単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

このプロトコルの全体的な目標は、三次元共培養システムにおける初代乳がん細胞と単球との間の直接的および間接的なコミュニケーションを研究することです。この方法は、免疫細胞がどのように再評価され活性化されるか、これらの細胞が腫瘍の炎症性微小環境を維持するのにどのように役立つか、これらの微小環境が腫瘍細胞の浸潤をどのように促進するかなど、乳がん分野の炎症性微小環境における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、腫瘍内コミュニケーションを研究するための手頃な価格の代替手段を提供し、腫瘍生物学の特定の特徴を調べるためのin vitroの3D細胞システムの可能性を示していることです。

特に腫瘍の侵攻性に関連するもの。まず、10ミリリットルのRPMI1640培地で10〜6番目のU937およびTHP1単球を2回培養し、10%のFBSおよび1%の抗生物質抗真菌剤を補充します。また、サプリメントを添加したDMEMF12培地で新鮮なPMを培養します。

加湿された5%の二酸化炭素環境で細胞を摂氏37度でインキュベートします。プレートは、対応する培地のウェルあたり1ミリリットルで5番目の単球に10回4回。各ウェルにインサートを配置し、対応する培地中の5番目のBrC細胞懸濁液に4×10の900マイクロリットルを加えます。

加湿した5%の二酸化炭素環境で37°Cで培養物を5日間インキュベートし、上清を回収します。その後の分析が行われる場合は、トリプシン化によって細胞を回収します。個々の細胞培養物とそれぞれの培地のコントロールを含めます。

細胞培養前にBrC細胞および単球を市販のクメリンおよびローダミンで標識するには、目的のBrC細胞の2倍10〜6分の1の単層を調製し、標準培地を蛍光色素の十分な予熱済み作業溶液と交換します。細胞を摂氏37度で、加湿した5%の二酸化炭素環境で30分間インキュベートします。次に、色素溶液を吸引し、十分な量のXPBSを使用して細胞を穏やかにすすぎます。

PBSを吸引し、標準培地を追加します。細胞をトリプシン化するには、フラスコに2ミリリットルの05%トリプシンと0.48ミリモルEDTAを加え、細胞を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。トリプシン化を止めるために200マイクロリットルのFBSを追加し、サプリメントなしで対応する培地を7ミリリットル追加します。

ピペッティングで細胞を再懸濁し、10マイクロリットルの細胞をNuebauerチャンバーに移してカウントします。次に、細胞を430倍のgおよび室温で5分間ペレット化し、上清を廃棄し、3ミリリットルの予熱した蛍光色素作業溶液を使用して細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を摂氏37度で、加湿した5%二酸化炭素環境で30分間インキュベー

細胞を再度ペレット化した後、色素ワーキング溶液を廃棄し、5〜7ミリリットルの1つのXPBSを使用して細胞を穏やかに再懸濁します。次に、細胞をもう一度ペレット化してPBSを廃棄した後、細胞を5〜7ミリリットルの標準培地に再懸濁します。細胞懸濁液を10マイクロリットル数えます。

ウェルの底に十分なECMEを広げて、4ウェルチャンバースライドシステムの各ウェルに均一な層を形成することにより、共培養を設定します。ウェルあたり5回10〜5番目の標識BrC細胞を含む単一細胞懸濁液の20マイクロリットルをプレートします。摂氏37度で15〜20分後、60%ECMEを添加したアッセイ培地80マイクロリットル中の5番目の標識単球に2.5×10の懸濁液を加えます。

ECMEを摂氏37度で15〜20分間固化させます。次に、BrC細胞と単球培養培地の1対1の混合物を1ミリリットル加えます。加湿した5%の二酸化炭素環境で摂氏37度の共培養物を24時間、48時間、または5日間インキュベートして、さまざまな時点での変化を追跡します。

ECMタンパク質を分解し、培養物から細胞を回収するには、培地を吸引して廃棄し、0.1%のトリプシンと0.25%のEDTAを含む0.5ミリリットルの1つのXPBSを培養物に加えます。細胞を摂氏37度で3時間インキュベートします。インキュベーション後、10%のFBSを含む1つのXPBSを0.5ミリリットル加えてトリプシンを中和し、激しくピペッティングして細胞を再懸濁して単一細胞懸濁液にします。

細胞をペレット化した後、上清を廃棄し、10%のFBSを含む1つのXPBSの5ミリリットルに細胞を再懸濁します。この手順を一度繰り返します。セル懸濁液を適切な装置でファックスします。

最終母集団の純度が95%以上であることを確認してください。8ウェルチャンバースライドシステムの各ウェルに、40マイクロリットルのECMEベースを広げ、摂氏37度で30分間固化させます。テキストプロトコルに従って、400マイクロリットルの補充されたDMEM F12培地中のウェルあたり800 MCF10 A細胞を播種します。

次に、400マイクロリットルの馴化培地または補充されたDMEM F12培地に、ヒト組換えIL1ベータの1ミリリットルあたり20ナノグラムを加えます。チャンバースライドを、2ミリリットルのPBSで満たされた35ミリリットルのペトリ皿が入ったガラスのペトリ皿に入れます。MCF 10A細胞は、ECMEの基部の損傷を防ぎ、細胞が沈降してモノリーを形成するのを防ぐために、各ウェルに非常にゆっくりと播種する必要があります。

光学顕微鏡を使用して、14日間、24時間ごとに腺房形成を記録します。14日間の培養後、100マイクロリットルの100ナノモルダピーを1つのXPBSに加え、サンプルを室温で25分間絶えず攪拌しながらインキュベートします。室温で1つのXPBSでサンプルを5分間、絶えず攪拌しながら3回すすぎます。

蛍光染色専用の封入剤を使用して、調製物を封入します。次に、マウントされたサンプルを透明なポリッシュで密封し、スライドを4°Cの光から保護して維持します。共焦点顕微鏡での手順のデモンストレーションは、国立先端顕微鏡研究所の研究者であるVadim Perez氏です。

共焦点顕微鏡でアシニを分析し、アシニのさまざまな深さで横方向のスタックの画像を撮影します。適切な染色プロトコルにより、腺房内のさまざまな細胞タンパク質を可視化します。例えば、ここでカヘレンを染色して、細胞間接着、細胞極性、およびオラリメン形成を評価しました。

低密度および高密度の3D培養で増殖した初代BrC細胞の形態を5日間にわたって研究しました。最初の48時間で、細胞は細長い紡錘形でECMEに接着し、5日後にはニット状の構造を形成します。3D共培養で5日間行った後、MCF7細胞とMDA-MB-231市販のBrC細胞の両方が無秩序な凝集体を形成しました。

ただし、アグレッシブなMDA-MB-231細胞は細長い形状の凝集体に対して、非アグレッシブなMCF7細胞はMDA-MB-231細胞よりも高密度に圧縮された丸みを帯びた形状の凝集体に対して使用します。間接相互作用の3D初代BrC培養物と初代単球との5日間の共培養からの上清を採取しました。IL1βおよびIL8の有意な上昇は、初代BrC細胞単球共培養で観察されました。

以前に悪性の進行と関連していた重要なサイトカインと可燃性サイトカインの両方。MCF10A細胞は、2つの初代BrC細胞株から2つの異なる上清を用いて培養し、アノキキに対する耐性の尺度として内腔形成を観察しました。標準的な条件下で増殖したMCF10A細胞とは異なり、14日目のバイコンフォーカル顕微鏡では、スフェロイドの横方向の切り傷により、MCF10A細胞が腺房の中央細胞の数を数えることによって測定されたアノイキスを回避したことが示されています。

この手順に続いて、追加の質問に答えるために、医療分析などの他の方法を実行できます。両方のがんの移動におけるシグナル伝達経路をテストします。この技術の開発後、腫瘍微小環境の分野の研究者が、乳がん細胞と質量細胞、線維芽細胞、ニュートロフィル、さらには腫瘍細胞のさまざまなクローンとの3D共培養システムにおけるコミュニケーションを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、腫瘍微小環境をモデル化するための3D培養システムを確立する方法について十分に理解できるはずです。