Name: 単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ三次元共培養システムを用いた乳がん細胞と単球の相互作用解析法。ECMEベースの培養環境で免疫細胞動員やコラーゲン分解を評価し、腫瘍微小環境における炎症応答と細胞浸潤メカニズムを解明する。

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この作品は、CONACyT FONSEC SSA、IMSS、ISSSTE プロジェクト号 233061 エセキエル ・ m ・ フエンテス-Pananá、フォンド ・ デ ・ Apoyo 危惧、病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメス (プロジェクト番号 HIM-2014-053) アラカルトにサポートされていました。・ エスピノーザ サンチェス NA は、プログラム ・ デ ・ Doctorado en 芸術 Biomédicas、大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と CONACYT から受信した交わり 231663 から博士課程の学生です。E S NA、また社会保障 (IMSS) のメキシコ協会によって提供される財政支援を認めます。

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<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+%28EGF%29+and+interleukin+%28IL%29-1beta+synergistically+promote+ERK1%2F2-mediated+invasive+breast+ductal+cancer+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion.</a> Mol Cancer. 11, 79(2012).</li>
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<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
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</ol>

著者は、利害の衝突をしていない宣言します。

上皮細胞 3 D 空間構造の成長し、ECM 蛋白質との相互作用は組織の恒常性のため極めて重要です。細胞膜 (2 D) の成長の多くのがん研究に基づいているし、単分子膜が ECM に課す、細胞の特性を要約しない彼らは腫瘍の形成および進行の多くの側面を理解する重要なされているが、インスタンス:増殖、接着依存性細胞の生存、頂基底極性、ECM を改造、細胞分化などを制限します。重要なは、だけでなく、腫瘍細胞と ECM 間の相互作用は癌の進行に欠かせない、腫瘍と非腫瘍性細胞などの免疫細胞の間の通信の確立も。ここで提供されるプロトコル環境内でがん細胞と免疫細胞間の相互作用の理解の促進、ECM によって炎症性応答はこれらの相互作用によって促進される、この炎症性条件を作成する方法、肯定的なループより単球とがん細胞のより多くの侵略を育成します。
ECME を使用しての大きな利点は、様々 な実験的 3 D を実行する適切な生物学的足場モデル22を提供することです。それは、ラミニン、コラーゲン IV、entactin、ヘパラン硫酸プロテオ...

腫瘍生物学は以前考えられていたよりもはるかに複雑です。がん細胞が、単なる一括制御不能な増殖細胞のより多くを示しています証拠むしろ、異なる腫瘍細胞は高い組織と腫瘍1内の階層を表示するさまざまな機能を実行するようです。腫瘍細胞は、細胞の非変形と親密なコミュニケーションも: マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、脂肪細胞、血管内皮細胞は、他のセルの間ですべての没頭している足場蛋白質および ECM を構成する多糖類。多数の直接的および間接的な相互作用は、トランス フォームおよび非変形細胞と疾患の結果2,3以上の強力な影響力を発揮する ECM に確立されます。BrC の特定のケースでは、Tam、4, 再発・転移のリスクを増加させる, 腫瘍の進化に重要な役割を果たすため、Tam が発見されていることを考慮した BrC 細胞のコミュニケーションを分析するが特に重要です。 ,5。
内腫瘍の相互作用とその結果を分析する、新しい 3 Dの in vitroアプローチがはるかに複雑な微小環境を提供する ECM エキスの使用に基づいて開発されているとの比較で、腫瘍生物学の現実に近い従来の単層培養細胞が増えるは、プラスチックに接続されています。ピーターセンとビッセル6提供悪性の最初のモデルと悪性の乳腺上皮細胞ラミニン豊富な基底膜上で培養した悪性の人間を差別する 3 D 脊髄構造を記述する第 1 だった乳腺上皮細胞悪性の対応。10 年後、Debnath、Muthuswamy、によって開発されたモデルとブルージュ7,8,9悪性腺房の中に危険生物学的経路を解明する貴重なツールの提供など制御不能な増殖、腺腔アノイーキス、セル抵抗の結果としての損失と障害細胞の極性形成の証拠としてタイト結合蛋白質の非局在化による大きな腺形成としてプログラムされた細胞死の種類で発生します。付着依存性細胞周囲の ECM から切り離す。Sameni モデル、Jedeszko、スローンは侵襲, 腫瘍悪性腫瘍10、11,12のもう一つの重要な特徴に関連して細胞イメージングのプロテアーゼ活性に焦点を当てています。これらのモデルは異なる蛍光焼蛋白基質と混合タンパク質行列に依存 (DQ ゼラチン、DQ コラーゲン I と DQ コラーゲン IV)、蛍光信号のコラーゲンの分解を示唆しています。3 D モデルは非変形両方の茎セルのプロパティ、セルの集計、また呼ばれる回転楕円体の腫瘍細胞を研究にも使用され、懸濁液または非対称細胞分化のメカニズムに対する尋問 ECM のようなタンパク質では培養することができます。細胞分裂、細胞間付着、細胞運動13,14。浸潤アッセイは、腫瘍の本質的な攻撃性と侵襲的プロセス15中走化性因子として機能する分子の同定をテストできるようにします。全体としては、3 D モデルは、通常、発癌性の組織形態をより密接に反映の in vitro細胞培養の手頃な多様化を表します。
我々 は両方の人間商業 BrC 知られている積極的なポテンシャル (内腔・ トリプル ネガティブ タイプ)、プライマリの細胞ラインを使用して前述のモデル7,10,11に基づく 3 D 細胞培養システムを設計しています。BrC 患者から仔のセルです。我々 はまず非積極的な (MCF-7) または積極的な (MDA-MB-231) BrC 細胞が細胞外マトリックス抽出物 (ECME) U937 単球との共培養モデルを開発-ベースの 3 D システム直接細胞相互作用を許可します。これらの共培養は、一連のがんの積極的な行動に関わる遺伝子の転写に影響を与えたこれら 2 つの細胞系譜の間の通信を決定するために使用されました。1 つの製品、プロスタグランジン E2 (PGE2) 炎症癌の進行に於いての役割を強調表示されます見つける増産と一致するシクロオキシゲナーゼ 2 (COX-2) 成績証明書の大幅な増加が観察されました。MMP の高められたトランスクリプションが積極的な MDA MB 231 細胞共同 DQ コラーゲン IV を含む文化の U937 単球培養したときよりコラーゲン分解と相関が認められました。注記のうち、私たちの共培養したコラーゲン分解の細胞間相互作用メカニズムが必要であると仮定をサポートしていません。むしろ 2 つセル血統間の通信は分泌された分子によって調停されるようお勧めします。さらに、これらの共同培養の試金から収穫される清には13未変換 mcf-10 a の細胞によって形成された腺房を解体可溶性因子が含まれています。積極的なことが分かったし、分泌される主の BrC 細胞単球走化性分子 MCP 1、GM-CSF と RANTES の上昇します。したがって、我々 は細胞が細胞間相互作用を防ぐために細胞文化の挿入に分けられた 3 D 文化概説。これらの文化は、BrC 細胞と単球の間の間接的な通信に対処するために使用されました。これらの試金、非積極的かつ積極的な商業 BrC 細胞と初代の BrC 細胞ひと単球の 3 種類に: 商業 U937 と THP 1 セル、およびプライマリ単球 (PMs) (すべて健康なドナーの末梢血から分離しました。単球は非活性化状態で使用されていた) に使用されました。共同文化の豊かさに炎症性サイトカイン il-1 と IL-8 の濃度の増加が認められました。同様に、MMP 1、MMP-2、および MMP 10 も BrC 細胞単球共培養、およびこうして補強前調査結果14に増加したことがわかった。本稿では、プライマリの BrC 細胞分離および 3 D 培養テストのポイントによってワークフローは代表の結果と一緒に提示されます。この作品は、腫瘍生物学の特定の側面を調査する 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の良い例を構成します。

<table><tbody><tr><td>U937</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC&nbsp;</td><td>CRL-1593.2</td><td>単球性細胞株/組織球性リンパ腫&nbsp;</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC&nbsp;</td><td>TIB-202</td><td>単球性細胞株/急性単球性白血病&nbsp;</td></tr><tr><td>MCF-10A</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC&nbsp;</td><td>CRL-10317</td><td>非形質転換乳房細胞株</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-22</td><td>乳がん細胞株</td></tr><tr><td>T47D</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-133</td><td>乳がん細胞株</td></tr><tr><td>HS578T</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-126</td><td>乳がん細胞株</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection ATCC&nbsp;</td><td>HTB-26</td><td>乳がん細胞株</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11964-092</td><td>4.5 g/L グルコース</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌薬</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>100 U/mL ペニシリン、100 & micro;g / mLストレプトマイシン、および0.25 &micro;g/mL Fungizone</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>馬血清&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA 1X</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X (リン酸緩衝生理食塩水</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15 (1.00mg)</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I1882-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H088-5G</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素 ビブリオ・コレラ</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル&nbsp;</td><td>Corning Inc</td><td>356237</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫、細胞外マトリックス抽出物、-20°Cで保存。Cは4°で使用するまで。C</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>MCP-1</td><td>PeproTech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>PeproTech</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>IL-8</td><td>PeproTech</td><td>200-08</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>ハイセル M&eacute;xico</td><td>541</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェル透過性サポート (インサート)</td><td>Corning Inc</td><td>3422</td><td>直径 6.5 mm、8 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート&nbsp;</td></tr><tr><td>トランズウェル透過性サポート(インサート)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>140620</td><td>6.5 mm直径、0.4 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート&nbsp;</td></tr><tr><td>単球単離キットIIヒト&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-153</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay</td><td>EMD Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td></td></tr><tr><td>Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-072</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek チャンバースライド カバー付き (8まあ)</td><td>ナルゲ・ヌンク・インターナショナル</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底マイクロウェル 35mmペトリ&nbsp;ディッシュ</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ecme)-ベースの三次元システム

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

細胞外マトリックス (ECM) に埋め込まれている正常および腫瘍性上皮細胞は密接に従って大きく正常組織の恒常性と病気の結果に影響を及ぼす造血および非造血細胞と通信します。乳がん、腫瘍関連マクロファージ (Tam)、病気の進行、転移, 再発形式に重要な役割を果たすしたがって、単球より腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互作用のメカニズムを理解することは、病気をコントロールすることが重要です。ここでは、我々 はひと乳癌 (BrC) 細胞およびひと単球の三次元 (3 D) 共培養システムの詳細な説明を提供します。BrC 細胞生産規制活性化の高い基底レベル、通常 T 細胞表現 (RANTES) を分泌、単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (G-CSF)、単球との共培養中炎症性サイトカイン インターロイキン (IL)-1 β (il-1) 及び il-8 はマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-1、MMP 2、MMP 10 と濃縮しました。この腫瘍間質の微小環境推進アノイーキス mcf-10 a 3 D 腺様構造、単球のより、積極的な BrC 細胞の侵入への抵抗です。ここに示すプロトコル内腫瘍通信を勉強する経済的な代替手段を提供、腫瘍に関連する腫瘍生物学の特定の機能を問い合わせるに 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の例侵略。

BrC 細胞三次元培養における形態素解析:
低・高密度 3 D 文化で育つ主の BrC 細胞の形態を 5 日間にわたって調べた。最初の 48 時間の間に、細胞は、ECME に準拠し、低密度を維持します。この時点でそれが明らかに高く評価される細胞がいくつかの 2 つ以上の長い細胞質突起を有すると明らかな細胞間の接触を示すことがなくスピンドル状の細長い形を提示します。5 日間培養後の細胞は彼らの初期の形態を維持しながら増殖。また、彼らは特定の構造組織がなければネットに似た構造を形成、ない接触阻害と積み重ねを表示されます。腺房に似た球状の構造を形作る、未変換 mcf-10 a 細胞との比較が行われました。これらの細胞は、(約 50 μ m) の均一なサイズの丸いよく区切りおよび組織構造の特徴的な形態を表示します。逆に、一次 BrC 細胞共有よく似て積極的 BrC 細胞 MDA-MB-231 (<strong class="x...

ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

このプロトコルの全体的な目標は、三次元共培養システムにおける初代乳がん細胞と単球との間の直接的および間接的なコミュニケーションを研究することです。この方法は、免疫細胞がどのように再評価され活性化されるか、これらの細胞が腫瘍の炎症性微小環境を維持するのにどのように役立つか、これらの微小環境が腫瘍細胞の浸潤をどのように促進するかなど、乳がん分野の炎症性微小環境における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、腫瘍内コミュニケーションを研究するための手頃な価格の代替手段を提供し、腫瘍生物学の特定の特徴を調べるためのin vitroの3D細胞システムの可能性を示していることです。特に腫瘍の侵攻性に関連するもの。まず、10ミリリットルのRPMI1640培地で10〜6番目のU937およびTHP1単球を2回培養し、10%のFBSおよび1%の抗生物質抗真菌剤を補充します。また、サプリメントを添加したDMEMF12培地で新鮮なPMを培養します。加湿された5%の二酸化炭素環境で細胞を摂氏37度でインキュベートします。プレートは、対応する培地のウェルあたり1ミリリットルで5番目の単球に10回4回。各ウェルにインサートを配置し、対応する培地中の5番目のBrC細胞懸濁液に4×10の900マイクロリットルを加えます。加湿した5%の二酸化炭素環境で37°Cで培養物を5日間インキュベートし、上清を回収します。その後の分析が行われる場合は、トリプシン化によって細胞を回収します。個々の細胞培養物とそれぞれの培地のコントロールを含めます。細胞培養前にBrC細胞および単球を市販のクメリンおよびローダミンで標識するには、目的のBrC細胞の2倍10〜6分の1の単層を調製し、標準培地を蛍光色素の十分な予熱済み作業溶液と交換します。細胞を摂氏37度で、加湿した5%の二酸化炭素環境で30分間インキュベートします。次に、色素溶液を吸引し、十分な量のXPBSを使用して細胞を穏やかにすすぎます。PBSを吸引し、標準培地を追加します。細胞をトリプシン化するには、フラスコに2ミリリットルの05%トリプシンと0.48ミリモルEDTAを加え、細胞を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。トリプシン化を止めるために200マイクロリットルのFBSを追加し、サプリメントなしで対応する培地を7ミリリットル追加します。ピペッティングで細胞を再懸濁し、10マイクロリットルの細胞をNuebauerチャンバーに移してカウントします。次に、細胞を430倍のgおよび室温で5分間ペレット化し、上清を廃棄し、3ミリリットルの予熱した蛍光色素作業溶液を使用して細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を摂氏37度で、加湿した5%二酸化炭素環境で30分間インキュベートします。細胞を再度ペレット化した後、色素ワーキング溶液を廃棄し、5〜7ミリ

analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells

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Cancer Research

がん研究

我々は侵襲的な表現型への微小環境に影響を与える進行中の乳房の腫瘍細胞と他の細胞間の相互作用をリアルタイムでライブセルイメージングのための3D共培養モデルを開発しました。これらのモデルは、パラクリン誘起分解、ケモカイン/サイトカインと侵襲性に関与するキナーゼ経路を標的とする薬剤の臨床画面として使用できます。...

腫瘍の4DライブセルイメージングのためのMAMEモデル：微小環境の相互作用に影響を与える悪性進行

簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。...

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

このビデオでは、乳がん細胞と単球の3D共培養について説明し、細胞外マトリックス抽出物(ECME)ベースの環境での相互作用を研究しています。この方法は、コラーゲンの分解、免疫細胞の動員、細胞浸潤などの特定の特徴を研究するのに役立ちます。...

直接相互作用による3D共培養:がん細胞と単球の共培養による相互作用の研究

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。...

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

私たちは、酸素と栄養素を送達するために灌流バイオリアクターシステムを使用して培養できる3D乳がん代理を生成する方法を示します。成長後、代理母体を固定し、目的のパラメータの評価のためにパラフィンに加工します。そのようなパラメータの1つであるセル密度の評価について説明します。...

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド...

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。...

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

このプロトコルは、貯蔵材料を使った原発性ヒト乳房組織を用いて乳癌を研究するためのインビトロ微小生理学的システムの構築を記述する。...

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

学ぶ三次元共培養システムを用いた乳がん細胞と単球の相互作用解析法。ECMEベースの培養環境で免疫細胞動員やコラーゲン分解を評価し、腫瘍微小環境における炎症応答と細胞浸潤メカニズムを解明する。

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

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