Name: アテローム性動脈硬化のイメージングのためのペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ単球標的ペプチド両親媒性ミセルの合成法。MCP-1を用いてアテローム性動脈硬化の早期・晚期病変を区別し、心血管イメージングの特異性を向上させる診断技術を習得できます。

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著者は、南カリフォルニア大学、国立心臓、肺と血の協会 (NHLBI)、R00HL124279、エリとエディス幅広いイノベーション賞、および L.K. ホイッティア財団の非癌から助成を受けたいと思いますトランスレーショナル研究賞は、EJC に与えられました。著者の電子顕微鏡と微量分析、NanoBiophysics の卓越性のセンター、分子特性の卓越性のセンター、臨床画像センターの支援のための南カリフォルニアの大学でセンターに感謝します。機器のセットアップ。

注: 試薬の MSDS を読むし、地方機関に必要なすべての化学安全対策に従ってください。
1. MCP 1 PAMs の準備
<ol><li>
MCP 1 ペプチドの作製
	<ol>
<li>Fmoc 保護-L-Lys (Boc) の 0.25 モル重量を量り-反応容器 (RV) の王。化学の発煙のフード 5 mL dimethylforamide (DMF) と RV の側をすすいでください。</li>
		<li>卓上型自動ペプチド合成装置に RV をロードします。あらかじめパッケージ化されたアミノ酸バイアル、N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', C から N 末端をロードします。最終的な脱保護手順の終わりに空のバイアルが含まれます。 注: シーケンス、N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C'、スクランブル ペプチドも合成できる同じプロトコルを使用しています。</li>
		<li>合成が完了すると、ペプチド樹脂から転送 RV 2 〜 3 mL のメタノールを用いたシンチレーション バイアルに樹脂のすべてが転送されるまで。樹脂は、底に沈んでいる後、培養上清中のメタノールを削除し、乾燥するまで残りを蒸発します。真空乾燥室温でさらに 2 時間または一晩。</li>
		<li>12 mL 胸の谷間溶液化学の発煙のフード 94:2.5:2.5:1 vol %trifluoracetic 酸 (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane を確認します。それは均等に混合されていることを確認して胸の谷間ソリューションを旋回します。 注意: triisopropylsilane とエタンジチある空気に敏感なため、アルゴンは triisopropylsilane と再びそれらを置く前に 1 分間エタンジチ株式バイアルをパージします。</li>
		<li>SV の半分下部クランプ アーム シェーカーに合成容器 (SV) を配置します。ペプチド樹脂のすべてが転送されるまでは、胸の谷間溶液 2 mL と SV にペプチド樹脂を転送します。</li>
		<li>3 mL 胸の谷間ソリューションと SV の側面を洗います。SV のキャップを閉じて、300 振動/分 4 h に振る。</li>
		<li>空 50 mL 遠心管を重量を量る。質量を記録します。</li>
		<li>4 h 後に、50 mL の遠心管に SV から裂かれたペプチド ソリューションを抜きます。残りの胸の谷間ソリューションで何回か SV をすすいでください。</li>
		<li>未満 4 mL 遠心管の残りがあるまでは、劈開ペプチドにより、窒素を蒸発させます。</li>
		<li>ペプチド切断ソリューションに冷たいエーテルの 36 mL を追加します。</li>
		<li>渦までソリューションは完全に白または黄色です。4 ° C で 5 分間 3,000 × g で遠心し、上清をデカントします。</li>
		<li>40 mL 冷たいエーテルをチューブに追加します。渦と再び超音波。遠心分離プロセスを繰り返します。上清をデカントします。</li>
		<li>窒素ガスパージ エーテルが蒸発して目に見えないまでに原油の PA ペレットを乾燥させます。</li>
		<li>二重蒸留水 20 mL を加えて水、渦、および超音波溶液中ペプチドを完全に溶解するまで。</li>
		<li>解決をフリーズ ・ ドライまで凍乾します。</li>
		<li>一度、ペプチドを乾燥すると、原油のペプチドを含む遠心分離機管の質量を重量を量る。5 mg/mL の水で粗ペプチドを溶解します。</li>
		<li>25 mg を 5 mg/mL の濃度を作るためには、ダブル蒸留水を 5 mL の原油の MCP 1 ペプチドを溶解します。0.1% 水 (溶媒) で TFA と 0.1% を用いた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による原油 MCP 1 ペプチドを浄化 C8 逆相カラムに移動相としてアセトニ トリル (溶剤 B) で TFA。ペプチドの 5 mL を HPLC に注入します。 注: 初期の移動相から成っていた 100% 溶剤溶剤 A ゆっくりと 27 分の 30% の減少し、この組成 3 分リターン 100% 溶媒へのグラデーションで 9.0 mL/分の流量で以上 3 分と 1 分を与えるためのこの構成で開催34 分の合計実行時間は、55 ° C でカラム温度を保つ分析のための肯定的なイオン ソース モードを使用します。ギ酸は、TFA がも HPLC カラムの酸性の場合、TFA の代わりに使用できます。有機溶媒組成傾斜速度がよりよい分離の 2%/min を超えないことをお勧めします。</li>
		<li>マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 質量分析法を用いた 2,890 で予想される製品 m/z 各分画を分析します。 注: は、マトリックス ソリューションとして 1 mg/mL にアセトニ トリル/水 (50: 50 vol %) で α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を溶解します。各分画の 0.75 μ L に続いて MALDI プレート ・ マトリクス ・ ソリューションの 0.75 μ L をスポットします。500 5,000 Da の質量範囲で正反射イオン モードを使用して解析を実行します。</li>
		<li>製品分数を組み合わせる、アセトニ トリル、吹き飛ばすフリーズして乾燥するまで浄化されたペプチッドを凍結乾燥します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP 1 PA の準備
	<ol>
<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-のN-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE ・ ペッグ (2000)-独立したシンチレーション バイアルにペプチドのマレイミド 1.1 モル超過分を準備します。ように二重蒸留水の両方の化合物を溶解 〜 15 mg/mL。超音波照射 15 分または両方のソリューションが完全に明確になるまで 注: DSPE ・ ペッグ (2000)-cy5 の組合せは、8.5 に、溶液の pH を調整する、DSPE ・ ペッグ (2000)-アミンと N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステル官能基化 Cy5 のステップ 1.2.3 を除いて、同じプロトコルを使用して合成されます。</li>
		<li>DSPE PEG (2000)-マレイミド ソリューションをペプチドのソリューションに追加します。渦と超音波。</li>
		<li>追加 1 M 水酸化ナトリウム滴 (1 μ L)、溶液の pH が 7 になるまでの時間で。</li>
		<li>5 分の窒素パージ ソリューションはソリューションを一晩撹拌します。</li>
		<li>解決をフリーズ ・ ドライまで凍乾します。</li>
		<li>粗生成物を乾燥すると、一度は、5 mg/mL の水に固体を溶解します。</li>
		<li>前述のように、高速液体クロマトグラフィーと浄化します。 注: 非ペプチド、DSPE-PEG(2000) 必要があります溶出 15-30% 有機濃度 (vol %)、間 DSPE PEG 中 (2000)-MCP 1 共役有機濃度が 40-50% の間溶出する必要があります。</li>
		<li>MALDI 質量分析法を使用して、対応する m/z. DSPE ペグ (2000)-MCP 1 は 5,760 m/z 幅広いピークを有するべきである各分画を分析します。 注: 2, 5-ジヒドロキシ安息香酸に適しています行列として DSPE ペグ (2000)-MCP-1 MALDI と。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP 1 PAMs のアセンブリ
	<ol>
<li>1.75 mg を溶解 1 dram 瓶で 3 mL のメタノールに MCP 1 PAs。超音波 MCP 1 PA を完全に溶解するまで。 注: Cy5 両親媒性物質は、イメージング用 MCP 1 PA 10: 90 のモル比で組み込むことができます。</li>
		<li>バイアルの下部に均一な膜が形成されるまで、バイアルの側面を離れて残りのメタノールをすすぎながら円を描くように窒素下でメタノールを蒸発させます。真空ドライ フィルムを一晩。</li>
		<li>3 mL の水またはリン酸バッファーが付いているフィルムを水和物生理食塩水 (PBS) MCP 1 PAMs の 100 μ M 溶液を作成します。優しく渦クリアまでソリューションを超音波と。80 の ° c で 30 分間インキュベートします。 注: 高温自己組織化プロセスを加速するために示されている、ペプチド コンポーネントで臨界ミセル濃度 (CMC)42,43を下げながら、最も安定した二次構造を形成できます。</li>
		<li>部屋の温度に結果の分散をクールします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MCP 1 PAMs のキャラクタリゼーション
<ol><li>
動的光散乱法 (DL) とゼータ電位
	<ol>
<li>MCP 1 PAM または DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットでスクランブル PAM の場所 100 μ M。 注: DL とゼータの潜在的なキュベット異なることがあります機器の指示に基づいています。</li>
		<li>部屋の温度に楽器を平衡します。サイズと PAM の表面電荷を測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
透過型電子顕微鏡 (TEM)
	<ol>
<li>7 μ L を追加 50 μ M の MCP 1 PAM またはスクランブル PAM TEM グリッド上に内で中断 5 分芯先の自己終了ピンセット繊細な作業で拭きます液滴。</li>
		<li>グリッドを洗浄する水の 7 μ L を追加します。液滴を離れて放出します。</li>
		<li>液滴 1 wt % リンタングステン酸 2 分芯先の 7 μ L を追加します。2.2.2 手順を繰り返します。</li>
		<li>TEM 分析の前に TEM グリッドを乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
円二色性 (CD) による
	<ol>
<li>楽器の使用前に 5-10 分の窒素をオンにします。</li>
		<li>キュベットに空白 (水または PBS) の 300 μ L を配置します。</li>
		<li>190 265 nm、1 s 積分時間と室温で 1 nm の帯域パス長さが 0.2 mm でスペクトルを測定します。3 複製を収集します。</li>
		<li>メジャー 100 μ M MCP 1 ペプチド、MCP 1 PAM、ペプチド、スクランブル、PAM をスクランブル手順 2.3.3 で説明した同じ条件の下で。空白から減算します。</li>
		<li>ポリリジン的スペクトルの線形補間を使用して、データに合います。</li>
		<li>機器の電源を切ります。窒素をオフにする前に 10 分を待ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 MCP 1 PAMs のin Vitro解析。
<ol><li>
In vitro生体適合性
	<ol>
<li>文化、WEHI 274.1 ダルベッコ変更イーグル培 10% 牛胎児血清 (FBS)、マウス単球を展開 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと 0.05 mM 2-メルカプトエタノール 37 ° c 未満 5% CO2通路 5 に。 注: WEHI 274.1、懸濁細胞です。養殖するときメディアは 2-3 日毎を補充する必要があります。</li>
		<li>ピペット滅菌 50 mL の遠心管にメディアに単球。300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心</li>
		<li>古いメディアを吸引し、遠心管に 10 mL の新鮮なメディアで再懸濁します。メディアで均等な細胞までゆっくりと混ぜます。トリパン ブルー染色、診断を使用してセルをカウントします。</li>
		<li>90 μ L/ウェル メディアのあたり 4,000 球されるようセルを希釈します。96 ウェル プレートのウェルの細胞の 90 μ L を追加します。24 時間インキュベートします。 注: は、蒸発の違いとプレートの温度変化を避けるためにプレートの外側の端に井戸を使用しないでください。100 μ L の PBS で外装の井戸を埋めます。</li>
		<li>MCP 1 ペプチド、MCP 1 PAM、スクランブルをかけられたペプチッド、または独立した滅菌マイクロ遠心チューブ用の 150 μ L の PBS でスクランブル PAM の 0.15 µmol を溶解します。1、10、および 100 μ M の各サンプルの 65 μ L にするシリアル希釈を実行します。</li>
		<li>井戸 WEHI 274.1 を含む各濃度の 10 μ L の PBS を追加 (合計ボリューム: まあ、6 行、合計 96 ウェルあたり 100 μ L)。72 時間インキュベートします。</li>
		<li>10 μ l 添加 (各ウェル内 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS)。1 時間インキュベートします。</li>
		<li>490 プレート リーダーを使用して吸光度を分析 nm または製造元の指示に基づいて。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ミセル バインディング体外
	<ol>
<li>100 μ M Cy5 標識 MCP 1 PAM (DSPE PEG (2000)-Cy5 と MCP 1 PA の 10: 90 モル比) を含むメディアの 2 mL で 6 ウェル プレートの各ウェル内シード 500,000 単球。1 時間インキュベートします。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 300 × g で遠心分離によって WEHI 274.1 を収集します。メディアを吸い出しなさい。</li>
		<li>再懸濁します、2 mL の PBS のセルを洗浄します。300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心PBS を吸い出しなさい。2 mL の PBS で洗浄工程を繰り返します。PBS を吸い出しなさい。</li>
		<li>セルを修正する冷たい 4% パラホルムアルデヒドの 2 mL を追加します。10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>ピペット 6 ウェル プレートのウエル内で滅菌ガラス基板上に固定のセル。5 分間 400 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>パラホルムアルデヒドを削除します。洗って、2 mL の PBS で 1 回洗浄します。1 ml の PB 再懸濁します 注: ときにすすぎ、上、セルを中断しません。</li>
		<li>スライドに PBS で 90% のグリセロールの 10 μ L を入れてください。針とピンセットを使って、coverslip を拾います。ドライエッジ、カバーガラスの。ゆっくりとスライドに coverslip を置きます下向き。</li>
		<li>軽くクリアのマニキュアとカバーガラスの端を密封します。画像の準備ができるまで、冷蔵庫に置きます。</li>
		<li>共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) Cy5 用レーザーでインストールされている λ励起を使用 = 650 nm。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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MCP 1 PAMs が有望な分子イメージング プラットフォーム ターゲットの親水性ペプチドとナノ粒子の自己組織化の性質をドライブ疎水性の尾部から成る。この単球を対象としたミセルは、単純な合成と精製ステップ MCP 1 ペプチドおよび DSPE PEG (2000)-MCP 1 で用意できます。Pam がある生体内で分子イメージングなどの多くの有益な特性の自己集合構造と化学的多様性の他のイメージングの鎖の結合を可能にする、本質的な生分解性、温和な条件下または興味の特定のサイトを選択的に配信するペプチドをターゲットします。粒子サイズ、形状、および構成は、ペプチド、疎水性尾またはアプリケーション22,33のさまざまな最適な化学および物理的特性を許可するミセル濃度を変更することによって調整できます。
このプロトコルのいくつかの制限を記載する必要があります。まず、Pam は、疎水性相互作用によって駆動される、ので、親水性、ターゲット部位のミセル表面に提示す...

心血管疾患は、グローバル、約 1730 万死亡世界中1死の主要な原因に残る。心血管疾患は、アテローム性動脈硬化プラークは動脈、それにより阻害血ボディ2,3のセルに酸素の流れ構築する条件で貢献しています。動脈硬化の進行には、炎症反応、不規則な脂質代謝、プラーク形成、プラーク破裂、心筋梗塞4,5につながる、肥厚、動脈硬化が含まれます。血管内皮細胞は、MCP 1 球6,7,8の表面に C C ケモカイン受容体 (CCR2) にバインドするは、サイトカイン、および接着分子を表現します。酸化コレステロール地域で炎症反応を増幅し、組織の損傷や不安定や脆弱なプラーク9,の形成につながるプラーク形成の初期の段階に単球をマクロファージに変換します10。
伝統的に、アテローム性動脈硬化は、血管造影または超音波11,12を使用して解剖学的イメージングによる内腔の狭窄を評価することによって評価されます。ただし、これらのメソッドは高度の狭窄動脈壁の動脈硬化の初期段階を判断できますのみ初期プラークの成長を引き起こす動脈動脈のサイズを維持し、血の流れ率12,13、改造、 14。したがって、血管造影は動脈硬化症の有病率を初期します。また、単一光子放出など非侵襲的イメージング技術計算トモグラフィー、陽電子放射断層撮影、磁気共鳴イメージング最近最初の詳細を提供できるようプラーク形態の特性に使用されているとプラークの評価ただし、これらの様式の感度、空間分解能の不足によって限られているまたははるか挑戦15,16、さまざまな段階でのイメージングのプラーク進行を作って、電離放射線を使用する必要 17。具体的には動脈硬化のさまざまな段階でプラクを識別する画像配信システム開発するままになります。
ナノ粒子は、生体内でプラークをターゲットと診断18,19,20,21新たなプラットフォームであること示されています。特に、PAMs が彼らの化学的多様性と様々 な鎖、組成物、サイズ、形状、および表面機能化22に対応する能力のため有利であります。両親媒性ペプチド (PAs) から成っている、親水性ペプチド"headgroup"通常脂質である疎水性尾に接続されています。この両親媒性構造は、自己組織化機能を付与でき、多価ペプチド粒子22,23,24の表面に表示するため。ペプチド headgroups は折りたたみとペプチド25との水素結合を介して粒子形状に影響を与えます。Β シートの相互作用を介してフォールド ペプチド α ヘリカル確認両方球形と細長いミセル22,23,24,を形作ることができる間、細長いミセルを形成する示されている25,,2627。親水性ペプチドおよび PAMs、全身循環28,ナノ粒子の可用性が強化の疎水性尾間ペプチドの表面電荷をシールド ポリエチレング リコール (PEG) リンカーを配置できます。29,30,31. PAMs は、生体適合性、アプリケーションの32,33の広範な範囲を持っているが示されているためにも有利。ミセルの水容解性は、水溶性ではなく、注射34solubilizers で中断する必要がある特定の高分子ナノ粒子など他のナノ粒子ベースのシステム上の優位性を提供しています。また、特定の刺激に対する反応で分解 PAMs を作成する機能は制御された細胞内薬剤配達35の魅力的な候補 PAMs になります。
CCR2 受容体に結合し、大動脈弓に蓄積、PAMs 以前単球9大動脈の動脈硬化病変のさまざまな段階を監視するターゲットのため開発されました。アポ-/-マウスの単球の蓄積はプラーク進行36に比例して増加します。さらに、破断が発生しやすい、後期の斑の患者が単球37の多量を含むことがわかった。したがって、MCP 1 を組み込むに PAMs の変更は大きいターゲット特異性と初期と後期段階のアテローム性動脈硬化病変の区別できるため便利です。また、これらの概念実証研究確認 PAMs は pre-clinically を使用するのに十分な安全する renally の38がクリアされます。MCP 1 PAMs 動脈硬化症8,,3940を超えてその他の疾患の治療および診断アプリケーションで使用する可能性のある単球や炎症は他の病気の特徴なので,41。
ここで、粒子の最適なサイズ、表面電荷、およびアテローム性動脈硬化で強化されたイメージング用単球を選択的ターゲティングを示した拡張性と自己組織化の MCP 1 PAMs の作製を報告する.

<table><tbody><tr><td>ペプチド合成用</td><td>1,2-エタンジチオール</td><td>VWR</td><td>E0032</td></tr> 細胞<tr><td>培養用</td><td>10mL使い捨て血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-898</td></tr><tr><td>15mL遠心分離管、ポリプロピレン</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>さまざまな用途向け</td></tr><tr><td>2,5-ジヒドロキシ安息香酸、99%</td><td></td><td>MALDI 25</td>mL使い捨て用フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td>AC165200050</tr><tr><td>細胞培養用血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール、50 mM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31350010</td>細胞<td>培養用</td></tr><tr><td>5 mL ディスポーザブル血清ピペット</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>細胞培養</td></tr>用 <tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>さまざまな用途用</td></tr><tr><td>75 cm2 培養フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-680-65</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>75 mL 反応容器</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>ペプチド合成用</td></tr><tr><td>96 ウェル細胞培養プレート</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>MTS アッセイ</td></tr>用 <tr><td>アセトニトリル、HPLC グレード</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>HPLC 精製</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス、1 ドラム</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>PAM 合成用</td></tr><tr><td>ホウ珪酸ガラスピペット、ロングチップ</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>様々な用途に対応</td></tr><tr><td>カバースリップ、0.16-0.19 mm、22 x 22 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-542B</td><td>共焦点顕微鏡用</td></tr><tr><td>Cy5 アミン</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>ペプチド抱合用</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル、ACSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E138-1</td><td>ペプチド沈殿用</td></tr><tr><td>使い捨てシリンジ、20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>HPLC精製用</td></tr><tr><td>ダブルノイバウアールール血球計算計</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) アミン</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>ペプチド抱合</td></tr>用 <tr><td>DSPE-PEG(2000) マレイ</td>ミド <td>Avanti</td><td>880126P</td><td>ペプチド抱合用</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHSエステル&nbsp;</td><td>Cy5</td>Dulbeccoの修飾されたワシ中高グルコースへの結合のための<td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td></tr><tr><td></td><td>細胞培養のための</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、修飾された、熱不活性化</td><td>細胞培養のための</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td></tr><tr>ペプチド<td>合成</td><td></td><td></td><td></td>のためのFmoc-L-Ala-OH /HBTUタンパク質技術PS3-H5-A</tr><tr><td>ペプチド合成のためのFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-RBF</td> ペプチド<td>合成</td></tr>のための<tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-NT</td><td>ペプチド合成のための</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td> ペプチド<td>合成のための</td><td>PS3-H5-CT</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>ペプチド<td>合成のための</td><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-I</td> ペプチド合成</tr>のための<tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-L</td><td>ペプチド合成のための</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術PS3-H5-KBC</td><td></td><td>ペプチド合成のための</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-F</td> ペプチド<td>合成のために</td></tr><tr>ペプチド<td>合成のための</td><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-SB</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-TB</td><td>ペプチド合成のための</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-YB</td><td>ペプチド合成のための</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>タンパク質技術</td><td>PS3-H5-V</td> ペプチド<td>合成のために</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang樹脂、ペプチド合成用100-200メッシュ</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、オプティマLC / MSグレード</td><td>HPLC精製用</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A117-50</td></tr> 共<tr><td>焦点顕微鏡用</td><td>グリセロール</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td></tr><tr>細胞<td>計数用</td><td>ハンドタリーカウンター</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S90189</td></tr><tr><td>マグネティックスターバー、卵形</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>ペプチド結合</td></tr><tr><td>用 メタノール、ACS認定</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-4</td><td>PAM合成用</td></tr><tr><td>MTS細胞増殖比色アッセイキット</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>MTSアッセイ</td></tr><tr><td>用 N,N-ジメチルホルムアミド、シーケンシンググレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1160-4</td> ペプチド<td>合成</td></tr>用 <tr><td>N-メチルモルホリン</td><td>タンパク質技術</td><td>S-1L-NMM</td><td>ペプチド合成</td></tr>用 <tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー 細胞</td><td>固定用</td><td>AC416780250</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10010049</td><td>さまざまなアプリケーション用</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン、10,000 U/mL</td> サー<td>モフィッシャー サイエンティ</td>フィック <td>15140122</td> 細胞<td>培養用</td></tr><tr><td>ペプチド合成容器、25 mL&nbsp;</td><td>ペプチド合成</td>のための<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CG186011</td></tr>リン<tr><td>タングステン酸&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>TEM</td></tr><tr><td>ピペリジン</td><td>スペクトル</td><td>用 P1146-2.5LTGL</td><td>ペプチド合成用</td></tr><tr><td>プレーンガラス顕微鏡スライド 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>共焦点顕微鏡用</td></tr><tr><td>試薬リザーバー、滅菌&nbsp;</td><td>細胞培養用</td><td>VWR</td><td>95128093</td></tr><tr><td>TEM用自己閉鎖ピン</td>セット<td>TedPella</td><td>515</td><td></td></tr><tr><td>TEMサポートフィルム TEM用</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸&nbsp;</td><td>ペプチド切断およびHPLC精製用</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP618-500</td></tr><tr>ペプチド<td>切断</td>用<td>トリイソプロピルシラン</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、</td><td>細胞計数用</td>0.4%<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250061</td></tr><tr>ピンセット、<td>共焦点顕微鏡用</td><td>汎用鋸歯状</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp;CRL-1679</td><td>マウス単球</td></tr><tr><td>自動ベンチトップペプチドシンセサイザー</td><td>プロテインテクノロジーPS3</td><td></td><td>ベンチトップペプチドシンセサイザー</td></tr><tr><td>&α;-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、99%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>476870-2G</td><td>マルディ用</td></tr></tbody></table>

アテローム性動脈硬化のイメージングのためのペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの合成

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

動脈硬化は 1730 万生活を毎年要求する心血管疾患死、世界中の主要な原因への主要コントリビューターです。動脈硬化も突然死や心筋梗塞、不安定プラークは破裂し、警告することがなく血管を閉塞、によって扇動されるの主要な原因です。現在の画像診断法は、安定・不安定プラーク破裂を区別できません。病気の組織に結合する部分をターゲットのさまざまな変更できます、ペプチド両親媒性ミセル (PAMs) はこの欠点を克服することができます。単球は、球の大きい蓄積が破裂しやすいプラークを関連付けながら、動脈硬化の初期マーカーのように示されています。したがって、単球を対象とするナノ粒子は、アテローム性動脈硬化のさまざまな段階を識別する使用できます。ここでは、その終わりには PAMs の単球ターゲットの準備のためのプロトコル記述 (単球走化性因子蛋白質 1 (MCP 1) PAMs)。MCP 1 PAMs が 15 のフォームのナノ粒子に温和な条件下での合成を通じて組み立てられ自己と表面電荷は中性付近の径 nm。体外、 PAMs 生体適合性であると見つけられたおよび単球に高い結合親和性を持っていた。記載法は、動脈硬化だけでなく、その他の炎症性疾患のアプリケーションの広い範囲のための約束を示す.

MCP 1 PAM の準備 MCP 1 蛋白質 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] または [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] スクランブル ペプチドの CCR2 結合モチーフ (残 13 35 基) は、N 末端のシステイン残基を追加することによって変更されました。自動ペプチド合成を用いた fmoc 保護を介した固相法による MCP 1 ペプチドが合成されました。粗ペプチドは 0.1% を使用して 50 ° C にある C8 カラムを逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製したアセトニ トリル/水混合媒体の TFA と MALDI 質量分析法 (図 1) によって特徴付けられます。システインを含むペプチドは、DSPE-PEG2000-マレイミド チオエーテル結合を介して DSPE ペグ (2000)-ペプチド複合体をもたらすために共役しました。室温で 24 時間後粗生成物は高速液体クロマトグラフィー (<strong class="xfig...

合成やペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの評価手法を提案し、生体適合性および単球にバインドするミセルの機能をテストするための試金の対応します。

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

このプロトコールの全体的な目標は、アテローム性動脈硬化症のイメージングのために単球標的ペプチド両親媒性ミセルを合成することです。この方法は、アテローム性動脈硬化性プラークの画像診断に関する心血管分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ペプチド両親媒性ミセルをMCP-1に組み込むことで、早期および後期のアテローム性動脈硬化病変間の標的化特異性と鑑別が可能になることです。この技術の意味は、破裂しやすい後期プラークの患者にはより多くの単球が含まれているため、アテローム性動脈硬化症のさまざまな段階でのプラークの診断にまで及びます。この方法はアテローム性動脈硬化症への洞察を提供することができますが、癌などの他の病気にも適用できます。私と一緒に手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるJonathan Wangです。まず、反応容器内の0.25ミリモルのfmach-L-lysine-bach-wong-resinを秤量します。容器を化学ドラフトに移し、容器の側面を5ミリリットルのジメチルフォラミドですすいでください。反応容器と包装済みのアミノ酸バイアルをC-to-N末端から自動ベンチトップペプチドシンセサイザーにロードします。これには、最終的な脱保護セット用の空のバイアルが端に付いています。合成を実行した後、ペプチドと樹脂を反応容器から2〜3ミリリットルのメタノールを含むシンチレーションバイアルに移し、すべての樹脂が移されるまで移します。樹脂がバイアルの底に沈んだら、スーパーナンを取り出して樹脂を自然乾燥させ、室温で少なくとも2時間真空乾燥させます。バイアルが完全に乾いたら、クランプを使用して合成容器の下半分をアームシェーカーに固定し、シンチレーションバイアルに2ミリリットルの切断液を加えます。ペプチド樹脂の全容量を合成容器に移し、容器の側面を3ミリリットルの新鮮な切断液で洗浄します。次に、蓋をした状態で容器を毎分300回の振動で4時間振とうします。振とうインキュベーションの終了時に、切断したペプチド溶液をバランスのとれた50ミリリットルの円錐管に排出し、残りの切断液で合成容器を数回すすぎます。遠心チューブ内に残る溶液が4ミリリットル未満になるまで、切断したペプチド溶液を窒素で蒸発させ、ペプチド切断溶液に36ミリリットルの氷冷エーテルを加えます。得られた溶液をボルテックスします。懸濁液が完全に白色または黄色に変わったら、遠心分離によりペプチドをペレット化します。ペプチドを40ミリリットルの氷冷エーテルに再懸濁し、ボルテックスし、ペプチドを再度超音波処理します。2回目の遠心分離と上清のデカンテーションの後、粗ペプチド両親媒性ペレットを窒素ガスパージで乾燥させます。エーテルが目に見えて蒸発したら、20ミリリットルの二重蒸留水をチューブとボルテックスに加え、ペプチドが溶液に完全に溶解するまでチューブを超音波処理します。溶液を凍結し、乾くまで寿命を延ばします。次に、チューブを再度秤量し、粗ペプチドを1ミリリットルあたり5ミリグラムの水に溶解します。次に、粗 MCP-1 ペプチドの全量を高性能液体クロモトグラフィーまたは HPLC 装置に注入します。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を使用して、予想される製品質量電荷が2, 890であるため、各画分を分析します。次に、製品分数を組み合わせます。アセトニトリルを吹き飛ばし、精製したペプチドを乾燥するまで凍結して寿命を延ばします。MCP-1ペプチド両親媒性菌またはPAを調製するには、まず生命化ペプチドを15ミリグラム/ミリリットルの水に溶解し、ペプチド溶液を1ミリグラム/ミリリットルのDSPE PEG 2000ミリイミド溶液と組み合わせます。溶液のpHが7に等しくなるまで、1モルの水酸化ナトリウムを滴下します。その後、窒素を5分間パージし、続いて一晩攪拌します。翌朝、溶液を凍結して寿命を延ばします。粗製品が乾燥したら、固体を5ミリグラム/ミリリットルの水に溶解し、先ほど示したようにHPLCでペプチドを精製します。PAメンブレンを組み立てるには、1ドラムのバイアルで1.75ミリグラムのMCP-1 PAを3ミリリットルのメタノールに溶解し、MCP-1 PAが完全に溶解するまで超音波処理します。バイアルを円を描くように動かし、残りのメタノールをバイアルの側面から洗い流しながら、メタノールを窒素下で蒸発させます。フィルムを一晩真空乾燥します。翌朝、フィルムを3ミリリットルの水で水和させて100マイクロモルのMCP-1 PAM溶液を作り、溶液を穏やかにボルテックスして透明になるまで超音波処理します。溶液を摂氏80度で30分間インキュベートし、得られた分散液を冷却します。以下の代表的な実験では、MCP-1とスクランブルペプチドを、アセトニトリル水混合物中の0.1%トリフルオロ酢酸を用いて、CAカラム上で50°Cの逆相HPLCにより精製しました。また、先ほど示したように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析によって特徴付けられます。残留物含有ペプチドをDSPE PEG 2000ミリアミド上に結合させて、チオエーテル結合を介してDSPE PEG 2000ペプチド結合体を生成し、C4カラムを使用してHPLCで精製しました。動的光散乱解析と透過型電子顕微鏡によるPAMを標的とする単球のイメージングにより、わずかに正のゼータ電位を持つ十分に分散した球状ナノ粒子が明らかになりました。環状二振性分光法分析により、ミセル内にMCP-1ペプチドが取り込まれ、二次構造が増強されることが確認されました。最大100マイクロモル濃度のMCP-1ペプチド、MCP-1 PAM、スクランブルペプチド、およびスクランブルPAMを用いたアマルス単球を72時間インキュベートしたところ、ペプチドの生存率と生体適合性が実証されました。次に、スクランブルPAMと比較した単球のMCP-1 PAMへの特異的結合は、共焦点顕微鏡法によって確立されます。このビデオを見た後、MCP-1ペプチドの合成と精製、およびMCP-1ペプチド両親媒性およびミセルアセンブリの調製を通じて、単球ターゲティングペプチド両親媒性ミセルを調製する方法を十分に理解できるはずです。化学試薬の取り扱いは非常に危険であり、この材料を扱う際には、MSDSの読み取りや化学ドラフト内での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

synthesis-monocyte-targeting-peptide-amphiphile-micelles-for-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。...

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

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複数の腫瘍マーカーのターゲットとするためのポリリンゴ酸ベースのナノバイオポリマー：個別化医療の機会？

私たちは、がんの光音響イメージングのための金ナノロッドを含む細胞ビヒクルの準備と実現可能性を示しています。...

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

マイクロ波技術は、アテローム性動脈硬化症のプラークの特徴付けのための酸化鉄ナノ粒子の非常に高速な合成を可能にします。ナノ粒子の外部側のアミノビスフォスフォネートの使用は、アテローム性動脈硬化症領域での高速蓄積を提供します。...

アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

高い特異性で副作用を軽減して腫瘍部位に抗がん剤を送達するためには、ナノ粒子に基づく新しい方法が必要です。ここでは、過酸化水素を介した酸化によって容易に調製でき、還元腫瘍環境下で効率的に解離してペイロードを放出できるジスルフィド架橋ミセルについて説明します。...

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

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細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis...

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

ひと内皮細胞膜間での単球によって輪廻と泡沫細胞にその後成熟を測定するプロトコルについて述べる。これは、別の病気の条件を持つ人々...

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。...

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

ここでは、文化、人間の神経前駆細胞への自己組織化3次元足場の使用を説明します。我々は、フローサイトメトリーで、その後、例えば、分析する足場から細胞を解放するためにプロトコルを提示する。このプロトコルは、詳細な機構的な研究を行うために他の細胞型に適応される可能性があります。...

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

学ぶ単球標的ペプチド両親媒性ミセルの合成法。MCP-1を用いてアテローム性動脈硬化の早期・晚期病変を区別し、心血管イメージングの特異性を向上させる診断技術を習得できます。

アテローム性動脈硬化のイメージングのためのペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの合成

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