Name: 植物実験室で測定した表面への細菌の付着 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶ植物表面への細菌付着測定法。根や新芽を用いた簡便で迅速な手法で、植物病理学と食品安全の研究に有用です。顕微鏡観察と生存細胞計数で細菌の結合を評価します。

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著者は、実験のいくつかの援助のための数字は、カミーユ ・ マルタンとヒラリー ・ Samagaio の準備のためのスーザン ホイット フィールドを感謝します。

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
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</ol>

著者は、競合する金融興味も持っていないこと彼女を宣言します。

実験中に細菌が付着することが表面のすべてを認識することが重要です。生菌が行われる場合、ガラスにバインドすることができる細菌が過小評価される従ってガラス管、ピペットを使用します。寒天培地または土壌と寒天のいくつかの植物は育つ土壌が植物に残っている場合、細菌は植物ではなく、付着した材料にバインドできます。その一方で、根、特に植物の表面を洗浄取り外せます自然表面コーティングなど粘膜付着テストの結果をこのように変更と。
特定の細菌培養混合物に追加が実験中に生きているままにすることが重要です。こうして無料として接続されている細菌の生菌は日常的に行われなければなりません。いくつかの治療法や細菌の突然変異は細菌の増殖率を減らすまたは実際に細菌の人口のごく一部の死を引き起こす可能性があります。特別な汚れを使用しない限り、ライブとデッド細菌を顕微鏡で区別できない場合があります。生きている細菌から染料の排除によって決まるライブ/デッド細菌の有用な染色キットです。しかし、菌種の混合された人口が存在する場合、関心の種の生菌数は孵化がバクテリアの死で起因したかどうかを決定する最も簡単な方法をする可能性があります。
培地成分は細菌の生存と成長に影響を及ぼします。傷から解放され、サイトをカットの根滲出液等ささやかな細菌の成長をサポートするための基板を提供します。リン酸・窒素・鉄は、これらの条件で制限される傾向にあります。カルシウムやマグネシウムなどの 2価陽イオン接着に影響を与える可能性があります。いくつかのケースで密着性に影響を及ぼす炭素源。pH も重要であります。一般に根圏 pH は 5.5 と 6.5 の間です。
付いている抗生の抵抗細菌を使用して注意が必要です。最も頻繁に使用される抗生物質リファンピシン ・ ナリジクス酸であります。これらの抗生物質への抵抗は一般に染色体の遺伝子の突然変異 (RNA ポリメラーゼとジャイレース、それぞれ) 従って、簡単に別の負担に孵化の間に転送することはできません。また抵抗のこのタイプは劣化や抗生物質の変更されません。他の細菌にプラスミドを転送できない場合を除き、プラスミド由来の遺伝子マーカーを持つ細菌をマーキングはお勧めしません。抗生物質感受性菌は耐性菌に近いある場合抗生物質プレートに成長することはできなくなりますので、抗生剤の劣化や化学修飾による抗生の抵抗にはなりません。
このペーパーで説明する方法は、サンプルが (たとえば、実験人間の病原体を含む) に格納する必要があります小さなサンプル サイズや実験に適しています。(100 g の材料または 50 以上の植物) の上の大きいサンプルの大きさのため他の方法またはこれらの方法の抜本的な変更になります必要な10,19,32,19,33,34,35,36. 多数研究されている種以外の微生物の存在も重大問題が発生することができます。可能な解決策には手順 6.1.2 および 7.3 蛍光タンパク質や抗生物質耐性付いて細菌の使用が含まれます。しかし、関心の菌は他の微生物の大規模な人口で稀な個人これらのマーカーは研究されている細菌の数の明確な評価を許可するように適切なできません。
すべてのここで説明した方法は実験室ベースの方法です。マイナーな修正温室効果研究のため必要になります。大きな変更は、原生動物、昆虫および他の動物の捕食と気候の変化が実験のための定義された条件の規定を複雑にフィールド調査に必要可能性があります。将来的にこれらのメソッドは、植物の表面に 2 つ以上の微生物の相互作用を含むように拡張可能性があります。

植物表面に細菌の結合の測定は、3 つの異なる状況で重要になりました。最初の状況は、植物表面1,2,3の人間の病原体の感染の検査です。削除または、バインドされた細菌を殺す細菌を防ぐためには、ここでの目標とこの植物材料によって病気の伝達を減らすため。2 番目の状況は、植物の表面4の植物病原体結合の検討です。もう一度ここでの目標はようにバインディングを削除またはバインドされた細菌を殺すとこの病気を減らすために。3 番目の状況は、共生または植物成長促進菌5,6の結合の検討です。ここでの目標はバインドとこうして増加植物の健康および作物に細菌を促進するために得られます。
この資料に記載されている表面を植物に細菌のバインディングの測定方法は、安価、比較的実施しやすい。唯一の要件は、顕微鏡と細菌学の研究室で一般に見つけられる材料に。いくつかのテクニックお風呂超音波発生装置が便利です。説明する手法は、実験の結果, 比較的小さなサンプル サイズを使用してバインドするため設計されています。結合量の測定は、温室やフィールドでの使用のためのこれらのテクニックの一部を変更することがありますが、研究室で作られています。
これらのテクニックは、根、もやし、カット葉細菌バインディング、カット フルーツ、および研究室7,8,9,10、11でそのままチェリー トマトを測定に使用されています。 12,13,14,15。彼らは土壌で育つ植物の根を植民地化を測定または研究室16で砂にも使用されています。テクニックなどアグロバクテリウム、ダイズ法、大腸菌、サルモネラ、 緑膿菌の fluorescens細菌の多くの種に使用されています。(2012 年)17モートンとフュークワA. 根頭がんしゅ病菌の表面との相互作用を評価する方法の有用な説明を見つけることが。すべてのケースで関係のサンプル サイズが小さく、一般的に未満 25 50 植物。説明する手法は、実験中に含まれている保持する必要がある人間の病原体で使用に適しています。

<table><tbody><tr><td>光学顕微鏡</td><td></td><td>N/A</td><td>位相差またはノマルスキー光学系が有用ですが、蛍光マーカーを使用した研究には蛍光顕微鏡が必要です。</td></tr><tr><td>種子</td><td>any&nbsp;</td><td>N / A</td><td>種子のロット番号と栽培品種</td></tr><tr><td>の漂白剤</td>をメモします <td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>バスソニケーター</td> 任意の<td>科学供給会社</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>、Triton X-100</td>、<td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>、栄養寒天&nbsp;</td><td>ディフコ&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>ソイトーン</td><td>ディフコ&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr>砂、<tr><td></td><td>海砂、フィッシャーサイエンティフィック</td><td>、S25</td><td></td></tr><tr><td>砂</td><td>&nbsp;シグマ・アルドリッチ</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>コネテーナー</td><td>Stuewe &サンズ株式会社</td><td>Ray-Leachコーンテイナーは</td><td></td></tr>、<tr><td>パラフィルム</td><td>任意の科学供給会社</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>MS塩シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機<td>任意の科学会社</td><td>N / A</td>は<td>、ほとんどの細菌をペレット化するために任意の科学会社N / Aは、10,000 XGの最大力を持つ小さな遠心分離機のみ</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>任意の科学企業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロメーター</td><td>ACCU-SCOPE アクセサリー</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>セジウィック-ラフター カウントセル</td><td>ハウザーサイエンティフィック</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>プローブクリップ プレスシール インキュベーキンチャンバー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ナラジキシシン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>生/死染色</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

本稿では、光学顕微鏡では生菌を使用して無菌植物の表面に細菌の結合を測定する方法について説明します。使用される植物材料ではカット フルーツなど、根、芽、葉。説明する方法は安価な簡単に、そして小さなサンプル サイズに適しています。バインディングは実験室で測定、様々 なインキュベーション メディアや条件を使用できます。阻害薬の効果を判断できます。促進・抑制結合の状況も評価することができます。いくつかのケースで様々 な条件は植物や細菌に対する彼らの効果のために主にバインディングを変更するかどうかを区別することが可能です。

A. 根頭がんしゅ病菌の根面を定着します。セルロース合成を防ぐ細菌の突然変異の効果があったセルロースの細菌の生産は、ルートの植民地化の役割を果たしている、かどうかを決定するために16を検討しました。手順 1.3 および 7.1 技術が使用されました。トマトの種は表面滅菌し、滅菌水で発芽させた.根が約 2 cm 長い 1 mL あたり 10 の5菌懸濁液中に浸漬され、容器に殺菌土壌に植えられました。植物は、12 時間ライト/12 h 暗いサイクルに 25 ° C で 14 日間栽培しました。植物回示された後、コンテナーから削除されました。根は洗浄され、バインドされた細菌を除去する風呂超音波発生装置で超音波処理します。生菌を使用して細菌数を調べた。図 2は、トマトの根を植民地化する細菌の機能に 2 つの異なるセルロース マイナスの突然変異の効果を示します。いくつかの測定値の標準偏差が 0.9 ログ10 (測定のこのタイプの共通の問題) 高セルロース マイナス変異体の結合の減少は明らかであると結論付けることができます細菌の生産セルロースは、トマトの根の定着・増殖における細菌を支援します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> 図 2: 野生型およびセルロース マイナス変異A. 根頭がんしゅ病菌による植民地化のルートします。ログ10トマトの根から回収 cm 根長当たりの細菌数を接種した野生型A. 根頭がんしゅ病菌系統 c58 形とセルロース マイナス変異体 C58:1 と C58:A60。内の数値は、最低 4 つの独立した実験から手段です。バーは、平均の標準偏差を表します。根は、mL の 1 分あたり 105菌懸濁液でそれらを浸すことを接種しました。コンテナーで栽培した、緩く付着性細菌がガラス瓶でバッファーを洗浄の根を洗浄することにより除去しました。しっかりと付着性細菌はお風呂超音波発生装置およびめっき生菌数16を決定する結果の懸濁液を使用して削除されました。この図は、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズと McMahan から変更されています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
エシェリヒア属大腸菌およびアルファルファもやしに他の細菌の結合において細胞外多糖類の役割を検討しました。E. 大腸菌o157: h7 による下痢症のいくつかの発生は、汚染されたアルファルファもやしに追跡されています。野生型細菌と変異体の様々 な細胞外多糖類をすることができないのバインディングは、1.1、5.1、および 7.2 の手順で説明する方法を用いて測定しました。アルファルファもやしは表面殺菌し、暗闇の中 25 ° C で滅菌水で 1 日発芽しました。添付種皮を持つ 4 つの芽は、5 mL の水を含む滅菌プラスチック皿に置かれました。ルリアスープで増殖する細菌は、3 mL あたり約 5 x 10 の最終的な集中に追加されました。3 日間の暗闇の中 25 ° C で培養接種のもやし。もやしは積極的な逆解析によるバイアル 5 mL の滅菌水で 2 回洗浄され、モーター駆動のテフロン ガラス ホモジナイザーを使用してバッファーを洗浄で均質化されました。以前実験で細菌が表面の細菌は簡単にみに内面化された細菌を示さなかった GFP 遺伝子を運ぶプラスミッド付けられます。結果は表 1のとおりです。E. 大腸菌o157: h7 の 2 系統を調べた。両系統のポリ-β-1, 6-グルクロン ポリマーポリ グルタミン酸の生産は、植物表面に病原性大腸菌のバインディングに対して最大の貢献をするのに見えた。大腸酸結合に重要な役割を果たしました。セルロース マイナス変異体の結合の低減は重要なそれは他の 2 つの多糖類は、大きなでした。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">もやしと開いた種皮にバインドの E. 大腸菌 o157: h7 の体外生産遺伝子の突然変異の効果</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">菌株</td>
			<td rowspan="2">突然変異または遺伝子型 (関連する表現型)</td>
			<td colspan="2">10芽や種子コートごとに区切られる細菌数をログに記録します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>アルファルファもやしb
</td>
			<td>開いている種皮</td>
		</tr>
<tr>
<td>86 24</td>
			<td>どれも (野生型)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN(セルロース-マイナス)</td>
			<td>2.9 ± 0.7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 C</td>
			<td>
wcaD(大腸酸マイナス)</td>
			<td>1.8 ± 0.7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 P</td>
			<td>
pgaC(PGA マイナス)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>どれも (野生型)</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN(セルロース-マイナス)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD(大腸酸マイナス)</td>
			<td>3.9 ± 0.5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC(PGA マイナス)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0.7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">細菌の数 (ログ10) の 3 つの測定値の最小値の平均 ± 標準偏差は、3 日後にバインドされています。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b もやしは、測定前に洗浄しました。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">野生型と大きく異なる c: P &lt; 0.01。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">野生型と大きく異なる d: P &lt; 0.05。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">このテーブルは、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズ、マハラシュトラ、Mishra、トーレス10から変更されています。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 結合に対する体外生産遺伝子の突然変異の効果エシェリヒア属大腸菌 o157: h7 にもやし。メソッドを使用してさまざまな細胞外多糖類および病原性の結合のリポ多糖の役割を決定するためにアルファルファもやし、もやしとオープンの種皮には、突然変異体の一連のバインディングにエシェリヒア属大腸菌o157: h7 株を検討しました。手順 6 で説明します。結果、そのポリ-β-1, 6 -N-アセチル-D-グルコサミン (PGA) はもやしにバインドするために不可欠であるとし、セルロース、colanic 酸、エシェリヒア属大腸菌O157 の最大のバインディングが必要です。このテーブルは、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズ、マハラシュトラ、Mishra、トーレス10から変更されています。
生産がないと思います 2 つの異なる細菌導入された PGA 生産は植物の表面、PGA に必要な遺伝子を符号化するクローンとして作られたオペロンを運ぶプラスミド (pMM11) に細菌の結合を引き起こすに十分なかどうかを決定するために通常トマト根10にバインドすることができます。A. 根頭がんしゅ病菌A1045 野生型株 1, 繰返し β-2 グルカンを作るが失敗し、また植物の表面29のバインドに失敗する c58 形のミュータントであります。ダイズ トリプトフアン1021 アルファルファの根粒を形成する非まめ科植物のバインドに失敗トマト12を含みます。1.1、5.1、7.1 6.3 の手順で説明する方法は、PGA を一般的にすることが根面細菌のバインディングを増加したかどうかを決定するために使用されました。トマトの種は表面滅菌し、滅菌水で発芽させた.根セグメント 1 cm の長さにカットされ、滅菌水に入れるし、細菌を接種しました。細菌のこれらの 2 つの種は、異なるレートで成長、バインディングは細菌の増殖のほぼ等しい量を可能にする異なる時に測定されました。プラスミド pMM11 の存在は、種 (表 2)10両の連結の細菌数のような大幅な増加を発生します。バインディングの大幅な増加はまた光学顕微鏡で見られたが、バインドされた (図 3) の 2 つの種の非常に異なる。A. 根頭がんしゅ病菌A1045 個々 の細菌として根面にバインドします。S. 法だけで細菌数直接ルートに接続しているし、細菌の大半は、他の細菌に取り付けられていた、大規模なクラスターでバインドします。この例では、顕微鏡観察を含めずにバインドされている細菌の数を解析するだけで実験の結果の誤った印象を与えることができます。両方の方法 (生菌と顕微鏡観察) 表示その pMM11 増加したトマトの根に細菌のバインディングが、PGA の生産による結合型 2 つの細菌種は、10の異なるだった
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">トマトの根にはバクテリアのバインドにプラスミド pMM11 の効果</td>
		</tr>
<tr>
<td>菌株</td>
			<td>プラスミド</td>
			<td>Mm ルートごとに区切られる細菌の数</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. 根頭がんしゅ病菌 A1045、
</td>
			<td>どれも</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (ベクトル)</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 合成)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. 法 1021b
</td>
			<td>どれも</td>
			<td>検出なし</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (ベクトル)</td>
			<td>検出なし</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 合成)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 × 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2 時間後に測定した細菌のバインディング</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b 細菌は 18 時間後測定</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">このテーブルは、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズ、マハラシュトラ、Mishra、トーレス10から変更されています。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: のバインドで PGA の合成のための遺伝子を運ぶプラスミッドの効果A. 根頭がんしゅ病菌 A1045 と s. トリプトフアントマト ルート セグメントに 1021。ポリ-β-1, 6 - の能力を調査するためにN-アセチル-D-グルコサミン (PGA) 植物に細菌の結合を促進するために根をプラント関連細菌の 2 つの系統のバインディングの PGA (pMM11) を作成する機能を付与プラスミドの効果トマトの根を調べた。細菌のどちらのひずみは、PGA 合成 (pBBR1mcs) をコードしている遺伝子なしプラスミッドまたはプラスミッドの存在下での不在でトマトの根に重要な結合を示した。PGA 合成遺伝子を運ぶプラスミッドの添加は、両タイプの細菌による結合を増加しました。A. 根頭がんしゅ病菌はS. 法の測定A. 根頭がんしゅ病菌の培養の 2 h と 18 h の後米トリプトフアンバインディングよりも速く育ちます。使用方法は、手順 7 で記述されていません。このテーブルは、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズ、マハラシュトラ、Mishra、トーレス10から変更されています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> 図 3: A. 根頭がんしゅ病菌A1045 のS. 法1021 トマト根における根毛にバインディングの PGA 生合成遺伝子を運ぶプラスミド pMM11 の効果です。A のトマト根における根毛にバインド) A. 根頭がんしゅ病菌A1045、B) A. 根頭がんしゅ病菌A1045 pMM11、C) S. 法1021 と D) S. 法1021 pMM11。2 つの菌種の結合の増加はほぼ同じような光学顕微鏡で見られるようにバインドの詳細はかなり異なっています。使用方法は、手順 6 で記述されていません。この図は、タイトル後、プロボクサービクトリービッグスプロットアイズ、マハラシュトラ、Mishra、トーレス10から変更されています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
細菌の特定の相互作用の植物の貢献を区別することを支援する非生物学的表面へのバインドを使用することができることがあります。A. 根頭がんしゅ病菌の単極の polysaccharide(UPP) は、両方の生物と非生物の表面の30のさまざまな細菌の結合を仲介することができるように示されています。カルシウムは、植物表面 UPP28によって仲介するA. 根頭がんしゅ病菌の結合を阻害する観察されました。植物の表面に細菌のバインディングのカルシウム イオンによる阻害がを細菌や植物の表面効果のためかどうかを決定するためにナイロン スレッドへの細菌のバインディングを検討しました。ステップでのテクニック 8.2 が使用されました。トマトの種は表面殺菌し、手順 1 で説明した水で発芽させた.細菌がスクロース最小培地で栽培され、手順 5.1 で説明したトマトの根または約 105/mL の最終的な集中でナイロン スレッドに追加します。トマトの根とナイロン スレッドに細菌の結合に及ぼす追加 CaCl2を顕微鏡で調べた。図 4はカルシウムか表面ことを示唆するカルシウムの効果は、主に細菌の10を使用してバインドのような抑制を示しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> 図 4: トマト根における根毛とナイロン スレッドA. 根頭がんしゅ病菌の結合に及ぼすカルシウム。A. 根頭がんしゅ病菌は培養トマトの根 (A と B) と 24 h のナイロン スレッド (C と D)、1:10 MS の塩と、1:20 の希釈 AB 最小媒体、0.4% ショ糖 (A、C) または、1:10 の希釈 MS 塩と 1:20 の希釈 AB 最小培地の希釈、0.4% ショ糖を含む 60 mM CaCl2 (B、D) の31。追加 CaCl2根とナイロン スレッド抑制は主に植物の表面ではなく、細菌に影響を与えるのためであったことを示唆している両方に細菌を抑制しました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

測定し、特に根や芽、植物に細菌の付着を特徴付けるのための簡単な方法は、この資料に記載されています。

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

この手順の全般的な目的は、植物表面への細菌の結合を観察および測定することです。この手法は、植物病理学と食品安全性の両方における重要な疑問に答えることができます。特に、細菌がどのように植物表面に結合し、どのように除去できるかという疑問を解決することが可能です。この手法の主な利点は、簡便で迅速であり、費用もかからないことです。水耕苗を準備するには、少量の種子を30、50、100、または150 milliliterのガラスビーカーに入れます。ここではトマトの種子を使用しています。種子を80%エタノールで覆い、軽く回して混ぜます。そのまま1分間浸漬させます。エタノールを捨て、50%市販漂白剤、0.1%Triton X-100、および水道水の混合溶液に種子を浸します。種子を20分間浸漬させます。豆などの大きな種子の場合は、さらに時間を延ばしてください。漂白剤混合液を捨て、滅菌水で種子を3回洗浄します。この際、1回につき1分間、種子を水に浸してください。種子と少量の水を滅菌シャーレに移し、苗が1 cmから10 cmの目的の大きさに達するまで、暗所でインキュベートします。砂で栽培する種子または苗を準備するために、種子および植材を滅菌した後、本文のプロトコルに従って種子または苗に細菌を接種します。滅菌済みのガラス棒を用いて、種子を表面下に配置するのに十分な深さの浅い穴を砂に作ります。穴に種子を置き、薄い砂の層で覆います。次に、水分の蒸発および外部からの微生物の侵入を防ぐため、シーリングフィルムを用いて容器の上部を密封します。植物を研究室のライト下、または温室において、その植物の種および品種に適した温度と日長条件下で育成します。苗を砂に植え付けます。滅菌済みのガラス棒を用いて穴を開けます。次に、滅菌済みのステンレス製かぎ針を使用して、根を慎重に穴へと誘導し、穴の側面に砂を充填します。テキストのプロトコルに従って植物を細菌とともに培養した後、顕微鏡スライド上の水滴または培養培地に試料を置き、直接観察して顕微鏡観察用のサンプルを調製します。遊離した細菌が視認できない場合、細菌が死滅したか、あるいはインキュベーションに使用した容器に細菌が付着した可能性があります。サンプルを液体が入ったバイアルに入れ、バイアルを静かに反転させて、水またはインキュベーション培地で洗浄してください。その後、サンプルを新しい液体とともに顕微鏡スライドに載せて観察します。サンプルの封入には、一般的なカバーガラスを使用してください。サンプルが厚く盛り上がる場合は、縁にゴムまたはプラスチックのリングが付いたプレス用カバーガラスのウェルに液体とサンプルを注入します。その上にスライドガラスを配置し、ゆっくりと押し下げてカバーガラスをスライドガラスに密着させて封止してください。スライドを反転させてサンプルを観察します。あるいは、同様の方法で藻類計数用スライドとカバーガラスを使用し、20倍以下の倍率で観察してください。砂で栽培した植物に見られる生存細菌数を決定するには、まず容器の上下にある封止材を取り除きます。容器を滅菌紙の上に置き、容器を軽く叩いて砂を緩めてから、植物と一緒に砂を容器からゆっくりと持ち上げます。砂の円柱と植物が紙の上に自由になったら、砂を中央で割って植物の根を露出させます。必要に応じて、根の付近だけでなく、容器の端に近い場所からも砂のサンプルを採取してください。これは、細菌の拡散、蓄積、および増殖を決定するのに有用である可能性があります。根を取り出し、規定量の水または緩衝液に根を浸して静かに振ることで、緩く付着している砂と細菌を除去します。得られた懸濁液をLuriaアガーなどの適切な培地に塗布し、細菌の生存細胞数を測定します。これは根に緩く結合している細菌数を示しています。最後に、超音波処理によって強固に結合した細菌を除去し、その数を測定します。このグラフは、2種類の異なるセルロースマイナス変異が、細菌のトマト根への定着能に及ぼす影響を示しています。一部の測定値の標準偏差は0.9 log₁₀に達しましたが、セルロース欠損変異株における結合能の低下は明らかに認められました。本実験では、様々な菌外多糖を合成できない変異株を用いて、野生型 E.coli O157:H7 のアルファルファ発芽苗への結合能を測定しました。両菌株において、ポリ-β-1,6-グルクロン酸（PGA）の産生が、病原性 E.coli の植物表面への結合に最も大きく寄与していると考えられました。コラニック酸も結合において重要な役割を果たしました。ここでは、植物表面に結合できない2つの細菌株を用いてPGAを産生するように遺伝子操作を行い、PGAがトマトの根への細菌結合を誘発するのに十分であるかを確認しました。A.tumefaciens A1045の場合、PGAによって細菌が根の表面に個別に結合することが示されました。一方で、S.melilotiは大きなクラスターを形成して結合しており、根に直接付着している細菌はわずかであり、大部分の細菌は他の細菌に付着していました。この手法に習熟すれば、初期セットアップに1時間未満、さらにインキュベーション時間を加え、サンプルに応じて10分から1時間のスコアリング時間で完了させることができます。この手順を行う際は、細菌がほぼあらゆる表面に付着しうることに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、細菌の植物表面への結合を観察する方法について十分に理解できるはずです。植物のどの部位に細菌が結合しているかを特定し、結合した細菌の数を決定します。ヒト病原体を用いてこれらの手順を行う場合は、極めて危険な可能性があるため、常に封じ込めフード内での作業や手袋の着用などの予防策を講じることを忘れないでください。

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

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環境

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出典: Matthysse, A. G. 実験室で測定された植物表面への細菌の付着。 J. Vis.

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