細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

この手順の全体的な目標は、さまざまな寸法の自己組織化組織リングを作成するために使用されるカスタムセルシーディング型を作成することです。この方法により、ヒトの細胞から3次元の組織リングを作成し、組織の構造、強度、および機能を評価するために使用できます。この技術の主な利点は、カスタム寸法の自己組織化組織の金型を製造するための簡単な方法であることです。

手順を開始するには、コンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、目的の寸法の金型の図面を作成します。CADファイルを高解像度の3Dプリンターに送信します。50°Cで安定している光沢仕上げのプラスチックで金型を印刷します。

印刷した型は、ブラシ、洗剤、水でよく洗います。型を蒸留水ですすぎ、ラックで自然乾燥させます。PDMS硬化温度で安定している3Dプリントプラスチックを選択することが重要です。

加熱中にPDMSに移る残留物は、リング形成に影響を与える可能性があります。次に、使い捨ての計量ボートで25グラムのPDMSベースを測定します。硬化剤を1:10重量比で加え、ベースと硬化剤が完全に混ざるまで激しく攪拌します。

次に、型の周りに実験室用テープを固定して、印刷されたウェルで顔の周りに約1cmの高さの壁を形成します。テープの壁に隙間がないことを確認します。PDMS混合物を3Dプリントされた型に流し込みます。

PDMSを真空チャンバー内で30〜60分間、または気泡がなくなるまでガス抜きします。PDMSを摂氏50度で2〜4時間、またはPDMSが金型から取り出すのに十分な固さになるまで硬化させます。次に、テープをはがし、PDMSネガティブを金型から慎重に分離します。

PDMSネガティブを摂氏60度のオーブンで1時間インキュベートし、完全に硬化することを確認します。その後、ネガを洗剤と水でよく洗います。型を蒸留水ですすぎ、自然乾燥させます。

アガロース型を作製する前に、PDMSネガティブ、一対の鈍い鉗子、およびその他の必要なツールをオートクレーブします。製造を開始するには、DMEM中に少なくとも50ミリリットルの2パーセントアガロースを調製し、オートクレーブします。リング播種の1日前にアガロースウェルを準備します。

4ミリリットルの溶融アガロースをオートクレーブ処理したPDMSネガティブにピペットで入れ、型をいっぱいにしすぎないように注意します。次に、溶融したアガロースをアガロースウェルポストの空洞にピペットで入れます。ピペットチップを使用して、すべての気泡を取り除きます。

最終的なアガロース表面は平らでなければなりません。アガロースを約10分間冷まします。次に、鈍い鉗子を使用して、冷却されたアガロース型をPDMSネガティブから慎重に分離します。

モールドを上向きにして、6ウェルプレートの1つのウェルに置きます。適切な完全培地をプレートウェルに加え、アガロースウェルが完全に沈むようにします。使用前に一晩中、アガロースウェルを摂氏37度で平衡化します。

まず、15センチメートルの培養皿で、ラット大動脈平滑筋細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素雰囲気で培養し、70%のコンフルエントが達成されるまで培養します。目的のアガロース型を調製し、一晩で平衡化したら、5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で培養皿を2回すすぎます。PBSを取り除いた後、皿に0.25パーセントのトリプジンの3ミリリットルを追加します。

摂氏37度で2〜3分間、または細胞が皿から浮き上がるまでインキュベートします。トリプジンを3ミリリットルの完全培地で中和します。細胞を円錐形のチューブに移し、完全に再懸濁されるまで細胞を静かにピペットで移します。

細胞懸濁液のアリコートを等量のトリパンブルー色素で希釈し、血球計算盤で細胞をカウントします。次に、懸濁液をGの200倍で5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を完全培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり1,000万個の細胞の濃度を達成します。

一貫したリング形成を確保するための最も重要なステップは、使用している細胞株の細胞数と培地を最適化することです。次に、平衡化したアガロースウェルを取得します。アガロースの外側の周りとアガロースウェル内の両方から、ウェルの底に穴を開けないように注意しながら、すべての培地を慎重に吸引します。

細胞懸濁液の50マイクロリットルを各ウェルにピペットで移します。アガロースウェルの外側に2ミリリットルの新鮮な培地を、培地がウェルにこぼれないように追加します。プレートを摂氏37度で5%CO2雰囲気で一晩インキュベートし、細胞が凝集できるようにします。

次に、アガロースの外側から培地を吸引します。4.5ミリリットルの新鮮な培地をプレートウェルに追加して、アガロースウェルが充填され、アガロース型全体が完全に沈むようにします。組織輪が十分に発達するまでプレートをインキュベートし続け、毎日培地を交換します。

次に、鉗子を使用して各組織リングを支柱からゆっくりとスライドさせます。すぐに、組織学のためにリングを固定するか、機能的または機械的な評価のためにリングを使用します。3Dプリンティングにより、より柔軟な金型設計が可能になりました。

ポストの直径は、直径が2ミリメートル、4ミリメートル、および12ミリメートルのポストの周りに作られたラットの平滑筋細胞リングが示されているように、簡単に変更できました。組織環は、初代ヒトSMC、ヒト間葉系幹細胞、および人工多能性幹細胞に由来するSMCからも調製されています。リングは、組織機能と機械的強度を評価するためのin vitro組織モデルとして使用されました。

この方法はもともと血管組織を作製およびモデル化するために設計されましたが、軟骨、骨格筋、心臓組織など、他の組織タイプのセグメントの作製にも使用できます。この方法は、研究者がカスタムモールドを作成して、さまざまな寸法の3D組織リングを作製するための簡単な方法を提供します。これらのリングは、異なる細胞タイプから作製された人工組織の構造、機械的特性、および機能を評価するために使用できます。