リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

このシンプルな蛍光ベースのレポーターアッセイの全体的な目標は、酵母モデル生物におけるリシン毒素AまたはRTA鎖の適切な輸送に必要な細胞成分をスクリーニングすることです。この方法は、B毒素の活性化におけるリボソームの細胞間輸送に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの場合、原形質膜から細胞体への単純な毒素リシンの細胞傷害性サブユニット

このアッセイの主な利点は、RTA輸送に対する個々の酵母遺伝子の影響を迅速かつ安価に解析できることです。このプロトコルは、テキストプロトコルに詳述されているように、細胞形質転換から開始します。5ミリリットルのLBカナマイシン培地に、RTA発現プラスミドまたは空のベクターを含む細胞を接種します。

細胞を摂氏37度、220RPMで24時間インキュベートします。1リットルのLBカナマイシン培地に5ミリリットルのプレカルチャーを補給します。次に、細胞が600ナノメートルの0.8〜1.0の光学密度に達するまで、摂氏37度および220RPMで細胞をインキュベー

その後、培養温度を摂氏28度に下げます。IPTGを最終濃度1ミリモルに添加することにより、大腸菌のRTA発現を誘導します。摂氏28度および220回転で3.5時間後、10,000gおよび摂氏4度で10分間遠心分離によって細胞を収穫する。

次に、ペレットを5ミリリットルの結合緩衝液とペレットで10,000gおよび摂氏4度で10分間洗浄します。洗浄を一度繰り返した後、ペレットを5ミリリットルの結合緩衝液に再懸濁します。15秒のパルスと30秒の休止の5サイクルを使用して、氷上で細胞を超音波処理します。

細胞ライケートを21,000gおよび摂氏4度で15分間遠心分離した後、滅菌シリンジフィルターシステムを使用して上清をろ過します。5 ミリリットルのニッケルベースのアフィニティーカラムを備えた自動精製システムを使用して、滅菌ろ過された大腸菌上清から HIS-tagged RTA フラクションを精製します。一般に、1分間に1ミリリットルの暗示速度を使用し、精製システム全体を冷却して、非効率的な毒素結合と毒素活性の損失を防ぎます。

アフィニティーカラムを20ミリリットルの結合バッファーで短時間平衡化し、保存バッファーを取り出します。次に、滅菌したろ過した上清をシリンジを使用してアフィニティーカラムに塗布します。25〜35ミリリットルの結合バッファーでカラムを洗浄し、未結合のタンパク質をカラムから除去します。

280ナノメートルの紫外線吸収剤が初期紫外線値に近づくまで、洗浄工程を行ってください。次に、結合したRTAフラクションを20〜35ミリリットルの溶出バッファーで溶出し、サンプルを氷上に保ちます。UV、280の値が増加した直後にRTAフラクションサンプリングを開始し、RTAフラクションサンプリングが再び元のベースラインに達したときに停止することが重要です。

逃れたRTAフラクションを脱塩するには、精製システムのアフィニティーカラムを脱塩カラムに交換し、カラムを20ミリリットルの0.8モルソルビトールで平衡化します。逃したRTA画分をシリンジでカラムに適用します。カラムを 100 ミリリットルの 0.8 モルソルビトールで洗浄し、UV 吸収が増加し始めたらすぐに、脱塩した RTA 画分を 15 ミリリットルのチューブで希釈します。

塩分汚染を避けるために、コンダクタンスが増加したら直接フラクションサンプリングで停止します。Eluded RTAフラクションを摂氏4度で保存します。テキストプロトコルで説明されているように酵母を形質転換した後、各プレートから3つの異なる酵母クローンを選択します。

クローンを100ミリリットルのルシンドロップアウトラフィノース培地に220RPMおよび摂氏30度で接種し、600ナノメートルの光学密度が1.0〜2.0になるようにします。細胞を摂氏25度で10, 000gで5分間遠心分離する。細胞を5ミリリットルの滅菌水で2回洗浄した後、細胞を50ミリリットルのスフェロプラスト緩衝液に再懸濁します。

50ミリリットルの培養物を100RPMおよび摂氏30度で90分間インキュベートする。400 g、摂氏4度で10分間遠心分離した後、5ミリリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地で細胞を2回洗浄します。次に、同じ培地の5ミリリットルに細胞を再懸濁して、GFPレポーターアッセイの測定に細胞を直接使用します。

酵母細胞のスフェロプラストを96ウェルプレートに播種します。各ウェルに、70マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地を加え、ネガティブコントロールを含み、5マイクロモルの最終RTA濃度で空のベクターまたは精製RTAを発現します。70マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウト培地を残りの各ウェルに追加して、総容量を270マイクロリットルにします。

タンパク質阻害のポジティブコントロールには、G418が酵母でのGFP発現を防ぐため、70マイクロリットルの0.8モルソルビトール安定化G418溶液を追加します。すぐに30マイクロリットルの安定化ガラクトース溶液を加えて、GFP発現を誘導します。30%ガラクトースの代わりに30マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地を追加して、追加のネガティブコントロールを準備します。.

サンプル調製が終了したら、96ウェルプレートを蛍光リーダーに入れ、GFP蛍光検出に必要な475、509ナノメートルフィルターセットを使用して測定の準備をします。摂氏30度、120RPM、振とう直径1mm、20時間の時間枠で、測定間隔を10分で行います。RTAのアフィニティークロマトグラフィーとエンプティベクターコントロールの代表的な精製グラフを示します。

ブラックボックスの青いピークは、バインドされたRTAフラクションを表します。ブラックボックスに示されているように、ネガティブコントロールではカラムからタンパク質が抜けていません。ここに示されているのは、アフィニティー精製されたRTAフラクションの脱塩図です。

この図は、RTAタンパク質画分と塩分画の分離を示しています。精製および脱塩が成功した後のクマシー染色の結果は、異なるRTAバリアントの細胞溶解物または精製されたサンプルを示しています。この研究では、未修正のRTAを使用しました。

蛍光間隔レポーターアッセイを検証するために、野生型酵母スフェロプラストの相対GFP蛍光を、GFP誘導の20時間後に誘導および非誘導条件下で測定しました。相対GFP蛍光も、RTA、G418、またはネガティブコントロールの存在下で分析しました。また、酵母のRTA輸送に関与するタンパク質と関与しないことが知られているタンパク質が選択された変異体についても、相対的なGFP蛍光を測定しました。

点線は有意性のしきい値を表しています。RTAの発現と精製を習得すると、蛍光レポートアッセイの結果は1日で受け取ることができます。さらに、この方法は、リボソームによるB毒素の不活性化の分野の研究者が、真核生物のモデル酵母におけるリボソームの中毒の根源を研究する道を開きます。