Name: リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶリシン毒素Aの酵母細胞内輸送に必要な細胞成分を蛍光レポーターアッセイでスクリーニングする方法です。個別遺伝子の効果を迅速かつ低コストで解析でき、毒素の細胞内輸送メカニズム解明に貢献します。

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本研究の一部は親切 (SFB 1027, A6) ドイツ研究基金からの助成金によってサポートされています。

注: 一般的な実験的ワークフローの概要については、図 1に描かれています。
注意: RTA は人間にとって猛毒です。安全性研究室許可 S2 (バイオ セーフティ レベル 2 に相当) が必要です。全体の実験の間に手袋を着用してください。
1. 異種発現大腸菌の彼の付けられた RTA
<ol>
	<li>エシェリヒア属大腸菌細胞発現プラスミド pET24-RTA(彼) の 6または標準エレクトロポレーション プロトコル9,10を使用して、空のベクター pET24a(+)に変換します。空のプラスミドを含むセルは、ネガティブ コントロールとして機能します。</li>
	<li>カナマイシンを含む (100 μ g/mL) LB プレート上の肯定的なクローンの選択後、RTA 発現プラスミドまたは 5 mL の LB 培地菅(カナマイシンの 100 μ g/ml の LB 培地) で空のベクターを含む細胞を接種し、37 ° C で 24 時間 220 rpm 間加温します。</li>
	<li>5 mL の前培養で 1 L LB菅媒体を補完し、細胞が 0.8 〜 1.0 (約 3-4 h) の外径600に達するまで、37 ° C および 220 rpm でセルを孵化させなさい。その後、培養温度を 28 ° C に減らすし、H2o. イソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 原液の 1 M を準備</li>
	<li>最終濃度 1 mM の IPTG を追加することによって尿細管性アシドーシス発現大腸菌を誘発します。</li>
	<li>3.5 h 28 ° C で、220 rpm 10,000 × g、10 分、4 ° C で遠心分離によって細胞を収穫後 2 回の 5 mL の結合バッファー (500 mM の NaCl、10 mM のイミダゾールと 20 mM KH2PO4餌を洗浄します。、pH 7.4 を =) 10,000 x g と 4 ° C、10 分、5 mL の結合バッファーでペレットを再懸濁します。 注: プロトコルは一時停止することができますこの段階で、数日間 80 ° C でセルを格納できます。</li>
</ol>
2. アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって彼の付けられた RTA の浄化
<ol>
	<li>次のプロトコルを使って氷の上細胞を超音波照射: 15 s パルス (20 ミクロン)、30 秒一時停止。5 回、この手順を繰り返します。</li>
	<li>細胞ライセート 21,000 x g と 4 ° C、15 分でを遠心し、上清滅菌注射器フィルター システム (0.2 μ m 孔サイズ) を使用してフィルターを適用します。 注: 正常に熱量のサンプルの細胞ペレットは、透明の枠線を表示します。</li>
	<li>5 mL Ni2 +を搭載した自動浄化システムを使用して-、無菌ろ過エシェリヒア属大腸菌の培養上清から、RTA の彼の付けられた分数を浄化するアフィニ ティー ・ カラムを用いた。一般に、1 mL/分の溶出速度を使用し、非効率的な毒素結合と毒素活性の損失を防ぐために全体の浄化システムをクールします。 メモ: 効率的な RTA 浄化のパラメーターは表 1に表示されます。ベッカーらも参照してください。さらに情報9。<ol>
		<li>簡単に言えば、平衡 20 ml の結合バッファー記憶域バッファーを削除するのアフィニ ティー ・ カラム。注射器を用いたアフィニ ティー ・ カラムに上清を滅菌フィルターを適用します。</li>
		<li>25-35 mL の結合バッファー列からバインドされていないタンパク質を削除すると列を洗います。紫外線吸光度 280 まで洗濯の手順 nm に近い紫外線の初期値。</li>
		<li>20-35 mL の溶出バッファーでバインドされた RTA 分数を溶出 (500 mM のイミダゾール、500 mM 20 mM KH2PO4pH, 塩化ナトリウム = 7.2) し (図 2 aおよび図 2 b) 氷のサンプルを保ちます。 注: RTA 画分の溶出は、UV 吸収の増加によって示されます。専ら非特異的結合タンパク質の混入を防ぐためにこの割合を収集するために注意してください。</li>
		<li>西部のしみの分析12,13 (オプション) またはブルー染色11を実行する溶出サンプルの 20 μ L を使用します。尿細管性アシドーシスを検出および確認サンプル純度 (図 3) にプライマリ反彼の抗体 (1:1, 000) および二次対策-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) を使用します。</li>
		<li>5 mL 脱塩カラムの溶出の RTA 分数を脱塩し、0.8 M ソルビトールのサンプルを平衡します。<ol>
			<li>脱塩カラムで精製システムの親和性列に置き換えるし、最初 0.8 M ソルビトール 20 mL でコラムを平衡させ。</li>
			<li>RTA の溶出画分を注射器を介して列に適用されます。0.8 M ソルビトールの 100 mL で列を洗浄し、紫外線吸収が (図 2) を増大し始めるとすぐに 15 mL チューブに脱塩の RTA の画分を溶出します。</li>
			<li>4 ° C で溶出 RTA 分数を格納します。 注: は、コンダクタンスが塩の汚染を避けるために増加したとき直接 RTA 分数サンプリングを停止します。脱塩のプロシージャのパラメーターは表 1 のとおりです。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10,000 x g で 4 ° C 30-180 分 1-2 mL の最終巻に 10 kDa カットオフ スピン列を使用して溶出の RTA 分数を集中し、3-4 週間の 4 ° C でサンプルを格納します。 注意: は、RTA の活動の完全な損失につながるを凍結からサンプルを凍結しないでください。</li>
	<li>従来タンパク質定量キットを用いたタンパク質濃度を決定します。蛋白濃度は 1 〜 1.5 mg/mL の範囲でする必要があります。 注: RTA 傾向にあるタンパク質濃度が高すぎる場合の沈殿 (&gt; 5 mg/mL)。</li>
</ol>
3. 酵母の変換および細胞壁の除去
<ol>
	<li>GFP レポーター プラスミド pRS315 K28SP- GFP と6標準的なリチウム アセテート変換方法14を使用して野生型または選択した酵母欠失変異株を変換します。ロイシン ドロップ アウト (d/o) 上のセルを孵化させなさい肯定的なクローンの選択の 2 〜 3 日の 30 ° C でのグルコース プレート (グルコース 2% 1.5% 寒天 0.5% 硫酸アンモニウム、0.17% 酵母窒素ベース (YNB)、ロイシンなし 0.087 %d/o のミックス)。</li>
	<li>各板から 3 の異なる酵母クローンをピックアップし、220 rpm と OD600 ~ 30 ° C でロイシン d/o ラフィノース培地 (2% ラフィノース、0.5% 硫酸アンモニウム、0.17%、YNB、0.087 %d/o ロイシンなしミックス) 100 mL でクローンを接種する = 1.0 2.0 (10 x 2 47セル/mL)。 注: 別の酵母遺伝子破壊株の細胞の成長が違います。分光光度計による外径600を監視します。</li>
	<li>外径600サンプルを希釈する外径 φ600の値を計算するには、= 0.1 0.3 (1:5、1:10 に希釈) 外径600分光光度計で測定。参考として、H2O ロイシン d/o raffionose 中の対応する量の補完を使用します。</li></ol>最後に、外径600を再懸濁します 5 mL の滅菌水 (5 x 108セル/mL) に 125 を =。
	<li>遠心 10,000 × g で 5 分間 25 ° c 細胞、5 mL の滅菌水で 2 回細胞を洗浄し、50 mL spheroplasting バッファー内の細胞を再懸濁します (0.8 M ソルビトール、10 mM トリス-HCl (pH 7.5) 10 mM CaCl2、2 mM ジチオトレイトール (DTT) と 200 μ g/mL 溶解酵素)。</li>
	<li>100 rpm、90 分オプション 30 ° C で 50 mL 文化を孵化させなさい: 位相差顕微鏡によるスフェロプ ラスト形成 15 分毎を監視します。顕微鏡で細胞半透明ダークグレー色が必要です。ブライト (屈折) セル十分に消化されていない、一方幽霊 (淡灰色はほとんどがあれば、内部構造を持つ細胞) 消化されて過剰。</li>
	<li>各サンプルのスフェロプ ラスト準備の有効性を確認します。
	<ol>
		<li>仕上げステップ 3.5、496 μ spheroplasting バッファー (約 2 × 106スフェロプ ラスト) で 50 mL の spheroplasted 文化の 4 μ L を混合し、400 × g で 10 分間遠心した後。</li>
		<li>10 mL H2O にペレットを再懸濁します蒸留、30 s、およびロイシン d/o ブドウ糖プレート (2% グルコース 1.5% 寒天 0.5% 硫酸アンモニウム、0.17%、YNB、ロイシンなし 0.087 %d/o のミックス) のサンプルの 10 μ L をプレートの渦サンプル。</li>
		<li>30 ° C で 3 日間インキュベート細胞皿の上の成長細胞群れ体の合計数をカウントします。データ評価のため効率が 98% 以上でサンプルのみの使用 (細胞コロニー総数 &lt; 40 植民地/プレート)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ステップ 3.5 g と 4 ° C、5 mL で 2 回 10 分と洗浄の細胞 x 400 で安定ロイシン d/o ラフィノース培地 (0.8 M ソルビトール、ラフィノース 2%、0.5% 硫酸アンモニウム、0.17%、YNB と 0.087% ドロップ アウト ミックス ロイシンなし) から細胞を遠心します。5 mL 安定ロイシン d/o ラフィノース培地 (1 x 108セル/mL) で細胞を再懸濁します、GFP レポーター アッセイ測定 (セクション 4) セルを直接使用します。</li>

4. GFP レポーター アッセイ測定 96 ウェルのプレート
<ol>
	<li>96 ウェルのプレート (200 μ L/ウェル) にステップ 3.7 で得られた酵母細胞スフェロプ ラストをシードします。</li>
	<li>70 μ 安定ロイシン d/o ラフィノース培陰性対照を追加 (Ni2 +の溶出液-親和性浄化された細胞ライセート空のベクトルを表現する IPTG によるエシェリヒア属大腸菌のセルから) または最終的な RTA 濃度 5 μ M (の RTA を精製160 グラム/L の RTA に対応する) 各井戸。</li>
	<li>すぐに、GFP 発現を誘導し、その後、測定を開始 30 μ L 安定ガラクトース ソリューション (30% ガラクトース、0.8 M ソルビトール) を追加します。 注: 実験につき少なくとも 3 の技術的なレプリケートを実行し、3 生物が酵母ごとにレプリケートします。</li>
	<li>仕上げのサンプル準備 (手順 4.1 4.3) 後、蛍光リーダーの 96 ウェル プレートを置くし、測定を開始します。475/509 nm のフィルターが GFP 蛍光検出に必要なセットを使用します。振動直径 20 h (10 分間隔の測定) の時間帯にわたって 1 mm と 120 rpm、30 ° C での測定を実行します。 注: GFP フィルター セットは通常リーダーのすべてのシステムで利用可能です。温度、時間、間隔、および RTA の濃度の測定は、独自のニーズに調整できます。代表的な結果は、図 4のとおりです。</li>
	<li>オプション: 品質管理測定の内部コントロールを追加を使用します。ネガティブ コントロールを準備するには、30% ガラクトース (GFP 誘導なし) の代わりに 30 μ L 安定ロイシン d/o ラフィノース媒体を追加します。また、0.8 M ソルビトール安定 G418 溶液 (300 μ g/mL) 70 μ L を追加します。酵母における GFP の発現を防ぐために、タンパク質翻訳阻害剤 G418 はタンパク質を阻害する肯定的な制御として機能します。</li>
	<li>次の式によると 20 h の時間ポイントのパーセントで GFP 蛍光を計算 (図 4 aを参照してください): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> 、NC はネガティブ コントロール
	<ol>
		<li>また、各測定ポイントの相対的な GFP 蛍光を確認 (このケースの 10 分でまた見なさいステップ 4.4) 上記の同等化を使用して。図 4 bに示すように、GFP の蛍光強度 (y 軸) を時間 (x 軸) をかけてしみが付くことによってグラフを作成します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
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</ol>

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上記プロトコルを実行すると、実験の成功を達成するために次の提案をお勧めします。
異種蛋白質の表現、1 mM の IPTG 濃度を超えないようにすることが重要です。IPTG 濃度 &#62; プロモーターによって誘導される RTA 式および毒素の収率を下げる鉛 1 mM を阻害します。さらに、封入体形成、非効率的な折りたたみ、毒素の不活性化を防ぐために 28 ° C 以上の高温で細胞を栽培する必要がありますはないです。RTA 式低温 (例えば, 20-28 ° C) が可能であり、また生物のアクティブな毒素の生産に 。ただし、追加の温度低減は RTA 活動/折りたたみを大幅改善し、28 ° C (データは示されていない) と比較して低い総毒収率の結果します。
アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (表 1) の浄化パラメーターが自動浄化システムの使用 5 mL Ni2 +アフィニ ティー ・ カラムを装備し、場合調整その他自家製または商業列システムする...

細菌の生産する毒素によって感染症を患っている患者は、効率的な治療がまだ大きく不足しているので特に各社会医療システム、医療、金融負担が大きいを表しています。医学的に関連する A の複雑な中毒メカニズム、新たな治療戦略を開発する/コレラ毒素、志賀毒素、リシンなど B 毒素が完全に実装すべき新規の強力な試金に基づく分子レベルで理解する必要があります。
近年、いくつかの研究は A の分析を試みました酵母の放射性毒素など時間がかかり、コストがかかる方法を使用して哺乳類セル B 毒素輸送標識 siRNA ベースのスクリーニングと同様、1,2 /3をに近づきます。場合によっては、毒素が人身売買されている可視化体内蛍光顕微鏡による fluorophores が付いて、量子ドットや蛍光タンパク質4,5サブユニットを個々 の毒素の化学および/または遺伝的結合の後。残念ながら、そのような変更はしばしば毒素の不活性および/または変更の自然な特性に します。さまざまな科学的な質問の答えを直接別のエレガントな方法はlacZのルシフェラーゼなど蛍光タンパク質酵素レポーター系の使用 (例えばGFP やDiscosoma sp. 赤色けい光たんぱく質 (下流))。
本稿では、単純なプロトコルは、出芽酵母の細胞外応用 RTA の細胞内輸送に必要な細胞のコンポーネントを特定する説明します。それにより、GFP が続く ER インポート N ターミナル信号を含んでいる蛍光レポーター プラスミッドは GFP 蛍光性の放出後体内で RTA を介したタンパク質翻訳阻害を直接に測定するタンパク質生合成センサーとして機能します。翻訳6。RTA エンドサイトーシスおよび/または細胞内輸送が否定的 (または積極的に) 影響する野生型と比較して特定の酵母削除変異株の場合は GFP 蛍光発光6に増加 (または減少) を検出できます。
これまでのところ、酵母細胞における RTA 輸送の分析のすべてのメソッドは、RTA の小胞体-細胞質レトロ移行プロセスに制限されていました。このような人工的なシステム、ER インポート信号を含む RTA は自殺の表現型の1、7の結果誘導型プロモーターから表されます。リシンの B サブユニットの結合セル本稿に記載されている実験のセットアップで行方不明は同様にであり、したがって、完全に表さないリシン holotoxin 中毒8の自然状況、毒素トランスポート プラズマから膜小胞体、ゴルジ装置では、この新規アッセイで密接にまねることができます。興味深いことに、パイロット研究で得られた予備的な結果は、RTA 人身取引の経路がリシン holotoxin の中毒ルートに顕著な類似性を明らかにすることを示します。
要約すると、RTA エンドサイトーシスで選択した細胞蛋白質と酵母の人身売買の特定の役割を決定するこの方法を使用できます。さらに、この実験のセットアップは簡単に他のリボソームが出され、様々 な酵母や細菌種は、zymocin や志賀毒素などから分泌毒素を不活性化に適応する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Bacterial and yeast strains<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>ユーロスカーフ</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742 欠失変異体</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>YSC1054 全コレクション</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>このプロトコルで使用されるプラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>strongComments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>細胞壁用溶解酵素除去</td></tr><tr><td>LBブロス培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>10855021</td><td>15 g 寒天をプレート製造用に追加しました</td></tr><tr><td>YNB</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>酵母ドロップアウトミックス ロイシンなし</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td> シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-ラフィノース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-ガラクトース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 定規 既染色</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>タンパク質 はしご 西洋の分析に使用されます</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>RTA精製、脱塩、リーダー測定用の材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>旧モデル、その他のモデルあり</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>旧モデル、もう利用できません</td></tr><tr><td>&Auml;KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>製品は製造中止となり、交換されました</td></tr><tr><td>HisTRAP HPカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart 滅菌フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534K</td><td>0.2 &micro;m細孔サイズ</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nmアッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>抗体 (オプション)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>一次抗体; 1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>二次抗体 1:10,000 希釈</td></tr></tbody></table>

リシン毒素チェーン (rta) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

細菌や植物 A/B 毒素は、真核細胞の細胞質内の細胞内ターゲットに到達し、最終的に殺す自然の人身売買経路を悪用します。このような A ・ B 毒素が酵素によって実行中の構成一般的に Asubunit (例えば、リシン毒素 (RTA))、1 つまたは複数のセルに特定のバインド毒素は細胞表面の受容器のために責任がある Bsubunit(s) をバインドします。方法の私達の現在の知識 A/B 毒素はエンドサイトーシスと細胞内タンパク質高等真核細胞での並べ替えのような基本的な細胞メカニズムを理解する助け細胞科学者を効率的に夢中にさせることができます。医療の観点から、患者に適切な治療ソリューションを見つける、最終的にがん治療のための治療毒素ベース アプリケーションの開発の主要な毒素の人身売買ルートを特定することが重要です同様に。
A のゲノム解析から B 毒素哺乳類細胞における人身売買は、時間がかかり、複雑で高価な A に関するいくつかの研究/酵母モデル生物酵母で B 毒素輸送が行われています。酵母と高等真核生物の細胞のより複雑な根本的な細胞プロセスであるにもかかわらず類似していると酵母で得られた非常に頻繁が哺乳類の状況に転送できます。
ここでは、酵母の RTA の細胞内輸送を分析するための高速かつ使いやすいレポーターアッセイをについて説明します。新しいアッセイの重要な利点は、細胞質に小胞体 (ER) から RTA レトロ-転だけを調査する機会が、むしろエンドサイトーシスと逆行性毒素細胞膜が輸送小胞体に。アッセイ生体内で翻訳後、RTA 毒性緑色蛍光タンパク質 (GFP) の蛍光性の放出を介しての間接測定ができる記者プラスミドを使用しています。RTA は、28 s rRNA depurination によって蛋白質の生合成の開始を効率的にできないため、この試金は、蛍光性の放出で、ホスト細胞タンパク質の同定を変化検出による細胞内の RTA 輸送に関わるでできます。

本稿で説明したプロトコルの一般的なワークフローについては、図 1、ほぼ成功した RTA 浄化と後続の GFP レポーター アッセイ実験のため単一の手順を要約します。プロトコルの個々 の手順の詳細な説明を見つけることが。図 2は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2 a)、空のベクター コントロール (図 2 b) によって成功した RTA 浄化の期待される結果を示します。図 2は、タンパク質のピーク (青) と (ブラウン) 塩溶出ピークの理想的な分離を示す脱塩実験の代表的な結果を示しています。効果的な RTA 浄化は、図 3に Coomassie ステンド SDS のゲルの形で提示されます。最後に、<s...

原稿で人身売買に関与する植物毒素リシン (RTA) のサブユニットは細胞傷害性のプロセスを殺す細胞のコンポーネントを識別するために酵母を用いた蛍光レポーターの試金の使用について述べる。

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

このシンプルな蛍光ベースのレポーターアッセイの全体的な目標は、酵母モデル生物におけるリシン毒素AまたはRTA鎖の適切な輸送に必要な細胞成分をスクリーニングすることです。この方法は、B毒素の活性化におけるリボソームの細胞間輸送に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの場合、原形質膜から細胞体への単純な毒素リシンの細胞傷害性サブユニット。このアッセイの主な利点は、RTA輸送に対する個々の酵母遺伝子の影響を迅速かつ安価に解析できることです。このプロトコルは、テキストプロトコルに詳述されているように、細胞形質転換から開始します。5ミリリットルのLBカナマイシン培地に、RTA発現プラスミドまたは空のベクターを含む細胞を接種します。細胞を摂氏37度、220RPMで24時間インキュベートします。1リットルのLBカナマイシン培地に5ミリリットルのプレカルチャーを補給します。次に、細胞が600ナノメートルの0.8〜1.0の光学密度に達するまで、摂氏37度および220RPMで細胞をインキュベートします。その後、培養温度を摂氏28度に下げます。IPTGを最終濃度1ミリモルに添加することにより、大腸菌のRTA発現を誘導します。摂氏28度および220回転で3.5時間後、10,000gおよび摂氏4度で10分間遠心分離によって細胞を収穫する。次に、ペレットを5ミリリットルの結合緩衝液とペレットで10,000gおよび摂氏4度で10分間洗浄します。洗浄を一度繰り返した後、ペレットを5ミリリットルの結合緩衝液に再懸濁します。15秒のパルスと30秒の休止の5サイクルを使用して、氷上で細胞を超音波処理します。細胞ライケートを21,000gおよび摂氏4度で15分間遠心分離した後、滅菌シリンジフィルターシステムを使用して上清をろ過します。5 ミリリットルのニッケルベースのアフィニティーカラムを備えた自動精製システムを使用して、滅菌ろ過された大腸菌上清から HIS-tagged RTA フラクションを精製します。一般に、1分間に1ミリリットルの暗示速度を使用し、精製システム全体を冷却して、非効率的な毒素結合と毒素活性の損失を防ぎます。アフィニティーカラムを20ミリリットルの結合バッファーで短時間平衡化し、保存バッファーを取り出します。次に、滅菌したろ過した上清をシリンジを使用してアフィニティーカラムに塗布します。25〜35ミリリットルの結合バッファーでカラムを洗浄し、未結合のタンパク質をカラムから除去します。280ナノメートルの紫外線吸収剤が初期紫外線値に近づくまで、洗浄工程を行ってください。次に、結合したRTAフラクションを20〜35ミリリットルの溶出バッファーで溶出し、サンプルを氷上に保ちます。UV、280の値が増加した直後にRTAフラクションサンプリングを開始し、RTAフラクションサンプリングが再び元のベースラインに達したときに停止することが重要です。逃れたRTAフラクションを脱塩するには、精製システムのアフィニティーカラムを脱塩カラムに交換し、カラムを20ミリリットルの0.8モルソルビトールで平衡化します。逃したRTA画分をシリンジでカラムに適用します。カラムを 100 ミリリットルの 0.8 モルソルビトールで洗浄し、UV 吸収が増加し始めたらすぐに、脱塩した RTA 画分を 15 ミリリットルのチューブで希釈します。塩分汚染を避けるために、コンダクタンスが増加したら直接フラクションサンプリングで停止します。Eluded RTAフラクションを摂氏4度で保存します。テキストプロトコルで説明されているように酵母を形質転換した後、各プレートから3つの異なる酵母クローンを選択します。クローンを100ミリリットルのルシンドロップアウトラフィノース培地に220RPMおよび摂氏30度で接種し、600ナノメートルの光学密度が1.0〜2.0になるようにします。細胞を摂氏25度で10, 000gで5分間遠心分離する。細胞を5ミリリットルの滅菌水で2回洗浄した後、細胞を50ミリリットルのスフェロプラスト緩衝液に再懸濁します。50ミリリットルの培養物を100RPMおよび摂氏30度で90分間インキュベートする。400 g、摂氏4度で10分間遠心分離した後、5ミリリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地で細胞を2回洗浄します。次に、同じ培地の5ミリリットルに細胞を再懸濁して、GFPレポーターアッセイの測定に細胞を直接使用します。酵母細胞のスフェロプラストを96ウェルプレートに播種します。各ウェルに、70マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地を加え、ネガティブコントロールを含み、5マイクロモルの最終RTA濃度で空のベクターまたは精製RTAを発現します。70マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウト培地を残りの各ウェルに追加して、総容量を270マイクロリットルにします。タンパク質阻害のポジティブコントロールには、G418が酵母でのGFP発現を防ぐため、70マイクロリットルの0.8モルソルビトール安定化G418溶液を追加します。すぐに30マイクロリットルの安定化ガラクトース溶液を加えて、GFP発現を誘導します。30%ガラクトースの代わりに30マイクロリットルの安定化ルシンドロップアウトラフィノース培地を追加して、追加のネガティブコントロールを準備します。.サンプル調製が終了したら、96ウェルプレートを蛍光リーダーに入れ、GFP蛍光検出に必要な475、509ナノメートルフィルターセットを使用して測定の準備をします。摂氏30度、120RPM、振とう直径1mm、20時間の時間枠で、測定間隔を10分で行います。RTAのアフィニティークロマトグラフィーとエンプティベクターコントロールの代表的な精製グラフを示します。ブラックボックスの青いピークは、バインドされたRTAフラクションを表します。ブラックボックスに示されているように、ネガティブコントロールではカラムからタンパク質が抜けていません。ここに示されているのは、アフィニティー精製されたRTAフラクションの脱塩図です。この図は、RTAタンパク質画分と塩分画の分離を示しています。精製および脱塩が成功した後のクマシー染色の結果は、異なるRTAバリアントの細胞溶解物または精製されたサンプルを示しています。この研究では、未修正のRTAを使用しました。蛍光間隔レポーターアッセイを検証するために、野生型酵母スフェロプラストの相対GFP蛍光を、GFP誘導の20時間後に誘導および非誘導条件下で測定しました。相対GFP蛍光も、RTA、G418、またはネガティブコントロールの存在下で分析しました。また、酵母のRTA輸送に関与するタンパク質と関与しないことが知られているタンパク質が選択された変異体についても、相対的なGFP蛍光を測定しました。点線は有意性のしきい値を表しています。RTAの発現と精製を習得すると、蛍光レポートアッセイの結果は1日で受け取ることができます。さらに、この方法は、リボソームによるB毒素の不活性化の分野の研究者が、真核生物のモデル酵母におけるリボソームの中毒の根源を研究する道を開きます。

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。...

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

出典: Becker, B., 他リシン毒素A連鎖(RTA)輸送に必要な細胞成分を特定するための簡易蛍光基レポーターアッセイ。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオは、大 腸菌...

大腸菌におけるヒスチジンタグ付きリシン毒素の誘導発現 A 鎖

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。...

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

このプロトコルは、同族のGFPレポーターおよびフローサイトメトリーを経由してGFPの発現を刺激するATFS能力を定量化した人工転写因子（ATFS）を迅速に構築するための実験的な手順を説明します。...

迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

タイプIIIの分泌システムを介した宿主細胞へのエフェクターの転座は、グラム陰性菌の間で一般的な病原性戦略です。転座の定量分析のために、β-ラクタマーゼエフェクター融合ベースのアッセイを適用しました。エルシニア感染細胞では、ベータラクタマーゼによるFRETレポーターの変換をレーザー走査型顕微鏡を用いてモニターします。...

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。...

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

このプロトコルでは、蛍光共鳴エネルギー移動し、蛍光寿命イメージングに基づく SNARE...

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

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フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ...

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

学ぶリシン毒素Aの酵母細胞内輸送に必要な細胞成分を蛍光レポーターアッセイでスクリーニングする方法です。個別遺伝子の効果を迅速かつ低コストで解析でき、毒素の細胞内輸送メカニズム解明に貢献します。

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

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