ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

この手順の全体的な目標は、遺伝子構造の定義、関連するタンパク質モチーフ、染色体の位置、遺伝子重複、発現パターンなど、植物の遺伝子ファミリーをグローバルなアプローチで網羅的に特徴付けることです。この方法は、家族のメンバーの世界ゲノム同定や遺伝子発現解析によるトランスクリプトーミーなど、家族内の植物の分類における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順全体の主な利点は、完全な遺伝子ファミリーの特性評価を達成するための実験ステップの網羅的なリストを提供することです。

この手順は、遺伝データが利用可能なあらゆる植物種の任意の遺伝子ファミリーに適用できます。さらに、このアプローチは、機能研究の興味深い候補を特定するための貴重な情報を提供します。全手順を実演するのは、私の研究室のピエトロ・アリアーニです。

Blast の Web ページを開き、タンパク質 blast セクションをクリックします。「Enter query sequence」フィールドに、他のファミリーメンバーを同定するためのプローブとして使用されるタンパク質のアミノ酸配列を入力します。ファミリーを特徴付けるすべての重要な特徴を持つタンパク質を使用してください。

次に、検索セットを選択するフィールドで、参照タンパク質データベースと目的の生物を選択します。次に、フィールド・プログラム選択で、PSI-BLAST アルゴリズムを選択します。必要に応じて、アルゴリズムパラメータをクリックして、最大ターゲットシーケンスやスコアリングマトリックスなどの高度なパラメータを調整します。

E 値はしきい値で、この検索では 005 から 001 に減少します。[BLAST]ボタンをクリックして、解析を実行します。クエリに対する相対的な一致を表示しているすべてのシーケンスから、ファミリーに明らかに属していないエントリの選択を解除します。

これを行うには、PSI-BLASTの選択列のチェックマークをクリックします。次に、goボタンをクリックして2回目のPSI-BLAST反復を実行します。新しく同定されたすべての配列は黄色で強調表示されます。

再度、ファミリーに属さないヒットの選択を解除します。アルゴリズムが関連するエントリを見つけられないか、収束に達するまで、このプロセスを続けます。すべての偽陽性が取り除かれたら、アミノ酸配列をFASTA形式のファイルに収集し、そのファイルをバイオインフォマティクスソフトウェアスイートにアップロードします。

次に、インポートしたすべてのシーケンスをリストから選択し、ツールバーのalign/assembleボタンをクリックします。次に、[ペアワイズマルチプルアライメント]をクリックし、[MUSCLEアライメント]と[OK]を選択します。配置はデフォルトを使用して行われるようになります。次に、アラインメントの配列ロゴを視覚化し、遺伝子を視覚的に検査して偽陽性を検索します。

タンパク質の物理的パラメータとドメイン、染色体分布、重複、およびエクソンイントロン組織のさらなる解析は、テキストプロトコルに記載されています。次に、高品質の系統樹の構築と家族命名法の定義を通じて、ATLファミリーメンバー間の関係を分析します。まず、ブドウのつる遺伝子命名法の参照として必要なアラブの採用systeliana ATL配列を、参照用のUmoProtデータベースから取得します。

次に、系統解析のために、ブドウの木とシロイヌナズナの遺伝子ファミリーメンバーのすべての塩基配列を含む FASTA ファイルを作成します。次に、phylogeny Franceのホームページを参照し、系統解析パイプラインを選択します。ほとんどの場合、ワンクリックが適していますが、必要に応じて、詳細オプションを使用して特定の詳細設定を選択したり、アラカルトオプションを使用して完全にカスタマイズされた分析を選択したりすることができます。

次に、解析の名前を入力し、FASTAファイルをアップロードします。次に、[送信] をクリックして分析を実行します。この手順でエラーメッセージが表示される場合は、系統発生スイートパイプラインの各ステップを個別に完了します。

まず、MUSCLEソフトウェアのホームページに移動し、FASTAファイルをアップロードします。出力形式としてPearson FASTAを選択し、送信します。次に、ファイルをFASTA形式でダウンロードし、位置がずれている位置を排除します。

G-blockサーバーツールを開き、アラインメントFASTAファイルをアップロードし、配列の種類としてDNAを選択し、解析に最も適したストリンジェンシーを選択します。ブドウのつるATL遺伝子ファミリーのアラインメントについては、配列の分岐が大きいため、選択が厳密でないために提案された3つのオプションすべてを選択します。次に、[ブロックの取得] をクリックして解析を実行します。

結果を保存するには、出力ページの下部にある結果の配置をクリックし、新しいFASTAファイルを作成します。Gブロックは、DNAの発散領域または突起アライメントのアライメントが不十分な位置を排除し、系統解析により適したものになります。この手順では、列の厳密性に対するインペリクル パラメーターの選択は、列が 3 つの負債であることを確認するために重要です。

ツリーを完成させるために、Phylogeny Franceのホームページに移動します。そこで、アラカルト パイプラインを選択し、複数の配置と配置のキュレーションのオプションの選択を解除します。次に、「ワークフローの作成」をクリックし、GブロックでキュレーションされたFASTAファイルをアップロードし、ブートストラップ手順を選択して、デフォルトのパラメーターと設定を使用します。

最後に、[送信] をクリックして分析を実行します。これで、段階的なプロセスは完了です。系統樹が作成されたので、ブートストラップ値が70%未満のサポートが不十分なブランチを折りたたむ次に、最終結果をNewick形式でダウンロードして、さらに分析します。

テキストプロトコルは、系統発生に基づいて遺伝子名を割り当てる方法を提供します。このプロトコルでは、遺伝子発現ライブラリから取得したarma正規化された発現値のタップされた行付きテキスト形式のファイルを作成します。各ファミリー遺伝子の値を同じパターン行の下に整理します。

次に、Multi-experiment Viewerソフトウェアを使用して、階層型バイクラスター分析を実行します。まず、作業データマトリックスをアップロードし、テキストファイルを選択します。単色配列を選択し、自動注釈が指定されていない場合は、注釈の読み込みから目盛りを削除します。

式テーブル プレビューの左上の式の値を選択し、読み込みボタンをクリックします。次に、Log2変換と遺伝子/行の正規化を適用してデータを調整します。次に、適切なスケール制限を設定します。

次に、階層クラスタリングを計算します。ordering optimizationフィールドで、optimize gene leaf orderおよびoptimize sample leaf orderを選択します。次に、リンケージ方法選択フィールドで平均リンケージクラスタリングを選択し、距離行列選択フィールドでピアソン相関を選択します。

次に、[OK]をクリックして解析を実行します。ウィンドウの左側のパネルで結果を表示し、ファイルメニューの[画像を保存]をクリックしてヒートマップをエクスポートします。BLAST-P検索によると、シロイヌナズナATL2に最も類似した遺伝子は、ブドウのつるゲノムのATLファミリーメンバーを調査するために使用されました。

PSI BLAST解析は数サイクル後に収束し、遺伝子ファミリーの推定遺伝子のリストを提供しました。各候補の正準環H2ドメインの存在は、MUSCLEアラインメントの目視検査によって評価されました。これにより、検索は96のブドウの遺伝子に絞り込まれました。

同定された遺伝子の系統解析を行い、それらをシロイヌナズナATL遺伝子ファミリーと比較した。命名法には、96のブドウのつるATLのうち13がシロイヌナズナATL遺伝子オルソログとして特定の識別子を付与された。階層的なバイクラスター解析を使用して、同定された遺伝子をブドウの木のグローバル遺伝子発現アトラスにマッピングすると、96個すべてが少なくとも1つの組織で発現しており、5つの発現クラスターを同定できることが示されました。

同様のアプローチを適用して、生物的ストレスに応答したこれらの遺伝子の発現を研究しました。病原体感染に応答してATL遺伝子ファミリーが直接関与しており、62の遺伝子が少なくとも2つの条件で有意な調節を示した。このビデオを見れば、遺伝子ファミリーの特性評価に使用されるソフトウェアの扱い方について十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、特定の遺伝子ファミリーの特性と、全ゲノムファミリーメンバーの同定に使用される対応するプローブを慎重に定義することが重要です。この手順に従うと、遺伝子ファミリーの命名法の帰属に必要な種以外のいくつかの種に基づいて追加の系統樹を作成することにより、遺伝子ファミリーの進化とP30の機能を調べることができます。