蛍光灯、摂取昆虫における流体吸収能力を決定するための磁気ナノ粒子
2017年12月20日
流体食性昆虫は、多孔性の表面の液体の微量を取得する能力を持っています。このプロトコルでは、直接蛍光、磁性ナノ粒子供給溶液を用いた多孔質表面から液体を摂取する昆虫の能力を決定する方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、蛍光磁性ナノ粒子と混合されたショ糖溶液を使用して、液体摂食昆虫の摂食の生理学的パラメータを評価することです。この方法は、昆虫の構造、機能、口の部分の関係、昆虫の摂食メカニズムなど、昆虫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、昆虫がプールまたは液体フィルムとして存在する液体を摂取できるかどうかを判断できることです。
このデモンストレーションでは、青いボトルフライを使用していますが、これは、その液体取り込み能力と口の部分の形態が十分に文書化されているためです。イエバエ、キャベツ蝶、その他の液体摂食昆虫を使用できます。ハエの蛹を入手し、1日あたり18時間の光と摂氏23度の環境チャンバーに入れます。
成虫が蛹から出てきた後、実験の前に餌を与えないでください。実験食品については、ミリリットルあたり0.5ミリグラムのナノ粒子を含む20%ショ糖溶液を調製します。次に、マニピュレーター、クランプ、および供給ステージで構成される供給ステーションを準備します。
給餌ステージでは、凹面スライドで食品を保持します。また、凹面スライドを覆うために、さまざまなナイロンネットフィルターとさまざまな細孔サイズのメンブレンフィルターを準備します。昆虫の体、脚、羽を折りたたんだティッシュペーパーに包むことから始めます。
頭と口の部分だけを露出させておきます。これを行う間、昆虫の翼を一緒につまんで固定します。次に、ティッシュペーパーで包まれた翼を2つの顕微鏡スライドの間に固定します。
次に、2つのスライドをクランプし、クランプをマニピュレーターに固定します。次に、マニピュレーターを使用して昆虫を給餌ステージより上に固定します。次に、凹型スライドの中央に30マイクロリットルの供給溶液を堆積させ、多孔質の濾紙で溶液を覆います。
液滴は、細孔を埋める濾紙に沿って広がります。次に、口の部分の遠位領域が濡れた濾紙に接触するように昆虫を配置し、スライドの平らな部分にのみ到達でき、昆虫が凹部から餌を供給できないようにします。次に、昆虫ピンを使用して口の部分を濾紙に伸ばし、昆虫が45秒間餌をやるのを待ちます。
昆虫が餌をやることに興味を示さない場合は、ピンを使用して45秒間充填するために口の部分を濾紙に保持します。これで給餌プロトコルは完了です。解剖には、昆虫の体を覆うのに十分なPBSを50ミリリットルの時計用ガラスにセットします。
これを顕微鏡のすべての解剖ツールと一緒にセットアップします。次に、翼を閉じたままティッシュペーパーから昆虫を取り除きます。次に、スプリングマイクロディスセッションハサミを使用して頭、脚、翼を取り外し、胸部と腹部をPBSに入れます。
腸を解剖するには、まず遠位腹部のキューティクルをつかみ、キューティクルを後端から胸部まで外側に沿って前方に切ります。キューティクルだけが切られ、消化管が損傷しないように特に注意してください。次に、胸部と消化管だけが時計のガラスに残るまで、昆虫ピンの助けを借りて腹部のキューティクル、脂肪体、およびその他の構造を取り除きます。
次に、作物を特定します。これは袋のような構造で、胸部と腹部の接合部近くにあります。必要に応じて、胸部に追加の切開を行い、作物を明らかにします。
次に、残りの胸部を切り取り、消化管と作物だけを残します。摂取したナノ粒子の存在をテストするには、まず、微細な解剖鉗子を使用して、作物をイメージング用のカバースリップに移します。作物の破裂を防ぐよう注意してください。
倒立共焦点顕微鏡で、CY3チャンネルまたは位相コントラストを使用して、20倍の倍率でクロップをすぐに画像化します。摂取したナノ粒子を同定するには、作物から約10ミリメートルのところに磁気攪拌棒を振る。前後の動きを約1秒で行います。
磁石を振ったまま、操作ステージをゆっくりと動かして、ほぼ透明な作物内のナノ粒子の動きをスキャンします。ナノ粒子が作物中に存在すると、磁気攪拌棒と一斉に波打つ。多孔質表面から溶液を餌とする昆虫は、液体を細孔内に保持する毛細管圧力を克服するために、プラトー不安定性を介して安定した液体ブリッジを作成する必要があります。
昆虫の摂食導管のサイズによって、昆虫が摂食できる最小の細孔サイズが決まると予測されています。昆虫を解剖してナノ粒子が摂取されたかどうかを評価した後、昆虫の口の部分を画像化して、食物管路のサイズを測定しました。ハエについては、偽気管の直径と口腔開口部を測定しました。
摂取したナノ粒子の分析は、遠位口部導管サイズと昆虫が餌を供給できる最小の細孔サイズとの間に密接な関係があることを示唆しています。この関係は、近位の口の部分では見られません。その結果、双翅目への体液の取り込みは、口腔の開口部ではなく偽気管で最初に発生し、毛細血管の作用が摂食に重要な役割を果たす必要があります。
このビデオを見れば、昆虫にナノ粒子溶液を与え、昆虫を解剖して作物を分離し、作物のナノ粒子を検査する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みるときは、解剖中に注意することが重要です。作物が破裂すると、液体の内容物やナノ粒子がこぼれ、サンプルが台無しになる可能性があります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルでは、昆虫の液体摂食能力、特に多孔質表面から液体を摂取する能力を評価する方法について概説します。蛍光磁性ナノ粒子を混合したショ糖溶液を用いることで、昆虫の摂食メカニズムに関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 昆虫学
- 昆虫生理学
- 摂食メカニズム
背景
- 液体摂食昆虫は、さまざまな表面から液体を抽出することができます。
- 昆虫の口器の構造と機能は、摂食行動を理解する上で極めて重要です。
- この手法は、多種の液体摂食昆虫に適用可能です。
- クロイエバエは、その摂食能力が十分に文書化されているため、本研究に使用されています。
研究目的
- 昆虫における液体摂取の生理学的パラメータを評価する。
- 口器の構造と摂食効率の関係を調査する。
- 昆虫が液体溜まりや液膜から液体を摂取する能力を判定する。
使用された手法
- 蛍光磁性ナノ粒子を含むスクロース溶液の調製。
- 液体摂取能が知られているため、デモンストレーションにキンバエを使用。
- 光条件と温度条件を制御した環境チャンバーのセットアップ。
- 多孔質表面における摂食行動の直接観察。
主な結果
- 昆虫がさまざまな表面から液体を摂取できる能力を実証した。
- 昆虫の摂食メカニズムに関する知見を提供した。
- 摂食研究における蛍光磁性ナノ粒子の有用性を検証した。
- 他の液体摂食性の昆虫種への応用の可能性を示した。
結論
- この手法は、昆虫の液体摂取を研究するのに有効です。
- 昆虫の摂食メカニズムを理解することは、より広範な生態学的研究に役立ちます。
- 今後の研究では、さらに多くの昆虫種を用いて、これらの知見を拡大させることができます。
よくある質問
業界における重要性
本手法により、昆虫における液体摂取メカニズムの直接的な評価が可能となり、多孔質表面からの摂食行動を定量的に解析するアプローチが提供されます。口器の形態と機能的な摂食能力を関連付けることで、媒介動物制御における標的の検証やバイオミメティックデザインを支援します。本技術は、疾患伝播研究に関連する微小管内の生物学的液体輸送を調査するための、拡張性と再現性の高いシステムを提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 昆虫の摂食装置における構造と機能の関係を調査し、流体輸送メカニズムに関する生物学的仮説を検証します。
- 運用的価値： 蛍光磁性ナノ粒子を検出可能なトレーサーとして使用することで、間接的な構造的推論に頼ることなく摂取を確認します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定義された孔径のフィルターを用いて標準化された摂食アッセイを調製し、昆虫種間における液体摂取しきい値を定量化する。
- 実用的価値： 共焦点顕微鏡を用いて、作物の内部におけるナノ粒子の分布を高解像度でイメージングし、一貫性のある測定可能な読み取りを可能にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：生物学的に関連のある基質への摂食能力を検証することで、疾患媒介生物の研究を支援し、介入戦略への情報提供を行う。
- 運用上の価値：さまざまな流体摂食昆虫（ハエ、チョウなど）に適応させ、種を越えた摂食プラットフォームの継続性を確立する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的に焦点を当てたスクリーニングや介入設計に先立って、摂食メカニズムの機能的検証を提供することで、初期の探索ワークフローに適合します。
- 探索生物学： 生理学的流体の取り込みを試験することで、口器の構造と機能の関係を明確にし、標的選択におけるメカニズム的な曖昧さを低減します。
- スクリーニング： 定量的でイメージングに基づいたアウトプット（嗉囊内のナノ粒子の存在）を提供し、異なる条件下または遺伝子型間での比較摂食アッセイを可能にします。
- 分析： 孔径と相関するバイナリ（陽性/陰性）の摂食読み取り値を生成し、標的検証におけるデータ駆動型のゴー/ノーゴー決定を支援します。
- トランスレーショナルリサーチ： ラボベースの摂食アッセイを実際のベクターの摂食行動に結びつけ、疾患伝播モデルの予測価値を高めます。
- エンタープライズ再利用： 昆虫モデルや流体管研究全般に適用可能な、再利用可能なナノ粒子摂食イメージングプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 液体摂取の直接的な証拠を提供し、昆虫の摂食に関するメカニスティックモデルおよび標的の妥当性に対する信頼性を高めます。
- 運用的価値： 管理されたショ糖ナノ粒子溶液と規定のフィルター孔径を用いて摂食評価を標準化し、再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 観察による推論への依存を低減し、媒介動物制御プログラムにおける標的のデリスキングをより迅速かつ正確に行うことを可能にします。
- ポートフォリオへの影響： 環境的に関連のある基質からの検証済み摂食能に基づき、リスク調整された標的の優先順位付けに情報を供します。
実施上の考慮事項
- 作物の破裂やナノ粒子の喪失を防ぐため、昆虫の取り扱い、解剖、および共焦点顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 蛍光磁性ナノ粒子、磁気攪拌子、および適切な蛍光チャンネルを備えた倒立共焦点顕微鏡へのアクセスが必要です。
- 実験間で摂食面の整合性を確保するため、正確な孔径を持つフィルターペーパーの標準的な準備が必要です。
- 昆虫の生理状態および摂食行動を一定に維持するため、環境制御（23°C、18時間明期）が必要です。
- ナノ粒子の効果的な可視化には、半透明の作物に限られます。不透明な組織の場合は、別の検出方法が必要となる可能性があります。
