植物実験室で測定した表面への細菌の付着

この手順の全体的な目標は、植物の表面への細菌の結合を測定することです。この方法は、植物病理学と食品安全の両方における重要な質問に答えることができます。特に、バクテリアが植物の表面にどのように結合し、どのようにバクテリアを取り除くことができるかについての質問に答えることができます。

この手法の主な利点は、簡単、迅速、安価であることです。水中で育てた苗を準備するには、30、50、100、または150ミリリットルのガラスビーカーに少量の種子を入れます。ここではトマトの種が使われています。

種子を80%エタノールで覆い、短く渦巻きます。次に、種を1分間浸します。エタノールを注ぎ、種子を50%の市販の漂白剤と0.1%のTriton X-100と水道水の溶液に浸します。

種子が豆の種のように大きい場合は、種子を20分以上浸します。漂白剤の混合物を注ぎ、種子を滅菌水で3回洗い、洗うたびに種子を水に1分間浸します。種子と少量の水を滅菌ペトリ皿に注ぎ、苗が1センチメートルから10センチメートルの間の目的のサイズに達するまで、種子を暗闇でインキュベー

砂で育てた種子や苗を準備するには、種子と植え付け材料を滅菌した後、テキストプロトコルに従って種子または苗にバクテリアを接種します。滅菌ガラス棒を使用して、種子を表面の下に置くのに十分な深さの砂に浅い穴を開けます。穴に種を入れ、薄い砂の層で覆います。

次に、シーリングフィルムを使用して容器の上部をシールし、水の損失や追加の微生物の侵入を防ぎます。植物は、実験室で光の下で、または温室で、植物の種類や種類に適した温度と日の長さで育てます。砂に苗を植えます。

滅菌ガラス棒を使用して穴を開けます。次に、滅菌済みのステンレス鋼のかぎ針編みのフックを使用して、根を慎重に穴に導き、砂を使用して穴の側面を埋めます。テキストプロトコルに従って植物をバクテリアとインキュベートした後、顕微鏡スライド上の水滴またはインキュベーション培地にサンプルを一滴入れて顕微鏡観察用のサンプルを調製し、直接観察します。

目に見える遊離細菌がない場合は、インキュベーションが行われた容器に細菌が死滅したか、細菌が結合した可能性があります。サンプルを水またはインキュベーション培地で洗浄するには、サンプルを液体の入ったバイアルに入れ、バイアルを静かに反転させます。次に、サンプルを顕微鏡スライド上に新鮮な液体に入れて観察します。

サンプルの取り付けには、通常のカバースリップを使用します。サンプルが厚く膨らんでいる場合は、液体とサンプルをプレスのウェルに加え、端にゴムまたはプラスチックのリングがあるカバースリップを塗布します。スライドを上に置き、軽く押し下げてカバースリップをスライドに密封します。

スライドを反転させてサンプルを調べます。あるいは、藻類計数スライドとカバースリップを同様の方法で使用し、20倍以下の倍率で表示します。砂で育てられた植物に見つかった生存細菌の数を決定するには、まず容器の上部と下部からシーリング材を取り除きます。

容器を滅菌紙の上に置き、容器を表面にそっとたたき、砂をほぐしてから、植物と一緒に砂を容器からそっと持ち上げます。砂の円柱と植物が紙の上で自由になったら、砂を真ん中で分割して植物の根を明らかにします。必要に応じて、コンテナの端近くと根元の近くから砂のサンプルを採取します。

これは、細菌の拡散、蓄積、および増殖を決定するのに役立つ場合があります。根を拾い上げ、根を測定された量の水または緩衝液に浸し、静かに振ることにより、緩く付着している砂やバクテリアを取り除きます。得られた懸濁液中の細菌の生存細胞数を、ルリア寒天培地などの適切な培地にプレーティングすることにより

これは、根にゆるやかに関連付けられている細菌の数を表します。最後に、超音波処理によってしっかりと結合した細菌を取り除き、それらの数を決定します。このグラフは、2つの異なるセルロースマイナス突然変異が、トマトの根にコロニーを形成する細菌の能力に及ぼす影響を示しています。

一部の測定値の標準偏差は10の0.9logベースと高かったが、セルロースマイナス変異体の結合の減少は明らかに明らかである。この実験では、様々なエキソ多糖を作れない変異体において、野生型大腸菌0157:H7のアルファルファ芽への結合を測定しました。どちらの株でも、ポリベータワン6グルクロン酸(PGA)の産生は、病原性大腸菌の植物表面への結合に最も大きく寄与しているように見えました。

コラン酸も結合に重要な役割を果たしました。ここでは、植物の表面に結合できない2つの細菌株を操作してPGAを生成し、トマトの根に細菌が結合するのに十分かどうかを判断するためにPGAを生成しました。A.tumefaciens A1045の場合、PGAにより細菌が根の表面に個別に結合しました。

一方、S.melilotiは大きなクラスターに結合し、少数の細菌のみが根に直接付着し、大多数の細菌が他の細菌に付着していました。一度習得すると、この技術は、初期セットアップとインキュベーション時間、およびサンプルによって異なりますが、10分から1時間のスコアリング時間で1時間未満で実行できます。この手順を試みる際には、バクテリアがほとんどすべての表面に付着する可能性があることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、バクテリアの植物表面への結合を観察する方法をよく理解しているはずです。植物のどこにバクテリアが結合するか、結合するバクテリアの数を決定します。これらの手順を人間の病原体に対して行うと、手順は非常に危険である可能性があるため、封じ込めフードでの作業や手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。