Name: 組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの精製法。ヘパリン親和性クロマトグラフィーとヌクレアーゼアッセイを用いて、大腸菌由来のヌクレアーゼ汚染を検出・除去し、生化学的および単一分子解析に適した高純度タンパク質を調製する方法です。

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1. 誘導 PFVエシェリヒア属大腸菌に表現で
<ol><li>
大腸菌BL21(DE3) pLysS の 20 μ L に PFV の発現プラスミド (10 ng/μ L) の 1 μ L を追加 (市販の細胞の 20 μ 因数が > 2 × 106 CFU/μ g のプラスミド) 1.5 mL チューブに。指タップまたはフリック チューブでそっと混ぜます。孵化で氷の 5 分。
	<ol>
<li>まさに 30 衝撃を熱 42 ° C の水のお風呂と 2 分間氷にすぐに戻ります。</li>
		<li>カタボライト抑制 (SOC) メディアで室温超最適スープの 80 μ L を追加します。225 回転/分 (rpm) 揺れと 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>100 mm × 15 mm シャーレ ルリア スープ (LB) 寒天の 25 mL を含む混合物の 25 μ L をプレート (1 L LB 寒天: 15 g 寒天 10 g 食塩 5 g 酵母エキス、バクト トリプトン 10 g) と 100 μ g/mL アンピシリン (100 mg/mL 原液)。</li>
		<li>第 2 同一プレート上の変換セルの残りの 75 μ L をプレートします。37 ° C で一晩を蓋板を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プレートを取得変換大腸菌。LB の 3 mL を接種する単一コロニーを使用 (1 L LB: 10 g, 塩化ナトリウム 10 g、イースト 5 g、バクト トリプトンの抽出) ポリプロピレン文化 14 mL 丸底チューブの 100 μ g/mL アンピシリンと補われます。225 rpm の揺れで 37 ° C で 8 ~ 時間孵化させなさい。
	<ol>
<li>文化の 3 mL を 50 mL LB 100 μ g/mL アンピシリンと 250 mL の三角フラスコに 34 μ g/mL クロラムフェニ コール (34 mg/mL 原液) 補足に追加します。225 rpm の揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。</li>
		<li>1 L LB、100 μ g/mL アンピシリン、クロラムフェニ コール μ g/mL 34 4 L 三角フラスコに文化の 53 mL に転送します。225 rpm の揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>600 の光学濃度を測定定期的に文化の nm (外径600)。最初に、すべての h 文化外径600を確認します。文化目的 OD600に達すると、ないにはびこるに 15 分毎に確認してください。0.9 と 1.0 の間の OD600に文化を育てなさい。文化の温度を下げ、旋回し、フラスコを氷浴に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SDS-PAGE 分析の変化によって文化の 1 mL を 1.5 mL チューブを後で分析に転送します。
	<ol>
<li>室温で 14,000 x g でおよび microfuge で 1 分間遠心分離によって 1.5 mL チューブに細胞をペレットします。上清を捨てます。ピペッティングで 150 μ L リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でペレットを再懸濁します。PBS は、CaCl2と MgCl2なしまたは可能性があります。</li>
		<li>SDS-PAGE サンプルバッファー x 2 の 150 μ L を追加 (150 mM トリス-HCl、pH 6.8, 1.2% SDS 0.0018% ブロモフェノール ブルー、15% β-メルカプトエタノール (βME) 30% グリセロール) とピペットまたは渦流によって徹底的にミックスします。3 分で店-20 ° C の沸騰</li>
	</ol>
</li>
	<li>細菌培養に追加: 最終濃度 0.25 mM イソプロピル-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG、0.25 M 原液) と 50 μ M ZnCl2 (50 mM 原液)。IPTG は T7 プロモーターから PFVの遺伝子の発現を誘導して PFV インチ加温直後 4 h 225 rpm で振とうしながら 25 ° C で文化のアミノ ターミナル亜鉛フィンガー ドメインの正しい折りたたみのための補足として ZnCl2を追加フラスコを氷浴に転送します。1.3 で上記のように同じプロトコルの SDS-PAGE 解析の文化の 1 mL を保存します。</li>
	<li>
適切に大きさで分類された遠心ボトルに細菌培養を転送します。たとえば、1 L 文化は 4 滅菌使い捨て 250 mL コニカル底ポリプロピレン ボトルに転送する可能性があります。3000 × g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵卓上遠心でボトルをスピンします。注ぐことによって培養上清を捨てます。
	<ol>
<li>ピペッティングで 25 mL (ボトルあたり 6.25 mL) 冷 PBS (CaCl2と MgCl2有無にかかわらず) の容量 1 L 培養からペレットのすべてを再懸濁します。結合し、細菌懸濁液を 50 mL の円錐管に転送します。3,000 x g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵遠心でスピンします。注ぐまたはピペットで上澄みを廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットで 10 mL 再懸濁バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) プロテアーゼ阻害剤) の細菌のペレットを再懸濁します。スナップは、50 mL のチューブを水没する十分な液体窒素デュワー フラスコにチューブを配置することによって、ペレットを凍結します。慎重に液体窒素からチューブを削除し、-80 ° C で保存 注意: 細菌のペレットは、-80 ° C で数ヶ月間保存します。我々 は次の 2 年間-80 ° C のストレージのアクティブなタンパク質のロスを見なかった。</li>
	<li>
サンプルの分析前誘導期およびポスト誘導 8.3 cm、幅 7.3 cm、高さ 0.75 mm 厚 SDS-PAGE ゲル層を積層 1.5 mL 6% ポリアクリルアミドゲルで (125 mM トリス-HCl、pH 6.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 6% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed) と 3.5 mL の 10%ポリアクリルアミド層の解決 (375 mM トリス-HCl、pH 8.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 10% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed)12。
	<ol>
<li>スタッキングのゲルを注入後 10 よく櫛を挿入します。ゲルが重合したときページ装置を組み立てるし、十分な SDS-PAGE 実行バッファー (25 mM トリス、グリシン 192 mM、0.1 %sds) を追加します。</li>
		<li>各サンプルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。16.5 V/cm 染料フロント約 60 分のゲルの底に到達するまで実行します。</li>
		<li>ゲル板を分解し、ゲルをプラスチック製の浴槽に転送します。Coomassie ブリリアント ブルー染色液 (0.1 %coomassie 鮮やかな青い R-250、40% メタノール、10% 酢酸) 惜しみなくゲルをカバーし、室温で 20 分間染色を追加します。</li>
		<li>染色液を注ぐことによって削除し、置換後の文字列は、ソリューション (40% メタノール、酢酸 10%) をすすぐバンドがすぐに表示されるまで。注ぐことによって脱染め色液を削除し、脱イオン水で置き換えます。PFV の後誘導サンプルで簡単に識別されます。PFV hexahistidine タグと持ち 47374 Da の分子量。</li>
		<li>PFV でが表示されない場合は、変換プレートの 1 つから別のコロニーから始まる誘導を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
<ol><li>氷の上の 1 つの細菌ペレットを解凍します。 注: これは重要な時間 (約 2-3 時間) かかります。ペレットは、セル スラリーを解凍して、追加の 500 μ M PMSF (100 mM 原液) を追加します。</li>
	<li>氷のスラリー菌 50 mL のチューブをしてください。30 の 30% 振幅で細菌を超音波 s (1 s、1 オフ s)、超音波発生装置を用いた 0.125 インチ直径 0.5 インチ直径バイオ ホーン 1 L 文化から派生したペレットあたりテーパ陰極、周波数 20 kHz、最大電力 400 W</li>
	<li>冷たい遠心チューブに細胞サンプルを転送します。ポリカーボネート ボトル アセンブリ (直径 25 mm、高さ 89 mm) タイプ 60 Ti 固定角ロータと互換性があるを使用します。同じ引力力が達成された場合は、代替管とローターを使用できます。4 ° C で 60 分スピン 120,000 x g明白なペレットがあります。上清は黄色の色にあります。</li>
	<li>注ぐまたは冷たい 50 mL の円錐管にピペットで上澄みを転送します。ボリュームに注意してください。このボリュームは、約凍結スナップ前に使用される再懸濁バッファーのボリュームをする必要があります。粘性上清の場合は、クロマトグラフィー コラムを詰らせることができる細菌の DNA によって汚染される可能性があります。この場合は、バクテリアの DNA をペレットに遠心を繰り返します。</li>
	<li>
500 ml (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M PMSF) をバッファーと 500 mL バッファー B (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M 200 ミリメートル イミダゾール, PMSF)。 このプロトコルの注意: タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム、すべてのバッファー、サンプルで寒い部屋 4 ° C。<ol>
<li>滅菌フィルター バッファー A と B 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニット。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と A のバッファーとバッファー B ポンプ B を洗います。導電率、UV 測定値が安定するまでシステムをフローと 10% 90% バッファー A バッファー B。最大流量、道具に依存します。5 mL/min の流量、最大圧力 1.0 MPa まで使用です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>110 mm 長く、5 mm 径 FPLC 列 1.5 mL ニッケル充電樹脂の準備 (最大結合容量 50 mg/mL、最大圧力 1 MPa)。列は、精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。</li>
	<li>FPLC 計測器にカラムを接続します。0.5 MPa の最大圧力リミットを 10% バッファー B (20 mM イミダゾール) 0.5 mL/min の流速で 90% バッファー A の 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。</li>
	<li>
0.5 MPa の最大圧力制限で 0.15 mL/min の流量で列に蛋白質のサンプル (ペレットあたり 〜 10 mL) をロードします。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL のチューブの流れを収集します。
	<ol>
<li>コラムを洗浄 20 ml の 10% と 90% のバッファーはバッファー B. 収集 50 mL のチューブで、洗浄。20 mL 線形グラデーション 10 ~ 100% のバッファー B (20 mM 200 mM のイミダゾールから) とタンパク質を溶出します。</li>
		<li>5 mL 100% のバッファー B (イミダゾール 200 mM) を最後に、洗い流します。グラデーションと最終的な洗浄を収集0.27 mL 分数。
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れ、洗浄、およびピーク A280分数の 15 μ L と 2 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 15 μ L を組み合わせます。3 分のサンプルを沸騰させます。
	<ol>
<li>SDS ページのゲル 1.6 ステップを除く 15 よく櫛で前述 2 つの 10% を準備します。各サンプルをゲルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。実行、汚れ、および 1.6 の手順で説明するように、ゲルを分析します。</li>
		<li>ほぼ純粋な PFV の目視検査に基づくを含む表示分数を組み合わせます。通常 8-10 mL のピペットで、量を測定します。</li>
		<li>分光光度計を使用すると、結合された分数の A280を測定し、PFV のタンパク質の総量を計算私たちの典型的な収量は、誘導文化の L あたり 〜 10 mg です。Hexahistidine タグと PFV での消散係数は 59360 cm-1 M-1です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hexahistidine タグを削除するには、PFV の 10 mM ジチオトレイトール (DTT、1 M 原液) と 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 (0.5 M 原液) を補足します。4 ° C で一晩 mg PFV インチ加温当たりライノ (HRV) 3 C プロテアーゼの 15 μ g を追加します。胸の谷間と 44394 Da 47374 Da から PFV の分子量が低減され 10 %sds-page 解析による検証可能性があります。</li>
</ol>3. ヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
<ol><li>
250 ml バッファー C (50 mM トリス-HCl, pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M PMSF) と 250 mL のバッファー D (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M, PMSF 1 M NaCl)。 注意: このプロトコルで FPLC システム、バッファー、およびサンプルが保管 4 ° C で寒い部屋。<ol>
<li>滅菌フィルター バッファー C と 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニットと D。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と C バッファーとバッファー D ポンプ B を洗います。導電性、紫外線測定値が安定するまでバッファー C 80% と 20% のバッファー D システムを介してを流れ。最大流量、道具に依存します。我々 は、最高圧力 1.0 MPa までと 5 mL/min の流速を日常的に使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
80 mm 長く、5 mm 直径 FPLC 列 1 ml のヘパリン セファローズ樹脂 (最大吸着容量 2.0 mg ウシのアンチトロンビン III の 1 mL あたりの樹脂; 最大圧力 1.4 MPa) を準備します。列を精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。FPLC 計測器にカラムを接続します。
	<ol>
<li>1 mpa 最大圧力制限付きバッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl) 0.5 mL/min の流速で 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 ボリューム c. バッファーを追加することによって PFV のサンプルで 200 mM の NaCl 濃度を減らすたとえば、バッファー C の 15 mL を 10 mL PFV インチ追加します。合計ボリュームは通常 ~ 25 mL です。</li>
	<li>
負荷最大圧力 0.5 mL/分の流量でヘパリン セファローズ列に希薄 PFV のサンプルは、1.0 MPa を制限します。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL の円錐管に流れを収集します。
	<ol>
<li>洗浄バッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl)、20 mL の列は 50 mL の円錐管に洗浄を収集します。(1 M の NaCl を 200 mM)、30 mL の線形グラデーション 20 ~ 100% のバッファー D 列を溶出します。</li>
		<li>0.37 mL の一部分で 100% 収集バッファー D. グラデーションと最終的な洗浄の 5 ml カラムを洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>8 割負荷、流れ、洗浄、および分数を分析 SDS-PAGE 2.9 に記載。PFV の次の hexahistidine タグの胸の谷間が 44394 Da の分子量と消散係数 59360 cm-1 M-1 hexahistidine タグなしのまま。ヌクレアーゼの分析が完了するまで 4 ° C ですべての分数を格納します。</li>
</ol>4. ヌクレアーゼ アッセイ
<ol><li>
分画ヘパリンと 50 のほぼ純粋な PFV インチを組み合わせる 3 μ L が含まれるヘパリン セファローズ分数を識別する 3 kb の ng スーパー プラスミド DNA 反応バッファー (10 mM HEPES、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4、4 μ M ZnCl2、10 mM DTT) 15 μ L の最終巻で。ない PFV インチで 90 分含む陰性対照の 37 ° C で孵化させなさい
	<ol>
<li>1 mg/mL, プロテイナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) と 0.5 %sds を停止 (10% 原液)。1 h. サンプルは、後で分析のための-20 ° C で保存されるかもしれないのは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイド (10 mg/mL 原液)13で 1 x TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose あたり 1% の重量のジェル 125 mL を準備します。アガロース溶液を溶融し、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイに注ぐ。5 mm、幅 0.75 mm 厚井戸と 15 も櫛を挿入します。細い井戸には、1.5 mm 厚井戸と比較してより良いバンド解像度が得られます。常温で固化するゲルを許可します。
	<ol>
<li>1 のゲルを浸す 0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイドで x TAE。ヌクレアーゼ アッセイ反応にローディングの染料 (50% のグリセロール、0.15% オレンジ G 染料) x 6 の 3.5 μ L を追加します。ゲルに全体のボリュームをロードします。常温 1 時間またはオレンジ G 染料前ゲルの端に達するまで cm (100 V)/10 v 定電圧でゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
すぐにエチジウム ブロマイドを検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。3 kb で線形 DNA サイズに該当する実行、スーパー コイル DNA を高速 (~ 2 kb) を実行し、リラックスした環状 DNA が遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。
	<ol>
<li>画像解析ソフトを使用して、各レーンのスーパー、線形、およびリラックスした円のプラスミッドのピクセル量を計算します。これらの 3 つの DNA フォーム"総 DNA"ボリューム値し、線形とリラックスしたサークルの割合を計算を使用してピクセルの合計を呼び出します。たとえば、リラックスしたサークルのピクセル量は車線の合計 DNA ピクセル値で分割、この数を 100 パーセントを決定するために掛けます。汚染ヌクレアーゼを含む分数は、陰性対照と比較して線形とリラックスの円のより高いパーセントを表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>汚染のヌクレアーゼ活性を表示しないヘパリン セファローズ分数を組み合わせます。6-8 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 透析チューブ 50 mM トリス-HCl、pH 7.5、200 mM の NaCl、50 μ M ZnCl2、10 mM DTT、20% のグリセロールの 1 L に対して一晩 4 ° C で 10 mm の dialyze します。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー PFV のサンプルを透析チューブから回復します。A280を測定し、最終的なタンパク質濃度を計算します。因数とスナップは、液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。</li>
</ol>

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</ol>

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DNA 修復タンパク質 1 分子顕微鏡アプリケーション、またはレトロ ウイルス integrases の酸素スカベン ジャーなど DNA と相互作用する組換えタンパク質は汚染細菌核酸2,3の無料する必要があります。これらの汚染物質は、一括生化学的または単一分子アッセイ中に結果の解釈を混乱させるかもしれません。
我々 は、細菌のヌクレアーゼ頻繁共同浄化 PFV インチで発見しました。ただし、PFV のヌクレアーゼの細菌汚染物質1と容易に区別がヘパリン セファローズに親和性が表示されます。ヌクレアーゼ フリー PFV の調製に重要な各分画ヘパリン セファローズから次のグラジエントのヌクレアーゼ活性の注意深い定量です。グラデーションはヌクレアーゼ汚染; から PFV の分離を許可するように十分に浅いである必要があります。急な勾配は、効率的な分離と互換性がないでしょう。さらに、プラスミド DNA 基板ヌクレアーゼ アッセイの背...

蛋白質 DNA 相互作用の生化学的および単一分子の研究は、非常に純粋な組換えタンパク質を必要とします。これらのアッセイの結果を隠すことが汚染細菌の核酸分解酵素。汚染ヌクレアーゼは、組換えタンパク質酸素スカベン ジャー プロトカテク酸--3, 4-ジオキシゲナーゼ (PCD) とエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌)1から分離したプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) インテグラーゼ (IN) の準備で発見されています。,2,3。
レトロ ウイルスの統合の試金は、活動4の対策としてスーパー コイル DNA の刃こぼれしたりリニア製品への変換に依存します。細胞の感染ではウイルスの cDNA の 2 つの端をホスト クロマチン5に結合します。反応に参加する各端は、ストランドの転送と呼ばれます。アッセイの組換えの活動参加 2 つの DNA オリゴマー協調統合反応4,5,6,7,8でターゲット DNA に終了ウイルスの cDNA を模倣しました。また遺伝子組換えでは、非生理関連の半分サイト統合反応9,10で一端のみの DNA を結合するかもしれない。スーパー プラスミッド DNA のターゲットである統合、共同統合製品は、線形 DNA と半分のサイト統合製品は、リラックスしたサークル。これら反応生成物は agarose のゲルの電気泳動の1中の相対移動によって識別されます。遺伝子組換え汚染ヌクレアーゼ持ち、スプリアスのリラックスしたサークルや実験結果を混乱可能性線形プラスミッドがあるでしょう。ウイルスの DNA オリゴマーは、決定的ヌクレアーゼ製品ではなく、統合製品を識別するために蛍光に分類することがあります。ただしで大きくスーパー DNA ターゲットを支持します。スーパー プラスミドをリラックスしたサークルや汚染ヌクレアーゼによる線形 DNA の損失は結果とデータ11の解釈を歪めます。こうして準備でレトロ ウイルスから細菌の核酸を削除することが不可欠です。
PFV では、ヘパリン セファローズ細菌ヌクレアーゼ1と比較して、異なる親和性を持ってください。PFV とヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズから線形勾配溶出によって切り離されるかもしれない。ヌクレアーゼは、280 nm のピーク時に紫外線 (UV) 吸収すること分析ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって容易には検出されません。代わりに、ヌクレアーゼ スーパー プラスミドのリラックスしたサークルやリニア製品への変換を用いたヌクレアーゼ活性検出します。各分画ヘパリン セファローズ クロマトグラフィーを次のヌクレアーゼ活性テストされます。PFV とヌクレアーゼ汚染モノ Q 陰イオン樹脂の親和性には違いがあります。モノ S 陽イオン樹脂の親和性の差があります。しかし、細菌のヌクレアーゼと PFV のモノ S 解像度はタンパク質の効率的な分離を許さなかった。最終的には、ヘパリン セファローズ親和性の浄化は PFV IN から細菌ヌクレアーゼの最高の分離を提供して無制限の量の利点をいます。
ヌクレアーゼ活性の汚染のためのテストは、他の蛋白質に適応させること。興味の蛋白質は PFV の; より代替親和性特性に可能性が結合の関心とヌクレアーゼ汚染タンパク質の特性の違いは経験的に決まります。ヌクレアーゼの混入を識別するためのこの方法はモノ S 陽イオンまたはモノラル Q 陰イオン交換樹脂を含むその他の樹脂に適応させること。親和性とイオン交換樹脂クロマトグラフィー中タンパク質の量に制限のない核酸の汚染からの興味の組換えタンパク質を分離するための信頼できる方法があります。

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 ロゼッタ 大腸菌</td><td>EMD ミリポア</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>EMD バイオサイエンス</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>アムレスコ</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール&nbsp;</td><td>アムレスコ</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>トリス超高純度</td><td>ゴジラファインケミカル</td><td>ズUTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>アムレスコ</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA スーパーフロー</td><td>キアゲン</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンセファロース 6 ファストフロー</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C プロテアーゼ&nbsp;</td><td>EMDケミカルズ</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

レトロ ウイルス プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) のインテグラーゼ (IN) タンパク質は、レトロ ウイルスの統合のメカニズムを研究するためのモデル酵素です。他のレトロ ウイルスからのに比べて、PFV ではより水溶性と実験操作に向いています。さらに、臨床的に関連するひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の阻害剤、PFV での触媒機構がウイルス相補的 DNA (cDNA) ターゲットの共有結合に参加する HIV 1 インチのすることに似ていることを示唆しているに敏感です。プロセスの DNA では、ストランドの転送と呼ばれます。この鎖転移反応は、ターゲット DNA にニックを紹介します。統合反応生成物の分析は、同様にニック DNA 核酸の存在によって混同することができます。細菌ヌクレアーゼは、組換え PFV のエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 単位で共同浄化するために示されています。ここでヘパリン親和性クロマトグラフィーによる汚染のヌクレアーゼから PFV を分離する手法について述べる。分数は、スーパーのプラスミドと agarose のゲルの電気泳動のヌクレアーゼの混入のため簡単に上映されます。PFV および汚染のヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズ統合の一括生化学的または単一分子解析に適した遺伝子組換え PFV のヌクレアーゼ フリーの準備を許可するため代替の親和性を表示します。

組換え PFV でしばしば細菌ヌクレアーゼ1で汚染されています。生化学的統合の試金はスーパー プラスミド DNA のリラックスした円とリニア製品への変換の量子化によって異なります。これらのアッセイのスプリアス定量汚染ヌクレアーゼの存在可能性があります。Hexahistidine タグを持つ PFV での式はエシェリヒア属大腸菌(図 1) に誘導される、まずニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2) で精製します。ほぼ純粋な PFV の分数を組み合わせるし、hexahistidine タグがプロテアーゼにより切断されます。PFV のと汚染のヌクレアーゼにヘパリン セファローズ クロマトグラフィー (図 3)1の異なる親和性があることを定めています。次のヘパリン セファローズ クロマトグラフィー PFV の分数はリラックスしたサーク...

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

このプロトコルの目的は、タンパク質精製過程において混入するヌクlease活性を特定し、除去することです。この手法は、インテグレーションの生化学、構造、ダイナミクスなど、レトロウイルス学分野における重要な課題の解決に役立ちます。本手法の主な利点は、精製過程において、目的の組換えタンパク質から混入したDNAヌクlease活性を特定し、除去できることです。まず、プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼを発現させたE.coliのペレット1つを氷上で解凍します。直径0.5インチのバイオホーンと直径0.125インチのテーパー付きマイクロチップを備えたソニケーターを使用し、チューブを氷上に置いた状態で、振幅30%で30秒間超音波処理を行います。超音波処理後、細胞サンプルを冷却した超遠心管に移し、4°Cで120,000 ×gにて60分間遠心分離します。遠心分離後、明確なペレットが形成され、上清は黄色を呈している場合があります。上清を冷却した50 mLコニカルチューブに移します。次に、1.5 mLのニッケル充填樹脂を用いて、長さ110 mm、直径5 mmのFPLCカラムをセットアップします。まず、カラムをFPLC装置に接続し、バッファーを流します。装置で、導電率および280 nmにおけるUV吸収度のリアルタイムデータを収集してください。導電率とUVの読み値が安定することを確認します。必要に応じて、数値が安定するまでカラムにバッファーを流し続けます。スーパーループを用い、流速 0.15 milliliters per minute、最大圧力制限 0.5 megapascal でタンパク質サンプルをカラムにロードします。スーパーループを AKTA FPLC に接続します。カラムの洗浄およびタンパク質の溶出後、初期フロースルー、洗浄液、および280 nm吸光度のピーク画分から15 µLずつ分注し、各サンプルに2X SDS-PAGEサンプルバッファーを15 µL加えます。サンプルを3分間加熱し、沸騰させます。10% SDS-PAGEゲルに、各サンプルを10 µLずつ、およびプレステイン済みタンパク質スタンダードを4 µLロードします。ゲルを視覚的に確認し、ほぼ純粋なプロトタイプフォームウイルスインテグラーゼを含んでいると思われる画分を特定します。これらの画分を合わせ、ピペッティングしながらその量を記録します。通常、これは 8〜10 mL になります。分光光度計を用いて、合わせた画分の280 nmにおけるUV吸光度を測定し、プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼタンパク質の全量を算出します。一般的な収量は、誘導培養液1リットルあたり約10 mgです。ヘキサヒスチジンタグを除去するために、プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼに最終濃度10 mMのDTTおよび0.1 mMのEDTAを添加します。次に、プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼ1 mgあたり15 µgのヒトライノウイルス3Cプロテアーゼを添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼのヘパリンアフィニティークロマトグラフィー分画を行うため、緩衝液Cを1.5倍量添加して、サンプルの塩化ナトリウム濃度を200 mMまで下げます。その後、希釈したプロトタイプフォームウイルスインテグラーゼサンプルを、流速0.5 mL/min、最大圧力制限1 MPaでヘパリンSepharoseカラムにロードします。カラムの洗浄後、グラジエントおよび最終洗浄液を回収し、ロードサンプル、フロースルー、洗浄液、および分画物を8% SDS-PAGEで分析します。次に、ゲルをCoomassie blueで染色して画分を評価します。プロトタイプ泡沫状ウイルスインテグラーゼと混入しているヌクレアーゼは、ヘパリンセファローズクロマトグラフィーに対して異なる親和性を持ちます。ヌクレアーゼアッセイに使用するため、ほぼ純粋なプロトタイプ泡沫状ウイルスインテグラーゼが含まれていると思われるヘパリンセファローズ画分を特定します。ヌクレアーゼアッセイを開始するには、3 µLのヘパリン画分、50 ngの3 kbスーパーコイル状プラスミドDNA、および反応バッファーを合わせ、最終容量を15 µLにします。37 °Cで90分間インキュベートします。1 mg/mL Proteinase Kと0.5% SDSを加えて反応を停止させ、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、ヌクレアーゼアッセイ反応液に6X loading dyeを3.5 µL加え、全量を1% agarose gelにロードします。室温にて100 Vで1時間、または色素前線がゲルの末端に達するまで電気泳動を行います。電気泳動完了後、ゲルの蛍光スキャナー画像を確認すると、線状DNAは3 kbのサイズに一致して泳動し、超らせん状DNAはより速く約2 kbまで泳動し、弛緩環状DNAはより遅く3.5 kb付近まで泳動していることが示されるはずです。画像解析ソフトウェアを用いて、各レーンのスーパーコイル型、線状、およびリラックスサークル型プラスミドのピクセル体積を算出します。これら3つのDNA形態のピクセル体積の合計を「総DNA量」とし、これを用いて線状およびリラックスサークル型の割合（%）を算出します。ヌクレアーゼが混入している分画では、陰性対照と比較して線状およびリラックスサークル型の割合が高くなります。nucleaseの混入活性を示さないヘパリンSepharose分画をまとめ、10 mm、6〜8 kDaの分画分子量ダイアリシスタンブに移します。4 °Cで、1 Lの透析液を用いて一晩透析します。翌日、透析チューブからnucleaseフリーのプロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼ試料を回収します。280ナノメートルの吸光度を測定し、最終的なタンパク質濃度を算出します。タンパク質を分注し、液体窒素で急速凍結させます。その後、分注したサンプルを-80°Cで保存します。ヌクレアーゼアッセイは、本ビデオで説明した手順に従って実施しました。陰性対照には、タンパク質を含まないプラスミドDNA、およびヌクレアーゼが含まれていないことが確認されている野生型プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼの精製サンプルを用いました。また、汚染ヌクレアーゼ活性の陽性対照として、ヌクレアーゼの混入が確認されている触媒不活性型プロトタイプフォームウイルスインテグラーゼの精製サンプルを用いました。本手順に続いて、酵素反応速度論やダイナミクスなどの追加の疑問を解消するために、生化学的アッセイや単一分子イメージングなどの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、リコンビナントタンパク質から不純物であるヌクレアーゼ活性を特定し、除去する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

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