流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

この方法の全体的な目標は、誘導性遺伝子またはshRNA発現のためのベクターコンストラクトを用いて、in vivoで肝細胞を安定的にトランスフェクションすることです。この方法は、肝臓研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、肝臓がんや再生のメカニズムを調べるために応用することができます。

この技術の主な利点は、CreERとマウス肝細胞における誘導性導入遺伝子R shRNA発現の併用発現を、流体力学的尾静脈注射によってin vivoで達成できることです。その手順を実演するのは、私たちの研究室の医学生であるエリック・ハブナーです。まず、標的タンパク質の短いヘアピンRNAを含む150ナノグラムのエントリーベクターと、150ナノグラムのpTC TetベクターおよびTEバッファーを合計8マイクロリットルに組み合わせます。

次に、LRクローナーゼ酵素ミックスIIを氷に移し、2分間インキュベートします。インキュベーション中に2回ボルテックスします。次に、2マイクロリットルのLRクローナーゼ酵素ミックスIIを反応に加え、摂氏25度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、1マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加えて反応を停止します。その後、摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、標準的なヒートショックプロトコルを使用して、2マイクロリットルのクローニングミックスでStbl3コンピテントバクテリアを形質転換します。

アンピシリンを含む寒天プレートに形質転換をめっきした後、摂氏30度で24時間インキュベートします。翌日、単一のコロニーを選び、少量の細菌増殖培地を接種して一晩インキュベーションします。DNAを単離し、サンガーシーケンシングによりベクターの完全性を確認した後、注入用のコンストラクトのマキシスケールDNA調製物を調製します。

マウスの体重を量ることから始めます。次に、エンドトキシンフリーのSleeping Beautyベクターコンストラクト1ミリリットルあたり15マイクログラムとエンドトキシンフリーのpchsB5ミリリットルあたり1マイクログラムを含む滅菌生理食塩水を準備します。各マウスに体重の10%の体積を注入するのに十分な溶液を準備します。

滅菌済みの3ミリリットル注射器に1匹のマウスに必要な容量を満たし、27ゲージの針を取り付けます。適切な量のティッシュペーパーを追加して、動きのためのスペースを最小限に抑え、呼吸のための十分なスペースを確保した後、マウスを呼吸穴のある適切な拘束具に挿入します。赤外線を使用してテールを温めますamp テールの急速な動きやその他の興奮の兆候などの過熱の兆候を注意深く監視しながら

次に、アルコール綿棒で尾を掃除します。針を、尾の付け根に近い2つの外側尾静脈のいずれかにほぼ水平に挿入します。うまく配置すると、少量の血液が針の円錐形に戻る可能性があります。

8〜10秒以内に総量を尾静脈に注入します。注射後、すぐにマウスを拘束装置から取り外してください。注射創傷を滅菌ガーゼで少なくとも30秒間、または出血が治まるまで圧縮します。

ハイドロダイナミック尾静脈注入の成功は、トランスフェクションにとって非常に重要であり、特に注入速度、量、および時間に依存します。静脈内注射を容易にするために、注射当日にマウスがストレスを受けたり脱水したりしていないことを確認してください。リカバリーケージで30〜60分間ソロハウジングした後、マウスを元のケージに戻します。

尾静脈注射の10〜15日後にCreリコンビナーゼの誘導を開始し、非組み込みベクターのクリアランスを可能にします。10ミリグラムのタモキシフェンを40マイクロリットルのエタノールに溶解し、55°Cで10分間振とうしながらインキュベートします。タモキシフェンが溶解するまで数回渦

次に、960マイクロリットルのコーン油を加え、摂氏55度で5分間インキュベートします。冷却後、溶液を20ゲージの針で1ミリリットルのインスリン注射器に引き込みます。その後、27ゲージの針に交換します。

注入するには、まず親指と2本目の指でマウスの首を慎重につかみ、手の付け根と4本目と5本目の指の間に尻尾を固定して、マウスを首筋にします。次に、0.1ミリリットルの溶液を腹部の左下腹部に腹腔内に注入します。10日未満の実験では、次のプロトコルを使用して飲料水を介してドキシサイクリンを継続的に投与します。.

まず、5グラムのスクロースを100ミリリットルの水道水とオートクレーブに溶かします。次に、100ミリグラムのドキシサイクリンヒクレートを15ミリリットルの円錐管内の5ミリリットルのスクロース溶液に溶解します。次に、10ミリリットルのシリンジを使用して、0.2ミクロンのフィルターで溶液を滅菌ろ過します。

次に、ろ過したドキシサイクリン溶液を残りの95ミリリットルのショ糖溶液に加え、飲料水の代わりにマウスに溶液を供給します。毎日チェックし、溶液が濁った場合は、細菌の異常増殖を示しているため、すぐに交換してください。1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒド溶液を含む27ゲージの針で1ミリリットルの注射器を準備します。

解剖ハサミと解剖学的鉗子を使用して、正中開腹術を行い、安楽死させたマウスの肝臓を露出させます。小腸を右に動かして、門脈と下大静脈を露出させます。準備したシリンジの針を下大静脈に挿入し、門脈を切断します。

1ミリリットルのPFAをゆっくりと注入して肝臓組織を豊富に含み、自己蛍光性赤血球を除去します。肝臓を取り除いた後、水で洗い流し、切片化する前に5〜10ミリリットルの4%PFA溶液に移して後固着します。誘導性Creリコンビナーゼの構成的発現と、導入遺伝子または選択したshRNAの誘導性発現を組み合わせたトランスポゾンコンストラクトをCreレポーターマウスに注入したところ、タモキシフェンによるCreリコンビナーゼ活性化後のGFPレポーター遺伝子の強力な発現が示されました。

ドキシサイクリン治療後、トランスフェクトされた肝細胞の適切な抗体により、誘導性導入遺伝子の発現を可視化することができる。誘導性shRNA発現では、免疫染色によって検出された細胞質GFP発現をshRNA発現の代替マーカーとして使用できます。肝臓特異的プロモーターコンストラクトの制御下でルシフェラーゼ発現カセットを保有するトランスポゾンコンストラクトを注入した。

ルシフェリンを注射した後、マウスは流体力学尾静脈注射の2週間後にin vivoイメージングシステムを使用してイメージングされました。イメージングは、注射後15日で肝臓における堅牢で安定したルシフェラーゼ生物発光を示し、生物発光イメージングにより、トランスフェクションされた細胞の存在をin vivoで追跡するためにシステムを成功裏に使用できることを実証しました。一度習得すれば、流体力学的尾静脈注射は約15分で行うことができますが、マウスの注射のクローニングから導入遺伝子R shRNA発現の誘導、肝臓の準備までの全手順には約3〜4週間かかります。

この手順を試行する際には、プラスミドのサイズと配列の完全性を念頭に置くことが重要です。このビデオを見れば、選択した導入遺伝子R shRNAを用いたpTC Tetシステムを任意のCrelux Pbaseマウスモデルに適用する方法について十分に理解できるはずです。