Name: 単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いた大腸菌の個別mRNA転写物自動ラベリング手法。この技術は固定細胞内の単一mRNA分子の検出、局在化、定量を可能にし、システム生物学における転写プロセスの統計的解析に貢献します。

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この作品は、(バッハ) にイスラエル科学技術振興財団助成金 514415 と (バッハ) に BSF NSF (MCB) グラント 2016707 によって支えられました。ジークフリートとイルマ ウルマン (バッハ) 教授の椅子はまた認めたからサポートします。

1. プローブの設計
注: このプロトコルは、すでに fluorophores が付いているタグ付き市販オリゴヌクレオチド プローブを使用します。プローブは、ターゲットに相補的な特定のシーケンスのセットで構成されます mRNA、各プローブの単一蛍光分子に活用されています。また、5,16を他の場所で説明されているようにプローブ、蛍光マーカーを付けることが可能です。
<ol>
	<li>アルジュン ラージュ (Oudenaarden 研究所、マサチューセッツ工科大学・ ヴァン); によって開発されたプローブ デザイナー16アルゴリズムを用いた設計 smFISH プローブこの原稿で使用される smFISH プローブのシーケンスは、材料の表に記載されています。 注: 最小検出可能なシグナルのセットでプローブ数は 30 ~ です。正確な数は、非常に短い転写産物を測定した場合に特に興味の遺伝子によると異なる場合があります。</li>
	<li>光セットアップに合った染料を選択 (材料の表を参照)。 注: Cy3 染料または写真漂白剤に感受性の低い光学同等の色素強くお勧めします。デュアル ラベルの候補は cy5 の組合せまたは光学同等 (材料の表を参照) を染めます。ラベル付けされた mRNA の嵐イメージングのための適切な染料は蛍光性の放出の複数のサイクルのための能力によって特徴付けられます。いくつかの smFISH の染料を使用することができます嵐画像 (材料の表を参照)。同じセルに異なる遺伝子に対応する 2 つ (以上) の議事録をイメージするには、染料のほとんど、あるいは全く重複しているスペクトルに共役オリゴヌクレオチド プローブを選択するべきです。</li>
</ol>
2. 試薬の準備
注: フィルター処理されたピペット チップ、チューブなどの消耗品の RNase フリーによる RNAse フリー サンプルを保つために、あらゆる作業環境を清潔に保つことが重要です。ヌクレアーゼ フリー ターゲット コピーの劣化を避けるためには、次のセル固定使用すべての試薬がある必要があります (材料の表参照) またはジエチルピロカーボネート (DEPC)-扱われ、滅菌します。
<ol>
	<li>SmFISH 用のバッファー
	<ol>
		<li>RNase フリー 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水, 0.01 M のリン酸バッファー濃度 (pH 7.4) 0.154 M の塩化ナトリウム濃度とソリューション) を準備します。RNase フリー 10 x PBS を希釈 (材料の表参照) ヌクレアーゼ フリー水 (材料の表を参照)、1:10 で v/v の比。<ol>
			<li>また準備 DEPC 処理 1 × PBS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNase フリーの準備 2 x SSC (生理食塩水ナトリウム クエン酸バッファー (pH 7.0) クエン酸ナトリウム 0.03 M で 0.3 M の NaCl)。RNase フリー希釈 20 x SSC (材料の表を参照)、1:10 でヌクレアーゼ フリー水で v/v の比。<ol>
			<li>また、DEPC 処理 2 を準備 x SSC。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>オリゴヌクレオチド プローブ原液。
	<ol>
		<li>25 μ M のプローブ株式を作成する TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 200 μ L の乾燥したオリゴヌクレオチド プローブ ブレンドを再溶解で上下にピペッティングし渦と遠心分離機を簡単に混ぜる。</li>
		<li>凍結しを貯蔵液チューブの固定の解除を避けるためには、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数を作る。原液-20 ° C で以下を保存し、光から保護します。 注: 5 nmol のプローブ セットは、最大 250 のハイブリダイゼーション反応を提供できます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(スキナーら次の交配バッファー7 ):
	<ol>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水を 5 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐底部チューブに追加します。デキストラン硫酸の 1 g を水に加えるし、積極的なボルテックスによって解散。(30 分程度) に泡が消えるまでは、軌道のシェーカーの内容をミックスします。</li>
		<li>ソリューション 3,530 μ L の脱イオン ホルムアミド、エシェリヒア属大腸菌の tRNA の 10 mg の 20 x SSC 1 mL、200 mM リボヌクレオシド バナジル錯体の 100 μ L、50 Mg/ml BSA の 40 μ L に追加します。DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水の添加により 10 mL に最終巻を持参し、渦までソリューションが均質。 メモ: ソリューションの雪解けから凍結を避けるために、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数をください。-20 ° C で原液を保存します。必ずボトルを開封前に暖かい室温のホルムアミドをしましょう。背景を減らすためは、最適なホルムアミド濃度 (10-40 %v/v 比) を調整することをお勧めします。 
		注意:警告!ホルムアミド、毒性や催奇形物質知られています。目や皮膚、吸入または摂取との接触を避けてください。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。</li>
		<li>ソリューションを滅菌するには、0.22 μ m フィルターを通過します。因数で維持し、1 年間に-20 ° C で保管します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 × PBS に 37% ホルムアルデヒド (v/v) を追加することによって固定バッファー (1 × PBS で 4.6% ホルムアルデヒド) を準備 (2.1.1 参照) 1:8 v/v 比と渦で。 注意: 警告!ホルムアルデヒドは非常に有毒な既知の発癌物質。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。</li>
	<li>SmFISH の洗浄バッファーを準備 (2 の 20% ホルムアミド x SSC) 脱ホルムアミドを 2 に追加することによって x SSC (2.1.2 参照) 1:4 v/v 比と渦。</li>
	<li>5 mM システアミンと酸素スカベン ジャー (グルコース 10% (w/v)、56 nM カタラーゼ、7 μ M グルコースオキシダーゼ) バッファーを洗浄するを追加することによって smFISH の画像バッファーを準備 (20% ホルムアミド 2 x SSC)</li>
	<li>嵐のためのバッファー
	<ol>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水にトリス塩酸 50 mM と 10 mM の NaCl を追加する A のバッファーを準備します。 注: 店は年のための RT。</li>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水にブドウ糖 50 mM 10%、10 mM の NaCl、トリス-HCl w/v を追加することによってバッファー B を準備します。 前年まで 4 ° c 注: ストア。</li>
		<li>MEA バッファーを準備するには、1 mL のバッファー A (1 M 溶液になります) で 77 mg システアミンを溶解します。 注意: それが 1 ヶ月 4 ° C で保存することができます。</li>
		<li>8,440 AU (任意の単位) ブドウ糖酸化酵素を追加することによって Gloxy バッファーを準備し、1 ml 70,200 AU カタラーゼ バッファー a. 注: 50 x 貯蔵液は、1 ヶ月の 4 ° C で格納できます。</li>
		<li>MEA バッファーと Gloxy バッファー B. x 1 の 50 ミリメートルを追加することによって嵐の画像バッファーを準備します。 注: 嵐の画像バッファーは 5 mM システアミン、酸素スカベン ジャー (7 μ M グルコースオキシダーゼと 56 nM カタラーゼ) で 50 mM の 10 mm NaCl、トリスと ph 8.0 10% ブドウ糖で構成します。イメージングの直前準備、格納および常温約 2 時間使用できます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. サンプル固定
<ol>
	<li>(例えば、大腸菌の細菌のセルを成長します。</li></ol>大腸菌 MG1655) 260 rpm および 37 ° C で一晩伊南軌道シェーカーを選択 (例えばLB 培地) の成長媒体で 注: プローブの非特異的結合によるバック グラウンドを決定するには、興味の遺伝子が削除されたひずみの測定を実行する (で図 1と Δ のsodBの Δ のgalkを参照してください同様の手順図 2)。
	<li>新鮮な培地で一晩培養 1: 100 を希釈し、分光光度計の値が 0.2 - までのすべての ~ 1 h 単位の光学濃度 (OD600) 0.4;4 mL 文化は十分なはずです。 注: 選択した顕微鏡に位相差、微分干渉コントラスト機能を持たない場合大腸菌外膜がでラベル付けできます 2 μ M の親油性蛍光マーカー (材料の表を参照) に追加する必要があります、細菌懸濁液固定17前に 20 分。固定し、さらに治療には、以下のよう実行されます。ラベル プローブ セットとスペクトルの重複を最小限に抑えるための異なる発光スペクトルを有する蛍光マーカーを選択するには、注意が必要です。</li>
	<li>4 ° C で 4,500 g で 5 分間遠心分離によるペレット細胞すべてのチューブから上澄みを削除します。</li>
	<li>各管に 1 mL の 1x PBS を追加し、セルに集計を最小限に抑えるためにペレットを再懸濁します。優しく固定バッファーおよび渦の 4 mL を加えます。</li>
	<li>24 の ° C で 30 分間 260 rpm で軌道シェーカーのサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>10 分、1,000 g、4 ° C の遠心分離によって細胞をペレット上清を除去します。1 mL の 1x PBS を追加します。</li>
	<li>(材料の表参照) 1.8 μ L 円錐形底マイクロ遠心チューブに懸濁液を転送し、手順 3.6 回。</li>

4. サンプル透過
<ol>
	<li>非常に慎重に上清を除去します。必要に応じて、ペレットの外のすべての液体を除去する少量のピペットを使用します。</li>
	<li>300 μ L の DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水で再懸濁します。350 μ L 高品位無水エタノール (99%) を追加、チューブを反転して軽く混ぜます。エタノールとミックス再び、最終的なエタノール濃度 70% (v/v 比) に到達するための別の 350 μ L を追加します。 注意: 警告!エタノールは可燃性です。</li>
	<li>室温 (RT) で 1 時間 20 rpm でチューブの回転子とサンプルを回転または、4 ° C で一晩します。サンプルは、1 週間 4 ° C で保存されるかもしれない。</li>
</ol>
5. 交配
<ol>
	<li>7 分, 750 x g, 4 ° C の遠心分離によって細胞をペレットします。上清を除去します。</li>
	<li>1 mL 20% 洗浄バッファーのサンプルへと休暇が数分、またはペレットを完全に溶解するピペットの立っている追加します。</li>
	<li>750 x g、4 ° C での 7 分間の遠心分離によって細胞をペレット</li>
	<li>非常に軽くピペッティングによる上清を削除します。ペレットの外のすべての液体を削除する必要がある場合は、少量ピペットを使用します。</li>
	<li>オリゴヌクレオチド プローブ セットに原液交配バッファー因数にして最終的なオリゴヌクレオチド濃度が 250 を追加 nM。渦精力的に。 注: 同一のセルに一度に 2 つ以上の異なるターゲット Mrna のラベルを 1 つできます。交配バッファーに両方のターゲットのプローブ セットを追加します。(例えば、Cy3 および cy5 の組合せ) のスペクトル重複を最小限に抑える別の発光スペクトルを有する染料を選択するには、注意が必要です。嵐イメージング用サンプルが嵐 (例えば材料のテーブルで) 適切な染付共役設定オリゴヌクレオチド プローブとハイブリダイズがいることを確認します。</li>
	<li>(ソリューションはかなり粘性) の泡の生成を回避しながらのオリゴヌクレオチド プローブを含む 50 μ L 交配バッファーのサンプル (ステップ 5.4 を参照してください) を中断します。</li>
	<li>暗闇の中で 30 ° C でホット ブロックのサンプルを一晩残します。 注: 次に、サンプルが格納される 4 ° C で最大 6 ヶ月間</li>
</ol>
6. 洗濯
<ol>
	<li>各サンプル画像を 1 つの新しい遠心管を使用します。1 mL 洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>洗浄バッファーとミックス/渦を含む新しいチューブにハイブリダイズしたサンプルから 10-15 μ L を追加します。</li>
	<li>7 分間の遠心分離、4 ° C で 750 x g 細胞をペレットします。上清を除去します。 注: を背景を減らすためには、30 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>洗って 2 回以上 (1 mL 洗浄バッファーで再懸濁します、遠心分離機およびペレットを削除) します。</li>
	<li>25 μ L の洗浄バッファーの再懸濁します。 注: 1 つの光退色を低減するために追加できます洗浄バッファー清掃システム (2.6) 単一分子蛍光実験6で色素の安定性を改善するために酸素。</li>
</ol>
7. イメージング用試料の調製
注: セルは蛍光・位相差顕微鏡の下で適切なイメージングを可能にするために固定する必要があります。次のメソッドは、ビューの別のフィールドを別の焦点面で視覚化されるサンプルを準備する使用できます。
<ol>
	<li>Agarose のゲルの準備
	<ol>
		<li>150 mg アガロースを 10 mL 2 x SSC バッファーに追加します。2 を追加しないでくださいそれか、アガロース、x SSC は正しく分解しません。</li>
		<li>電子レンジ 10-15 s たびに大きな気泡が形成し始めるまで。脇を設定すると、数分間冷却します。</li>
		<li>スライドの中央のまま公開されているので、スライドに分けるシリコン フレームを配置します。</li>
		<li>スライドの中央に 10 mm 幅 (1-2 mm 厚) 剛体円環を置き、封止するのため、ゲルの少量を入金します。強化するために数分を待ちます。</li>
		<li>高いドーム形状を形成するまでより多くのゲルを追加します。(高級ピンセットまたはその他のメソッドを使用して) リングを削除して、セキュリティを強化する 10 分を待ちます。</li>
		<li>ゲルとシール #0 coverslip スライドの上の洗浄の細菌セル (6.5 参照) の ~ 10 μ L を入金します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SmFISH の商工会議所のサンプル準備
	<ol>
		<li>別の方法として (手順 7.1) にポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレに洗った細菌細胞 (6.5 参照) を固定化したイメージ用サンプルを準備します。</li>
		<li>常温で一晩表面に対する細胞の接着できるように可視化する前に、暗闇の中でサンプルをインキュベートします。可視化の前に洗浄バッファーで 1 回洗浄 (. 5);smFISH (2.6) の洗浄 buffer(2.5) またはイメージング バッファーと濡れているサンプルを保ちます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>嵐のため商工会議所サンプル準備
	<ol>
		<li>ポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレにイメージングのための嵐のためのサンプルを準備します。</li>
		<li>常温では、暗闇の中のサンプルを一晩インキュベートします。SmFISH (2.5); の洗浄バッファーで可視化洗浄を一度前に嵐 (2.7.5) の画像バッファーを追加します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8。トラン スクリプトの可視化
<ol>
	<li>電動ステージを搭載した広視野蛍光顕微鏡で細胞をイメージ (材料の表を参照)。 注: 嵐変更、染料の蛍光性の放出の複数のサイクルのことができるラベルの付いたセルを使用します。3 D 超解像イメージング システムを使用してサンプルの画像 (例えば材料の表を参照してください)。</li>
	<li>使用 (推奨)、60-100 N.A x &#62;; メタルハライド ランプや水銀などの強い光源との 1.3 油浸漬位相コントラスト対物レンズLED ベースの光のソースがおすすめ。</li>
	<li>使用標準的な冷却 CCD カメラ、理想的な速度よりは低光レベルのイメージング (16 μ m ピクセル サイズでカメラを使用) ために最適化 (材料の表を参照)。 注: 使用冷却 EMCCD (電子電荷結合素子を乗算) のカメラ CCD カメラ特に単一分子の検出を防ぐ熱ノイズを低減する必要があります。</li>
	<li>選ばれた fluorophores の適切なフィルターを使用するを設定します。</li>
	<li>セルの境界を確認正しく、段階の対照の光学、または外側の細胞膜の蛍光ラベル化による各サンプルの別の視野の画像を取得します。すべてのチャネルのための異なる焦点面 (z) で画像を取得 (通常 13 スライスで区切って 250 nm が取られる)。 注: 顕微鏡とフィルター セットのモーターを備えられた段階は商業によって制御されるべき (材料の表参照) またはシーケンス内の画像のスタックをキャプチャすることが社内のソフトウェア。</li>
</ol>
9. データの分析
<ol>
	<li>画像のスタックをデータ解析に適した形式に変換します。</li>
	<li>ターゲットのコピー数を見積もる mRNA 他の現在利用可能なプロトコルのように離散 'スポット' をカウントではなく細胞内蛍光巣の合計強度から。</li>
	<li>オープン ソース ・ ソフトウェア18またはカスタム プログラムで画像解析を実行します。データ画像や分析の詳細は、スキナーらを参照してください。7</li>
</ol>

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<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272811000909/pdfft?md5=6d05a9738e887934c944928bf6182e5c&pid=1-s2.0-S0005272811000909-main.pdf">A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

当研究室で smFISH メソッド2を使用してE. 大腸菌細胞の異なる遺伝子のコピー数で測定しました。簡単に言えば、この手順は次の手順で構成されています: セル固定、プローブの浸透を可能に膜の透過プローブの交配、そして標準的な蛍光顕微鏡を用いたイメージングのサンプルします。この手順は、いくつかの変更6,7,16以前に発行されたものに基づいています。その smFISH はオリゴヌクレオチド プローブの数が背景7の上にも横になっている信号を達成するために 48-72 の範囲である必要があります以前報告されています。私たちは、この番号は興味、光のセットアップ、および特定の実験条件の遺伝子シーケンスに応じて、実際には小さく20ことを示しています。
<p class="jove_content"...

確率は遺伝子発現の基礎的、やむを得ない面であり、細胞多様性1、両方の成績証明書および蛋白質の2,の3レベルに上昇を与えます。明確に定義された条件の下でセル間変動の定量化は、遺伝子の発現とその制御の根底にある基本的なプロセスに、ユニークなウィンドウを提供しています。細菌における細胞多様性の 1 つの重要な源は、転写レベルで行われます。成績証明書番号は、転写、転写プロセス調節などにも確率のためだけではなくを小さな Rna と RNAases2によって異なります。定量的な方法で多様性に直接アクセスする方法の 1 つは、蛍光 smFISH のある特定の遺伝子の個々 の成績証明書を付けることです。この方法では、検出と特定の RNA の分子の細胞内局在性固定、個々 の細菌細胞4をことができます。利息5,6のトラン スクリプトに選択的に結合するように設計、蛍光標識 〜 20 拠点長のオリゴヌクレオチドのセットを持つ Mrna を交配します。複数のラベル付けにより、上記のバック グラウンド蛍光検出と個々 の mRNA 分子は、回折限界のスポットが蛍光顕微鏡7 (参照してください図 1) として表示されます。相補的なオリゴマー プローブが二次蛍光標識した記者のテクニック8を使用して検出されます共役の皮膚 (例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン) を運ぶ mRNA 分子の分類のための他のアプローチがあります。
SmFISH に加えて成績証明書についての定量的な情報を提供する他の方法があります。北など、いくつかのしみまたは量的な PCR の大部分をプローブし従って mRNA のコピーの数も個々 の細胞内での位置を測定できます。これらのメソッドは細胞間変動の定量化に適していません。呼ばれる、細胞内の場所と同様、両方の細胞内 Rna のコピー数の定量誤差に頑健な蛍光の in situハイブリダイゼーション (MERFISH) を多重化できる最近イメージ ベースの技術を開発しました。MERFISH は、蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブの固定数から定義された組み合わせから成る一意のバーコードの割り当てに基づいています。これらのバーコードで読み取られ、smFISH 測定の連続ラウンド、退色と各次の交配、それにより 2 桁の9,10によってスループットの向上のラウンドします。このテクニックは、自動液体処理システムおよびプローブ セットの適切な設計を必要とします。
確率光再建顕微鏡 (嵐)11など小説の超解像技術と個々 のトラン スクリプトの複数蛍光標識の組み合わせにより、十倍の解像度で、転写産物の細胞内局在。嵐、蛍光プローブとイメージングのバッファーの適切な組み合わせは、(点滅) プローブ分子あたりの蛍光性の放出の複数のサイクルをできます。嵐は、大腸菌トランスクリプトームのイメージし、関心12の同時にすべての転写産物の分類によって rna のゲノム広い空間組織を観察にも使えます。
上記のレビューすべての単一細胞方法は固定細胞の転写物をイメージングに基づいています。それ故に、彼らは細胞内での転写産物の動力学的性質に関する情報を提供しません。生きているセル13成績証明書に従う、Mrna を結合部位の配列への興味の遺伝子の融合によるラベルことができます。これらの後者は、バクテリオファージ MS2 のコート蛋白質、緑色蛍光タンパク質 (GFP)10,14,15などの蛍光タンパク質を融合したなどの RNA 結合蛋白質によって認識されます。
ここで大腸菌で特に蛍光標識 DNA プローブ、smFISH 実験で使用するためのセットを個々 の mRNAs をラベリングの手法について述べる。さらに、マイナーな修正と嵐測定用同じラベル付けスキームが紹介します。

<table><tbody><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>純エタノール、99.5%、ACS 試薬、絶対</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 20X SSC</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 10X PBS</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>TE バッファー (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, 分子生物学用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用ホルムアルデヒド溶液, 36.5-38% 水中</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド, ヌクレアーゼフリー</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌tRNA(リボ核酸、大腸菌由来xx型転写)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50mg/ml)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック/アンビオン</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>バナジル-リボヌクレオシド複合体、VRC、200 mM</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>システアミンと酸素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>アスペルギルス・ニジェールのグルコースオキシダーゼ、VII型、50KU</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-フコース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO細胞標識溶液</td> 寿命<td>テクノロジー</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低融点試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>接着シリコーンアイソレーター 直径24-2mm×深さ1.8mm JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0<スパン> </スパン>666208</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>D-リジンコーティングガラス底 ガラス底培養皿</td><td>マットテック株式会社</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>スーパーライフニトリルパウダーフリー検査用手袋</td><td>スーパーマックス</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>ブランド滅菌インキュベーターテープ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR61750</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.8 ml)</td><td>Axygen - Corning Life Sciences</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 丸底ポリプロピレンチューブ (14 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>円錐底遠心分離ポリプロピレンチューブ (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 5 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 10 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 25 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計キュベット</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーピペットチップ 0.2 - 20 &mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーピペットチップ 10 - 200 &mu;l</td><td>Axigene/corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 &mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 &mu;l</td><td>ソレンソン</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ ディスポジ 10 mL ニードル G-21</td><td>ベクトン ディキンソン、バイオサイエンス</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 um シリンジ フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>ニコン機器顕微鏡 タイプ A 浸漬油 A、8cc</td><td>ニコン</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド 76 x26、3 インチ x 1 インチ x 1mm</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>421-004ET</td><td></td></tr><tr><td>#0 カバースリップスライド 24x60</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック/メンツェル</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>ホットブロック</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>携帯用Pipet援助 XP2、ピペット コントローラー</td><td>ドラモンド サイエンティフィック カンパニー</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>OD600 細菌の成長速度のための分光光度計 DiluPhotometer</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD カメラ</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti 顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI プランアポクロマート DM 100X オイル対物レンズ ラムダ PH-3 N.A 1.45 WD 0.13</td><td>ニコン</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>フィルターセット (TRITC/CY3): EX - ET545/30X;EM - ET620/60M;BS-T570LP</td><td>ニコン</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>フィルターセット(CY5):EX-ET640 / 30X;EM - ET690/50M;BS - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Nis-elements AR自動保存ソフトウェア</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td> </td></tr><tr><td>STORM顕微鏡</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>NA 1.2 水浸 対物レンズ </span</td><td>>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX画像取得および分析ソフトウェア</td><td>Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCDカメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&reg;FISHプローブ、CAL Fluorによるカスタムアッセイ&reg;赤590染料</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>Probe Sequence for galK mRNA:</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> 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単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

固定細菌エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光の使用のための個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書をラベル付けアルゴリズムを述べる。smFISH では、興味の遺伝子の mRNA のコピーの数の細胞間の可変性の測定として、転写産物の細胞内局在をことができます。主な手順は、細菌の細胞培養の固定、細胞膜の透過および市販の短い蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブのセットとターゲットの転写産物の交配です。smFISH は、異なる蛍光マーカー間スペクトルの重なりによって課された制限と同じ細胞の複数の遺伝子の転写産物のイメージングを許可できます。下図のプロトコルが完了した後、低輝度蛍光に適したカメラと組み合わせて顕微鏡を用いた細胞が容易にイメージ化します。位相コントラスト フレームの分割細胞膜が染色から得られたセルの輪郭と共に、これらのイメージは、オープン ソースまたはカスタム作成されたソフトウェアを使用して細胞のサンプルの mRNA のコピー数の分布の計算を許可します。ここで説明したラベリング法を確率論的光再建顕微鏡 (嵐) イメージを成績証明書に適用もできます。

SmFISH大腸菌の細胞の galK と sodB の転写物の測定を行った。成績証明書は、単一蛍光分子に共役されて各プローブ ターゲット シーケンスに補足特定のシーケンスのセットで交配させられた (資料の表を参照)。蛍光・位相コントラスト画像 MG1655 野生型の大腸菌の菌株 (WT) または JW0740 (慶應義塾コレクション)19 galK 削除ひずみ (ΔgalK) は、D-フコースは、図 1 aおよび1 bに示すように 2 mM にさらされました。セルは、D-フコースへの暴露後少なくとも 3 時間を修正しました。図 1A (top) でパネル表示セルの輪郭が細胞外 D フコース濃度変数への応答におけるgalK誘導レベルを表す、フォーカスには高さに対応する 13 のうち 1 つのフレームです。...

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

このプロトコルの全体的な目標は、単一分子FiSH実験で視覚化するために、蛍光標識DNAプローブのE.Coliの個々の転写産物を標識することです。この方法は、対象分野の転写産物の細胞間能力の特性評価など、システム生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。細胞壁局在の転写産物も同様です。この手法の主な利点は、転写プロセスの統計に関する大量の情報を提供することです。プロトコルを開始するには、大腸菌MG1655をLBミディアムで、オービタルシェーカーで一晩、260RPMおよび摂氏37度で成長させます。翌日、一晩の培養物を新鮮な培地で1〜100に希釈し、分光光度計でその光学密度を最大0.2〜0.4の値まで測定します。次に、細胞を4°Cで4,500Gで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化する。すべてのチューブから上清を取り除きます。各チューブに1ミリリットルの1XPBSを加え、ペレットを再懸濁して細胞間の凝集を最小限に抑えます。次に、4ミリリットルの固定バッファーを追加し、チューブを静かにボルテックスします。オービタルシェーカーでサンプルをインキュベートします。ペレットを再懸濁して、細胞イメージングに干渉する可能性のある細胞間凝集を最小限に抑えます。インキュベーション後、細胞をペレット化し、上清を取り除き、1ミリリットルの1XPBSを加えます。懸濁液を1.8ミリリットルの円錐底マイクロ遠心チューブに移します。遠心分離により細胞をペレット化します。上清を慎重に除去することにより、細菌の透過化を開始します。少量のピペットを使用して、ペレットの外側の液体をすべて取り除きます。次に、ペレットを300マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁します。350マイクロリットルの高品位無水エタノールを加え、チューブを反転させて溶液を穏やかに混合します。さらに350マイクロリットルのエタノールを加え、再度混合します。次に、チューブローテーターを使用してサンプルを室温で1時間20RPMで回転させます。透過処理から細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を取り除きます。1ミリリットルの20%洗浄バッファーをサンプルに加えます。数分間放置します。次に、750G、4°Cで7分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。上清を非常に穏やかに取り除き、少量のピペットを使用してペレットの外側の液体をすべて取り除きます。次に、オリゴヌクレオチドプローブセットストック溶液をハイブリダイゼーションバッファーアリコートに添加して、最終的なオリゴヌクレオチド濃度が250ナノモルになるようにし、チューブを激しくボルテックスします。オリゴヌクレオチドプローブを含む50マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーにサンプルを懸濁し、気泡の発生を避けます。サンプルを一晩、暗闇の中で、摂氏30度のヒートブロックに置きます。洗浄を準備するには、イメージングするサンプルごとに新しいマイクロ遠心チューブを1つ入手します。各チューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを追加します。ハイブリダイズしたサンプルから10〜15マイクロリットルを、洗浄バッファーを含む新しいチューブに加えます。遠心分離により細胞をペレット化します。次に、上清を取り除きます。サンプルをさらに2回洗浄します。ペレットを25マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。150ミリグラムのアガロースを10ミリリットルの2X SSCバッファーに添加して、アガロースゲルを調製します。アガロースが完全に溶解するまで、毎回10〜15秒間溶液を電子レンジで加熱します。次に、チューブを脇に置いて数分間冷まします。次に、スライドの中心が露出したままになるように、スライドに分離されたシリコンフレームを配置します。幅10ミリメートル、厚さ1〜2ミリメートルの剛性リングをスライドの中央に配置します。密封のために少量のゲルを中央に堆積させ、ゲルが固まるまで数分待ちます。次に、高いドーム形状が形成されるまで、さらにゲルを追加します。ゲルが固まり、リングが取り外されるまで約10分待ちます。10マイクロリットルの洗浄細菌細胞をゲルに沈着させ、ナンバーゼロのカバースリップスライドで密封します。サンプルは、光の漂白を防ぐために暗所に保管してください。大腸菌細胞のsmFiSH測定は、変動する細胞外D-フコース濃度に応答したgalK誘導のレベルを示しています。バックグラウンド信号は、galK削除株、またはデルタgalK JW0740によってネガティブコントロールとして示されます。ほとんどの細胞に多数の斑点が見られます。2ミリモルのD-フコースを細菌培養物に添加した場合の単一または少数のgalK転写産物に対応します。一方、細胞外D-フコースの非存在下では、いくつかの斑点が見られます。このプロトコルの適用のための別の例は、野生型またはJW1648 sodB欠失株におけるsmFiSHの蛍光および位相コントラスト画像とともに、sodB遺伝子によって提供される。このプロトコルで調製したサンプルは、細胞内の転写産物の正確な精密化を可能にするSTORMを使用して画像化することもできます。その開発後、この技術は、システム生物学の分野の研究者が個々の細胞における転写イベントの統計を調査する道を開きました。

method-for-labeling-transcripts-individual-escherichia-coli-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

スパイクの追加に基づく異なるサンプル間転移 RNA の相対的なレベルまたは他の短い RNA を比較する方法と同様、精製されたエシェリヒア属大腸菌RNA からレベルを充電転送の RNA...

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA...

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。...

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

この記事では、末端位置での長鎖RNAの二色標識と、単一分子FRET...

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

学ぶ単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いた大腸菌の個別mRNA転写物自動ラベリング手法。この技術は固定細胞内の単一mRNA分子の検出、局在化、定量を可能にし、システム生物学における転写プロセスの統計的解析に貢献します。

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

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単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

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