA の dsDNA; リン酸バックボーン アニオン電荷との静電的相互作用(ii) MB の C (G) 塩基 dsDNA; で交互になる間に挿入成功を通じて MB インターカレーションによる(低ラベル密度 (1 つまたは 2 MB の分子 dna あたり) を生成する iii) によって共有結合ターゲット ssDNA の最後に、(iv) MB 非連結のグアニン ssDNA の基本相互作用によって。第 4 の原則としては、交差反応性が新鮮な貝、細...

近年公共および学術の議論の主要なトピック、食中毒は主に 3 のエージェントに関連付けられている: 微生物1化学2、および寄生虫3。汚染された食物は、人間、特に免疫力が弱い、高齢者、妊婦、赤ちゃん、幼児4とのそれらのより高いリスク グループの深刻な健康の結果を可能性があります。アフリカ、アジア、およびラテン アメリカの 5 歳未満の子供で毎年発生する急性下痢の以上 100 万の場合、食中毒は、世界の主要な疾患5,6と世界保健機関が確立最も重要な貢献者7として微生物。腸炎ビブリオは最も広く知られている病原性菌株の中で際立っています。通常、河口、沿岸及び海洋環境8で発見、それはグラム陰性菌では、高塩分環境でアクティブになりますし、不十分な調理、不適切または生の海洋の食べたとき深刻な人間の胃腸炎を引き起こす製品の9。さらに、何人かの人々 の既存の医療条件を作るそれら傷ビブリオ10から生じる感染症、敗血症や耳の感染症になりやすい。ヘモリジン腸炎ビブリオの病原因子が病気の発症に寄与する 2 つのタイプに分けられる: 耐熱性直接溶血毒 (TDH) tdh 遺伝子によってコード化された、TDH 関連溶血 trh 遺伝子11によってコード化されました。ビブリオの病原性マーカー (tdh と trh 遺伝子) は、環境試料ではなく臨床検体で大抵見つけられます。
腸炎ビブリオ12環境の変化に迅速に対応、条件の広い範囲の下で生き残るために能力を持っています。セル質量13と並行してその毒性が増加するにつれて、その増殖機構はその災害ポテンシャルをエスカレートします。さらに悪いことに、気候変動は、これらの細菌のセル人口成長14を加速する十分な条件を提供しています。腸炎ビブリオ高周波による、食品サプライ チェーン、貿易とそれらの製品は、膨大な量の15,の16の場所からは魚介類の生産で特に監視する必要世界。現在細菌が識別され、隔離された生化学的なテスト、濃縮培地17、酵素免疫吸着などの方法の範囲を使用してアッセイ (ELISA)18、パルス フィールド電気泳動 (PFGE)19、ラテックス凝集反応、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) テスト20。これらのメソッドは、有資格者、洗練された楽器と汚染に関する情報をすぐに提供していない骨の折れるテクニックに通常必要です。これは深刻な有害汚染物と敷地内のアプリケーションを速やかに検出の可能性を制限します。迅速な検出ツールのまま未解決の挑戦です。
バイオセンシング、食品由来の病原体の検出のための有望なオプションとして浮上して、時間を節約、コスト効果の高い、実用的なおよびリアルタイムの分析法21,22,23,24 を提供していますので.ただし、試料及びバイオ センサーを用いた標準液で検体検出の多くの肯定的な結果をされているが、まだある水溶液または有機抽出物25試料への応用研究の欠如。最近では、直接及び間接のデオキシリボ核酸 (DNA) の検出を用いた電気化学バイオ センサーの交配イベント26を介して相補的なターゲットの特異的検出のための科学者の間で注目を受けた,27,28,29. これらのユニークなアプローチは酵素を用いたバイオ センサー、小型化と実用化のための有望な技術をご提供と比較して安定しています。研究の対象は、高選択性、感度、交配時の DNA 配列の特異性に基づく実用性と腸炎ビブリオ検出することができます高速ツールを構築することですここで報告しました。識別方法は、交配インジケーター、メチレン ブルー (MB) の存在下でのポリ酸安定化金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子)30スクリーン印刷された炭素電極 (SPCEs) の組み合わせを含みます。開発の検出構成の可能性はさらに検討細菌 dna のライセートと新鮮なしわを使用します。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>メルク</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>ジアミノエタン 四酢酸</td><td>プロメガ</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>塩化金 (III) 三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルク</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>一塩基性リン酸ナトリウム、一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(乳酸)樹脂、商用グレード 4042D</td><td>ネイチャーワークス</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>R&M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二水素カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>キサシアノ鉄酸カリウムIII</td><td>R&M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム 無水塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>デュアルダイ</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル</td><td>メルク</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>ボルトン寒天</td><td>メルク</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>ボルトンブロス</td><td>メルク</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar ビブリオ</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>エオシンメチレンブルー寒天&nbsp;</td><td>メルク</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>ビオチウム</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq バッファー</td><td>プロメガ</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>ローディング染料 100 bp DNA ラダー</td><td>プロメガ</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>ローディング染料 1kb DNA ラダー</td><td>プロメガ</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>プロメガ</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>マンニトール卵黄ポリミキシン寒天</td><td>メルク</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>マッコンキー寒天</td><td>メルク</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>ニュートリエントブロス</td><td>メルク</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>タクポリメラーゼ</td><td>メルク</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカーゼ 大豆ブロス</td><td>メルク</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカーゼ大豆寒天</td><td>メルク</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

食品由来病原体を検出する電気化学的 dna のバイオ センサーの開発

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

(ビブリオ) 腸炎ビブリオ、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与える公衆衛生問題の大きい割合にグローバルに貢献する一般的な食中毒病原体であります。文化法、免疫アッセイと分子手法など腸炎ビブリオの検出のための従来の方法は、複雑なサンプル処理を必要し、時間がかかり、退屈な高価です。最近では、バイオ センサー高速検出、費用対効果、および実用性の利点を持つ有望な包括的な検出方法であると証明しました。この研究は、急速な高選択性と感度のハイブリダイゼーションの原則を使用して腸炎ビブリオ検出法の開発に焦点を当てます。仕事で合成したポリ酸安定の金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子) の評価は、x 線回折 (XRD)、紫外可視分光法 (紫外-可視)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、電界放出を使用して達成されました。走査型電子顕微鏡 (FESEM) およびサイクリックボルタンメトリー (CV)。さらに、PLA 結果の再現性、感度、安定性のテストを行いました。わかった PLA によって金ナノ粒子が水溶液中で安定化されたナノ粒子の音構造を形成します。また電荷転送の抵抗 (Rct) 値を小さくと活性表面積 (0.41 cm2) の増加の結果として感度が改善したことが観測されました。私たちの DNA のバイオ センサーの開発は、PLA によって金ナノ粒子と酸化還元指示薬としてメチレン ブルー (MB) を使用してスクリーン印刷されたカーボン電極 (空間) の修正に基づいていた。差動パルス ・ ボルタンメトリー (DPV) による固定化と交配イベントを評価しました。相補、補完的、ことがわかったし、不一致のオリゴヌクレオチドは具体的に試作したバイオ センサーによって区別されていました。様々 な食品媒介病原体に対する交差反応性の研究、新鮮な貝で腸炎ビブリオの同定、また確実に高感度検出を分かった。

金ナノ粒子の形成は、現在クエン酸ナトリウムを用いた水溶液の色の変化によって明らかにされました。これは深いルビー色の赤に黄色の光から変更する色を発生します。表面プラズモン共鳴 (SPR) ピークの成長が約 540 で見つかりました紫外-可視スペクトル (図 1) から PLA によって金ナノ粒子の生成が確認された nm。形成と PLA によって金ナノ粒子の存在粒子サイズ37に応じて、500-600 nm の波長範囲で示されました。金ナノ粒子と PLA によって金ナノ粒子の x 線回折パターンは、図 2のとおりです。すべての結晶のピークは、77.7 °、64.7、44.4 38.2 31.7 2 θ で観測しました。彼らは (100) (111) (200) (220) に帰因した立方 FCC (面心立方) 金 (311) 結晶面 (金属) (JCPDS ファイル号-00-004-0783) ナノ構造とします。...

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA センサーの開発のためのプロトコルが表示されます。

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

食品媒介性病原体は、世界中の公衆衛生問題の大部分を占めており、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与えています。従来の食品媒介病原体検出法では、サンプルの取り扱いが複雑で、時間がかかります。最近、バイオセンサーは、迅速な検出と実用性の利点を備えた有望で包括的な検出方法であることが証明されています。バイオセンサーの開発は、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子を用いた改質電極をベースとしています。スクリーン印刷されたカーボン電極は、作用電極の有効表面積を増加させるために変更されました。酸化還元錯体として使用されるメチレンブルーは、固定化プローブDNAの一本鎖DNAと強い結合を持っています。この高い親和性の関係は、高いピーク電流で表されます。一本鎖DNAとその相補的な配列とのハイブリダイゼーションは、結合したメチレンブルー分子を置き換え、差動パルスボルタンメトリーの電流を減少させます。これは、相補的な二本鎖DNAを持つ改質電極の表面に集まったメチレンブルーの量が少なかったためであり、グアニン塩基間の到達不能な相互作用によって引き起こされた可能性があります。調製した溶液の色は、黄色から黒っぽい色、最後に濃いルビー色に変わります。これは、金塩がクエン酸イオンによって還元されたことを示しています。溶解したポリ乳酸を予め調製した金ナノ粒子溶液と混合し、次いで室温で均一に攪拌し、これをポリ乳酸安定化金ナノ粒子と示した。紫外可視分光法、X線回折法、透過型電子顕微鏡法、およびエネルギー分散型X線分光法を用いた電界放出走査電子顕微鏡法を用いて、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の特性評価を行った。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の均質溶液の約25マイクロリットルをスクリーン印刷されたカーボン電極上に迅速にピペットで移動し、使用前に24時間風乾した。次に、改変した電極をフェロシアン化カリウムで電気化学的に特性評価し、活性表面積、電気化学インピーダンス分光法、再現性、再現性、および安定性を測定しました。固定化条件の最適化は、0.2〜1.4マイクロモルの範囲の一本鎖DNAの濃度、30〜220分の時間、および摂氏25〜75度の温度範囲の3つの要素を使用して決定しました。一方、ハイブリダイゼーション条件の最適化は、5分から35分の時間と25°Cから75°Cの2つの要素によって決定された。次いで、処理した改質電極を20マイクロモルのメチレンブルーに30分間浸漬した。非特異的に吸収されたDNAと過剰なメチレンブルーは、生理食塩水アセテート緩衝液pH 4.5で洗浄することにより除去され、次いで脱イオン水ですすいだ。メチレンブルーリダクションのピーク電流は、差動パルスボルタンメトリー技術を使用して測定されました。差動パルスボルタンメトリー測定は、インジケーターを含まないリン酸緩衝生理食塩水pH7.0を使用して実行されました。同様の手順がすべてのインタラクションに対して実施されました。参照株としての腸炎ビブリオと、他の8つの細菌株、すなわちカンピロバクタージェジュニ、リステリアモノサイトゲネス、ネチフス菌、サルモネラ腸炎、肺桿菌、大腸菌O157:H7、セレウス菌、および一般的な食品媒介病原体のアルギノリチクス菌が、この研究の電気化学的DNAバイオセンサーの検証に使用されました。それぞれの寒天上での細菌株の定期的な継代培養を、生存率を維持するために2週間ごとに実施しました。パラヘモリチクスビブリオ細胞の量は、スプレッドプレート法を用いて決定した。1ミリメートルの細菌細胞培養物を、3%塩化ナトリウムを含有する9ミリメートルのトリプチカーゼ大豆ブロスに移し、希釈係数10を得た。次に、希釈係数10〜10倍から希釈係数10倍までの1回までの各希釈係数0.1ミリリットルを、コロニーカウント用のCHROMagar Vibrioのプレート上にそれぞれ広げた。ザルガイは生鮮市場から入手し、分析のために氷冷器ボックスですぐに実験室に持ち込まれました。ザルガイは、収穫の開始から市場での冷蔵保管まで一様に収穫されたと仮定して、処理されたグループと未処理のグループの2つのグループに分けられました。処理群のザルガイは、マイナス20°Cで24時間保存し、続いてDNA抽出の4時間前に20°Cの紫外線に曝露することにより前処理しました。対照群に使用された氷点下温度と紫外線曝露は、それを殺すか、少なくともザルガイに自然に蓄積する食品媒介病原体を制限すると予想されました。摂氏70度のより高い低温殺菌体制は適用されませんでした、なぜならこの研究の制御された条件の目的は新鮮なザルガイの実際の状況を模倣することだったからです。一方、未処理のグループからのサンプルは、実験室に到着するとすぐに、前処理なしで直接分析されました。ザルガイを蒸留水で洗浄し、汚れをこすり落とした後、滅菌鉗子と層流キャビネットを使用して殻から組織を除去しました。約10グラムのザルガイ組織サンプルを、ホモジナイザーでホモジナイザーを使用して、3%塩化ナトリウムを含む19ミリリットルの滅菌トリプチカーゼ大豆ブロスで60秒間ホモジナイザーしました。次に、既知量の食品媒介病原体を、スパイクしたサンプルの均質化サンプルブロスの9ミリメートルに添加しました。スパイクされていないサンプルをネガティブコントロールとして使用しました。約1ミリリットルのサンプルをエッペンドルフのチューブにピペットで入れ、DNAサンプルを抽出し、バイオセンサーとポリメラーゼ連鎖反応アッセイに使用しました。次いで、食品媒介性病原体のゲノムDNAを、スパイクしたサンプルとスパイクしていないサンプルから抽出した。ゲノムDNAは、修正された煮沸溶解手順に従って抽出されました。ゲノムDNAを毎分12,000回転で4°Cで3分間遠心分離して透明な懸濁液を取得し、上清をさらなる使用のために摂氏マイナス20°Cに保った。バイオフォトメーターを使用して、抽出されたゲノムDNAの濃度と純度を決定しました。次に、すべての株の同一性を標準的な生化学的アッセイを使用して決定し、16のSR RNA遺伝子シーケンシングによって検証しました。最後に、ゲノムDNAを摂氏92度で2分間変性させ、氷水で急速に冷却してからバイオセンサーを塗布しました。さらに、食品媒介性病原体の同定は、それぞれの遺伝子を標的としたポリメラーゼ連鎖反応を用いて行いました。増幅された生成物とそのサイズは、1.5%アガロースゲル上で電気泳動することによって決定されました。ゲル画像は、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して取得しました。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の生成は、表面プラズマの成長と共鳴ピークが約540ナノメートルに確立された紫外可視スペクトルから確認されました。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の形成および存在は、粒子サイズに応じて、500〜600ナノメートルの波長範囲で示された。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の全ての結晶子ピークが、31.7度、38.2度、44.4度、64.7度、77.7度の2つの劇場で観察された。また、31.7度でより広範な回折ピークが入るにつれて、結晶子のピーク強度も増加し、冷たいナノ粒子がポリ乳酸に埋め込まれていることを意味し、多相性の金ナノ構造の形成を示唆しています。透過型電子顕微鏡の粒子分布曲線とポリ乳酸安定化金ナノ粒子の画像から、金ナノ粒子はほぼ球形をしていることが分かりました。ナノ粒子のサイズは約37ナノメートルの範囲にあり、これはシェラーの公式から得られるものよりもわずかに大きく、合成されたナノ粒子の多結晶性を示唆しています。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の主なサイズは、100ブラッグ反射の幅を決定することにより、シェラーの方程式を使用して計算されました。この表から、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の結晶子サイズは27ナノメートルと計算されました。電界放出走査型電子顕微鏡画像とエネルギー分散型X線スペクトルから、改質スクリーン印刷された炭素電極は、金の重量比が最も高く、密度が最大で、ナノ粒子被覆の構造が最大でした。エネルギー分散型X線スペクトルにより、生成されたポリ乳酸安定化金ナノ粒子は金のみで構成され、炭素と酸素に対応するピーク以外の元素は示さなかったことが確認されました。陽極と陰極のピーク電位は、異なるスキャン速度で一貫しており、電気化学反応がピーク分離に基づいて可逆的であったことが示唆されています。改質電極の有効表面積は、裸電極と改質電極でそれぞれ0.26cm二乗、改変電極で0.41cm二乗と算出した。この結果から、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子が活性表面積上で得られる改善は、裸電極と比較して相対的に高いことが確認されました。裸電極の電荷移動抵抗の値は1, 932オームでしたが、変更された電極は1, 444オームに減少しました。改質電極における電荷移動抵抗値の減少は、局所的な誘電率の低下および/または電気二重層の厚さの増加に起因する可能性があり、フェロシアン化カリウムが金属または溶液界面での吸収によって機能したことを示唆しています。ピーク電流は、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子を用いた裸電極の改質に伴って徐々に増加し、より高い感度が低い電荷移動抵抗の逆であることを示した。改変電極の相対標準偏差は4.26%と導出されましたポリ乳酸安定化金ナノ粒子修飾を有する電極は、いくつかの測定後により良い相対標準偏差を与えました。改質電極の相対標準偏差値は4.05%であり、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の電極製造の再現性が優れていることを示しています。DNAの最適な濃度は1.2マイクロモルの一本鎖DNAでした。一本鎖DNAの最適な固定化時間は180分と選択した。一本鎖DNAの最適な固定化温度は、摂氏55度として選択されました。二本鎖DNAの最適なハイブリダイゼーション時間は10分と選択した。二本鎖DNAの最適なハイブリダイゼーション温度は、摂氏35度として選択されました。相補的DNAは、プローブしたDNA、非相補的DNA、3塩基不一致DNA、および1塩基不一致DNAの中で0.73マイクロアンペアという最も低いピーク電流を示しました。標的とされたDNAからの高電流が、オリゴヌクレオチドの他の配列の電流よりも小さいことは明らかです。この結果から、バイオセンサーを用いて高い感度と特異性で識別できることが示されました。構築したDNAバイオセンサーは、改変電極表面に固定化されたプローブDNAによるハイブリダイゼーション検出の選択性を有していた。修飾電極上のメチレンブルーの微分パルスボルタンメトリーピーク電流の連続的な減少は、相補的DNAの濃度の増加の結果として引き起こされました。0.2ピコモルから0.02ミリモルまでのさまざまなターゲットDNA濃度の対数とメチレンブルー還元ピーク電流の対数との間の線形相関は、0.96の線形回帰係数で示されています。作製したDNAバイオセンサーの回収率は、6ヶ月間の保管後、初期信号の80%以上までゆっくりと減少し、改変電極表面の一本鎖DNAのプローブが非常に安定していることを示しています。摂氏45度未満の温度での良好な長期安定性が、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子と一本鎖DNAとの間の強い反応の理由である可能性があります。9種類の細菌(Bacillus cereus、Listeria monocytogenes、Campylobacter jejuni、Escherichia coli、Vibrio alginolyticus、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritis、Klebsiella pneumoniae、Vibrio parahaemolyticus)のポリメラーゼ連鎖反応増幅産物をスクリーニングしました。交差反応性評価後に得られた差動パルスボルタンメトリーピーク電流は、他の細菌種と比較して、腸炎ビブリオが非常に明確に検出されていることを示しています。塩基対の数を減らすと、観測される差動パルスボルタンメトリー信号が増加することがわかります。これは、プローブまでのメチレンブルー分子の量が多いことに関係しています。ポリメラーゼ連鎖反応解析から、レーン 7、8、9、10、11、および 12 で示されているように、処理したスパイクサンプルと未処理のスパイクサンプルの両方で腸炎ビブリオが見つかりました。一方、レーン 1、2、3、4、5、および 6 で処理された未処理のスパイクされていないサンプルには、腸炎ビブリオは含まれていませんでした。開発したDNAバイオセンサーを用いた検出結果により、スパイクサンプルと非スパイクサンプルからなる治療群における腸炎ビブリオの存在を成功裏に決定しました。これらの結果は、前述のポリメラーゼ連鎖反応の結果と正の相関があります。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の応用は、さらなる製造感覚のための修正剤としての応用に大きな可能性を秘めています。酸化還元複合体が非ハイブリダイズ生体認識分子とより強く結合すると、高い選択性が達成される可能性があり、これはフォローアップする価値のあるイノベーションである可能性があります。

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Research

JoVE Journal

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学ぶ 食品由来病原体Vibrio parahaemolyticusを検出する電気化学的DNAバイオセンサーの開発手法。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子修飾電極を用いて感度を向上させ、食品安全性評価に応用可能な迅速検出技術を確立する。

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオセンサーの開発

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