組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

このプロトコルの目的は、タンパク質精製過程において混入するヌクlease活性を特定し、除去することです。この手法は、インテグレーションの生化学、構造、ダイナミクスなど、レトロウイルス学分野における重要な課題の解決に役立ちます。本手法の主な利点は、精製過程において、目的の組換えタンパク質から混入したDNAヌクlease活性を特定し、除去できることです。

まず、プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼを発現させたE.coliのペレット1つを氷上で解凍します。直径0.5インチのバイオホーンと直径0.125インチのテーパー付きマイクロチップを備えたソニケーターを使用し、チューブを氷上に置いた状態で、振幅30%で30秒間超音波処理を行います。超音波処理後、細胞サンプルを冷却した超遠心管に移し、4°Cで120,000 ×gにて60分間遠心分離します。

遠心分離後、明確なペレットが形成され、上清は黄色を呈している場合があります。上清を冷却した50 mLコニカルチューブに移します。次に、1.5 mLのニッケル充填樹脂を用いて、長さ110 mm、直径5 mmのFPLCカラムをセットアップします。

まず、カラムをFPLC装置に接続し、バッファーを流します。装置で、導電率および280 nmにおけるUV吸収度のリアルタイムデータを収集してください。導電率とUVの読み値が安定することを確認します。

必要に応じて、数値が安定するまでカラムにバッファーを流し続けます。スーパーループを用い、流速 0.15 milliliters per minute、最大圧力制限 0.5 megapascal でタンパク質サンプルをカラムにロードします。スーパーループを AKTA FPLC に接続します。

カラムの洗浄およびタンパク質の溶出後、初期フロースルー、洗浄液、および280 nm吸光度のピーク画分から15 µLずつ分注し、各サンプルに2X SDS-PAGEサンプルバッファーを15 µL加えます。サンプルを3分間加熱し、沸騰させます。10% SDS-PAGEゲルに、各サンプルを10 µLずつ、およびプレステイン済みタンパク質スタンダードを4 µLロードします。

ゲルを視覚的に確認し、ほぼ純粋なプロトタイプフォームウイルスインテグラーゼを含んでいると思われる画分を特定します。これらの画分を合わせ、ピペッティングしながらその量を記録します。通常、これは 8〜10 mL になります。

分光光度計を用いて、合わせた画分の280 nmにおけるUV吸光度を測定し、プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼタンパク質の全量を算出します。一般的な収量は、誘導培養液1リットルあたり約10 mgです。ヘキサヒスチジンタグを除去するために、プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼに最終濃度10 mMのDTTおよび0.1 mMのEDTAを添加します。

次に、プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼ1 mgあたり15 µgのヒトライノウイルス3Cプロテアーゼを添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼのヘパリンアフィニティークロマトグラフィー分画を行うため、緩衝液Cを1.5倍量添加して、サンプルの塩化ナトリウム濃度を200 mMまで下げます。その後、希釈したプロトタイプフォームウイルスインテグラーゼサンプルを、流速0.5 mL/min、最大圧力制限1 MPaでヘパリンSepharoseカラムにロードします。カラムの洗浄後、グラジエントおよび最終洗浄液を回収し、ロードサンプル、フロースルー、洗浄液、および分画物を8% SDS-PAGEで分析します。

次に、ゲルをCoomassie blueで染色して画分を評価します。プロトタイプ泡沫状ウイルスインテグラーゼと混入しているヌクレアーゼは、ヘパリンセファローズクロマトグラフィーに対して異なる親和性を持ちます。ヌクレアーゼアッセイに使用するため、ほぼ純粋なプロトタイプ泡沫状ウイルスインテグラーゼが含まれていると思われるヘパリンセファローズ画分を特定します。

ヌクレアーゼアッセイを開始するには、3 µLのヘパリン画分、50 ngの3 kbスーパーコイル状プラスミドDNA、および反応バッファーを合わせ、最終容量を15 µLにします。37 °Cで90分間インキュベートします。1 mg/mL Proteinase Kと0.5% SDSを加えて反応を停止させ、37 °Cで1時間インキュベートします。

次に、ヌクレアーゼアッセイ反応液に6X loading dyeを3.5 µL加え、全量を1% agarose gelにロードします。室温にて100 Vで1時間、または色素前線がゲルの末端に達するまで電気泳動を行います。電気泳動完了後、ゲルの蛍光スキャナー画像を確認すると、線状DNAは3 kbのサイズに一致して泳動し、超らせん状DNAはより速く約2 kbまで泳動し、弛緩環状DNAはより遅く3.5 kb付近まで泳動していることが示されるはずです。

画像解析ソフトウェアを用いて、各レーンのスーパーコイル型、線状、およびリラックスサークル型プラスミドのピクセル体積を算出します。これら3つのDNA形態のピクセル体積の合計を「総DNA量」とし、これを用いて線状およびリラックスサークル型の割合（%）を算出します。ヌクレアーゼが混入している分画では、陰性対照と比較して線状およびリラックスサークル型の割合が高くなります。

nucleaseの混入活性を示さないヘパリンSepharose分画をまとめ、10 mm、6〜8 kDaの分画分子量ダイアリシスタンブに移します。4 °Cで、1 Lの透析液を用いて一晩透析します。翌日、透析チューブからnucleaseフリーのプロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼ試料を回収します。

280ナノメートルの吸光度を測定し、最終的なタンパク質濃度を算出します。タンパク質を分注し、液体窒素で急速凍結させます。その後、分注したサンプルを-80°Cで保存します。

ヌクレアーゼアッセイは、本ビデオで説明した手順に従って実施しました。陰性対照には、タンパク質を含まないプラスミドDNA、およびヌクレアーゼが含まれていないことが確認されている野生型プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼの精製サンプルを用いました。また、汚染ヌクレアーゼ活性の陽性対照として、ヌクレアーゼの混入が確認されている触媒不活性型プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼの精製サンプルを用いました。

本手順に続いて、酵素反応速度論やダイナミクスなどの追加の疑問を解消するために、生化学的アッセイや単一分子イメージングなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、リコンビナントタンパク質から不純物であるヌクレアーゼ活性を特定し、除去する方法について十分に理解できるはずです。