Name: 生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ低磁場電子常磁性共鳴技術を用いたマウス乳がんモデルの腫瘍微小環境における組織酸素化と代謝パラメーターの定量的かつ非侵襲的評価法。がん治療標的設計への応用可能性を示す。

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この作品は、NIH によって部分的に支持された CA194013、CA192064、U54GM104942 を付与します。VVK, ab 級, し、TDE の立ち上げのため、WVCTSI を認めた著者は、博士・ m ・ Gencheva、k. ・ シュタインバーガーを例示実験支援ありがちましょう。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。

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</ol>

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提示方法すなわちpO2pH、酸化還元状態、および間質性 Pi および細胞内 GSH 濃度化学 TME の重要なパラメーターの生体内非侵襲的評価を可能にします。MRI や低磁場 EPR などの磁気共鳴技術は、非侵襲体内のこれらの TME パラメーターのプロファイルの選択の方法です。MRI は、解剖学的構造を可視化するが、機能の感度を欠いています。MRI とは対照的 EPR 技術は微小環境機能スピン プローブと組み合わせて使用されるときのローカル パラメーター機能の感度を提供します。私たちの知る限り、体内 pO2pHePi、還元グルタチオンなど、被験者の生活で生理学的に重要な化学 TME パラメーターを同時に評価するために使用できる他の方法がないです。
記述されていたプロトコルは低磁場 l-band EPR を使用してに基づいており、常磁性プローブに特別設計されています。図 1</stron...

がんの進行と治療における TME の重要な役割はますます高く評価1です。固形腫瘍、組織低酸素症2アシドーシス3,4、高還元能力5高濃度の細胞内 GSH6、7TME の重要な生理学的パラメーターの間で間質性 Pi8はよく記載されています。非侵襲体内 pO2pH、Pi、GSH、レドックス評価は TME、生物学的過程のユニークな洞察を提供し、抗がん剤と TME をターゲットとした治療戦略の前臨床スクリーニングのための事前のツールを助けます。磁気共鳴画像 (MRI) や低磁場 EPR ベース テクニックによる組織の合理的な高周波溶込み深さはこれらの TME パラメーターの非侵襲的評価への最も適切なアプローチとなります。MRI 画像水プロトンに頼ってと解剖学的解像度を提供するために臨床の現場で広く、機能解像度を欠いています。細胞外の Pi 濃度と内因性リン酸からの信号に基づいて pH のリン 31 磁気共鳴 (31P NMR) 測定は TME 特性評価の可能性がある魅力的なが、通常数回によってマスクされ高い細胞内 Pi 濃度9,10。対照をなして、EPR 測定分光法に依存し、常磁性プローブ機能解像度を提供するために設計された特別のイメージングします。外因性の EPR プローブは外因性優位 NMR プローブ EPR の多くの高い固有の感度と内因性背景 EPR 信号の不在のため。11プローブのデュアル機能 pH および酸化還元 nitroxyl の最近の開発と、多機能トリチル プローブ12 TME のいくつかのパラメーターの同時測定体内の比類のない機会を提供します、相関解析プローブ分布と測定の時間に依存しません。私たちの知る限り、体内 pO2pHePi、還元グルタチオンなど、被験者の生活で生理学的に重要な化学 TME パラメーターを同時に評価するために使用できる他の方法がないです。
用プローブ生体内で機能の測定:
常磁性プローブ粒子および溶性プローブ TME のパラメーターにアクセスするために使用の化学構造を図 1に示します。高感度機能、安定性、生体組織と最小限の毒性は、EPR パルスオキシメータ体内の水溶性プローブ優先粒子状のプローブを作るいくつかの利点です。たとえば、粒子プローブでは、数週間にわたって組織pO2の縦断的測定を可能にする可溶性のプローブと比較して組織インプラントのサイトで保持時間を増加しています。その一方で、可溶性プローブ EPR ベース イメージングできるよう複数の機能から併用解析を用いた空間分解測定を提供することにより粒子状のプローブをアウトパ フォームする (pO2pH、Pi、酸化還元とGSH)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> 図 1。TME 評価分析を組み立てる常磁性プローブの化学構造。粒子pO2プローブ、LiNc BuO 含まれます (R = O (2CH) の3CH3)、および可溶性プローブ: デュアル機能 pH および酸化還元プローブ、NR;グルタチオン (gsh) 敏感なプローブ、RSSR;多機能pO2, pH, および細胞外微小環境、希望プローブ.の Pi プローブこれらのプローブの合成は、提供された参照11,12に記載されています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>LバンドESR分光計</td><td>Magnettech, Germany</td><td></td><td>常磁性分子のin vitroおよびin vivoスペクトル収集用Lバンド(1.2GHz)電子常磁性共鳴(ESR)分光計</td></tr><tr><td>&nbsp;温度 &ガスコントローラー&nbsp;</td><td>Noxygen、ドイツ</td><td></td><td>温度 &温度とガス組成を制御および調整するように設計されたガスコントローラー&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH(L-グルタチオン減少)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp;マウス</td><td></td><td></td><td></td>社内</tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1マウス乳がん細胞</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6野生型マウス&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー排除染料&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>オーメダフルオテック 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン(IsoFlo)</td><td>アボットラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>σ-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>σ-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>σ-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラウダ サーキュレーター E100</td><td>ラウダ-ブリクマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH メーター Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuOプローブ</td><td>社内</td><td></td><td>Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanineプローブは、ref 13</td></tr><tr><td>NRプローブ</td>に従って合成されました <td>社内</td><td></td><td>Nitroxideプローブは、ref 11</td></tr><tr><td>RSSRプローブ</td>に従って合成されました <td>社内</td><td></td><td>二酸化二酸化プローブは、ref 15</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>In house</td><td></td><td>に従って合成されました。モノホション化トリアリールメチルプローブは、参考文献12に従って合成されました</td></tr></tbody></table>

生体内でph、 po2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの epr 評価

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

このプロトコルは、低磁場電子スピン共鳴 (EPR) の機能を示します-化学がん微小環境 (TME) の定量的な情報を提供するために機能の常磁性プローブとの組み合わせで技術をベースを含むpO2pH、酸化還元状態、間質性無機リン酸 (Pi) および細胞内グルタチオン (GSH) の濃度。特に、最近開発された水溶性多機能トリチル プローブのアプリケーションを提供比類のない機会を生体内での pH pO2 P同時測定Eでxtracellular スペース (希望プローブ)。プローブの分布と測定の時間の独立した相関分析の単一のプローブを使用して 3 つのパラメーターの測定を許可します。

組織pO2プローブを用いた LiNc BuO 評価:
手順 1.1 で説明されている手順を使用して、作りたて LiNc BuO 微結晶懸濁液の校正を行った。図 2は、LiNc BuO プローブと測定バッファー懸濁液と細胞の注入によって腫瘍開始後成長して女性の c57bl/6 マウスの乳腺腫瘍その例示の EPR スペクトルの線幅の典型的な酸素依存性を示しています内面化された粒子 (ステップ 3.1)。線幅の調整を使用して組織pO2値の計算は、 (図 2に示すスペクトル (b...

乳がんのマウス ・ モデルにおける腫瘍微小環境における重要な生理学的パラメーターの評価のため水溶性次亜硝酸、トリチル プローブを用いた低磁場 (L バンド、1.2 GHz) 電子常磁性共鳴を示した。

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

このin vivo電子常磁性共鳴技術の全体的な目標は、がんの動物モデルにおける前臨床環境における局所組織微小環境の生理学的に関連するパラメータを定量的かつ非侵襲的に評価することです。この技術は、フロロフィールドAPRと特別に設計された機能常磁性プローブの組み合わせに基づいており、ドック状態のCDTとしての組織酸素化、間質有機リン酸塩および細胞間濃度に関する定量的情報を提供します。この非侵襲的手法は、腫瘍微小環境と腫瘍再生の世界に対する独自の洞察を提供し、腫瘍微小環境を標的とした抗がん治療薬の将来の合理的な設計に貢献する可能性があります。この技術の応用は、多機能APRプローブの応用パラメータ間の脳の相関関係にまで及びます。したがって、根底にある生物学的メカニズムに関する追加の洞察を提供します。私とアンドレイに加えて、IMMRセンターのマリエタ・ジェンチェバとブノワ・ドリースシャート博士、そして大学院生のケイラ・スタインバーガーが手順を実演します。微粒子性酸素感受性プローブを調製するには、まず60ミリグラムの微結晶を秤量します。酸素感受性キャリブレーションのために、3ミリリットルのドルベッカス改質イーグル培地に微結晶を懸濁します。5ミリリットルのガラス丸底管に7ワットの電力を使用して、20キロヘルツのプローブ超音波処理器を使用して、氷上で5分間超音波処理します。次に、LバンドESR分光計の表面コイルリジネーターのガラス管に超音波処理された微結晶の1ミリリットルを入れます。摂氏37度の生理学的温度とゼロ、1、2、4、8、および20.9パーセントの酸素濃度で連続波ESRスペクトルを取得します。pHおよび酸化還元の二重機能プローブを調製するには、6.34ミリグラムのプローブを1ミリリットルの生理食塩水に溶解します。pHメーターを使用して、塩酸または水酸化ナトリウムを少量割り当てて、pHを7.2に調整します。ニトロキシドプローブのpHキャリブレーションを行うには、まず0.1ミリリットルのプローブストック溶液を0.9ミリリットルの2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液(150ミリモル塩化ナトリウム)に加えます。次に、得られた1ミリモルプローブ溶液を、pHメーターを使用して塩酸または水酸化ナトリウムを必要なpHに割り当てて滴定します。LバンドESR分光計を使用して、1.5ミリリットルの微量遠心チューブにサンプルのESRスペクトルを記録します。GSH感受性RSSRプローブを調製するには、4.05ミリグラムのプローブを1ミリリットルのDMSO溶液に溶解します。次に、RSSRとGSHの反応の速度定数の値を決定します。これを行うには、まず、0.98ミリリットルの1ミリモルリン酸緩衝液pH 7.2, 150ミリモル塩化ナトリウムに20マイクロリットルのRSSRストック溶液を加えて、0.2ミリモルのRSSRプローブ溶液を得る。次に、等量の0.2ミリモルRSSR溶液をGSH溶液の1つに混合して、プローブの最終濃度が0.1ミリモル、GSHの最終濃度が0.5、1、または2.5ミリモルになるようにします。RSSRとGSH溶液を混合した直後に、サンプルをESRリシグネーターに入れ、12秒ごとに10分間ESRスペクトルを記録します。次に、酸素pHおよびPi評価用の多機能HOPEプローブのモノラジカルスペクトル振幅の増加の動力学を計算します。10.7ミリグラムのプローブを1ミリリットルの生理食塩水に溶解し、pHを7.4に調整します。次に、調製した20マイクロリットルの原液を0.98ミリリットルの生理食塩水に加えて、0.2ミリモルのプローブ溶液を得ます。pHのプローブキャリブレーションのためには、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加してプローブ溶液の0.2ミリモルを滴定し、サンプルの最終希釈が1%未満になるように、テキストプロトコルに記載されているように、中間pHでESRスペクトルを取得します。酸素感度プローブのキャリブレーションでは、テキストプロトコルに記載されているように、さまざまな酸素濃度でプローブのESRスペクトルを取得します。Piのプローブキャリブレーションには、さまざまなリン酸濃度でプローブのESRスペクトルを取得します。PKAに近いpH値のラジカル溶液を使用し、さまざまなリン酸塩濃度で滴定します。以前と同様に温度とガス組成を維持します。微粒子プローブのMET1細胞への内在化のためのMET1腫瘍モデルの場合、MET1細胞を含有する10ミリリットルの培養培地を含むT75フラスコに100マイクロリットルの超音波処理懸濁液を添加する。すべての手順はバイオセーフティキャビネットで行われ、培地にはペニシリンとストレプトマイシンが含まれているため、潜在的な感染を最小限に抑えることができます。細胞を摂氏37度で72時間、または約80%の密度に達するまでインキュベートします。培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を5回洗浄します。5ミリリットルのトリプソンEDTAで細胞を剥離します。細胞を採取し、前回と同様に遠心分離した後、排除色素の細胞サンプルを染色して、細胞の生存率と量を決定します。細胞を100マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度で最小限のDMEMで懸濁します。インスリン注射器を使用して、テキストプロトコルに記載されているように、8週齢の雌の野生型マウスの4番目の乳腺脂肪パッドに、内在化した微結晶を含む細胞懸濁液100マイクロリットルをゆっくりと注入します。腫瘍の開始と成長を監視します。ESR分光測定では、テキストプロトコルに記載されているように、麻酔器を使用して空気イソフロラン混合物を吸入することによりマウスに麻酔をかけます。LバンドESR分光計を使用して、表面コイルリジネーターを正常な乳腺または乳腺腫瘍に載せて機能測定を行います。分光計の調整に進みます。可溶性プローブの場合は、プローブ注入直後に5〜10分間ESRスペクトルを取得します。移植後数週間にわたって、移植された粒子状プローブからESRスペクトルを5〜10分間取得します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、ESRスペクトルとプローブを分析します。ここでは、微粒子LiNc-BuOプローブの酸素に対するESRスペクトル感度を示します。ESRスペクトルは、pO2の0%、摂氏37度で測定されました。酸素分圧に対するプローブ懸濁液のESRスペクトルの線幅の代表的な依存性が示されています。線幅はpO2とともに直線的に増加します。麻酔をかけた雌マウスの乳腺腫瘍組織で測定されたスペクトルは、7.5ミリメートル水銀の組織部分酸素に相当します。NRプローブ溶液のLバンドESRスペクトルは、さまざまなpHレベルで摂氏37度で取得されました。pHで観察された超微細分裂定数の従属性がプロットされ、標準滴定曲線に適合されます。ここに示されているのは、酸化還元NRプローブの二重機能pHで酸素感受性LiNc-BuOプローブを組み合わせた多機能腫瘍微小環境評価です。NRの観察されたトリプレットスペクトルは、腫瘍内に埋め込まれたLiNc-BuOプローブの単一のESRラインと重ね合わせられます。細胞内組織グルタチオン濃度のin vivo ESR評価を以下に示します。RSSRプローブの正常乳腺における乳腺腫瘍におけるLバンドESRによって測定されたモノラジカルスペクトルピーク強度変化の動態を示します RSSRプローブの眼内注射直後。より速い動態は、腫瘍組織中のより高いGSH濃度を反映しています。この技術は、腫瘍微小環境の細胞生理学的重要なパラメーターと翻訳のトランスポテンシャルをin vivoで実行する機会を上回る、がん研究の分野の研究者を支援します。以前の手順に従ったプローブの感度には、合成化学の専門知識が必要であり、プレゼンテーションには重要です。当センターでは、この技術の難しさを共同で現場に報告しました。

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Research

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がん研究

低酸素誘導因子-1αの活性の生物発光イメージングは​​、乳がんの脳転移のマウスモデルにおける頭蓋内腫瘍の低酸素症の開発を監視するために適用されます。...

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L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.

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ATPサロゲートである非加水分解蛍光アデノシン三リン酸(ATP)の高い細胞分解能を可視化する再現性のある方法を開発しました。我々は、ヒト腫瘍組織を用いて異種移植されたヒト腫瘍細胞株および免疫不全マウスを用いて、イン ビトロ および インビボ内 独立のアッセイを用いて我々の方法を検証した。...

ヒト腫瘍細胞及び異種マウスにおけるマクロピノサイトシスにより媒介されるATP内在化のための蛍光顕微鏡

腹膜表面に転移したヒトがんの産生、培養、可視化のためのプロトコルについて説明します。切除した腫瘍標本をビブラトームを使用して切断し、透過性インサートで培養して酸素化と生存率を高めた後、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用したイメージングとダウンストリーム分析を行います。...

切除されたヒト腫瘍標本からの ex vivo 器官型偽粘液腫腹膜腫瘍スライスの培養とイメージング

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学ぶ低磁場電子常磁性共鳴技術を用いたマウス乳がんモデルの腫瘍微小環境における組織酸素化と代謝パラメーターの定量的かつ非侵襲的評価法。がん治療標的設計への応用可能性を示す。

生体内でPH、 pO₂、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

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