Name: ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ ブドウにおけるATL E3ユビキチンリガーゼ遺伝子家族の包括的な同定と特性評価の方法。ゲノムワイド探索と発現メタ分析により、遺伝子構造、タンパク質モチーフ、染色体位置、重複、発現パターンを明らかにします。

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仕事は、共同のプロジェクト 2014 (特性グレイプバインの ATL の遺伝子ファミリーとPlasmopara 大期に抵抗に関与) の枠内でヴェローナ大学によって支えられました。

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<li>Wong, D. C. J., Matus, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+Integrated+Networks+for+Identifying+New+Secondary+Metabolic+Pathway+Regulators+in+Grapevine%3A+Recent+Applications+and+Future+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities.</a> Front. Plant Sci. 8, 505(2017).</li>
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著者が明らかに何もありません。

ゲノム時代の多くの遺伝子家族は深くいくつかの植物の種で特徴づけられています。この情報は、機能の研究は、家族の別のメンバーの役割をさらに調査するためのフレームを提供します。このコンテキストで、冗長性と名前は異なる遺伝子に独立して割り当てられて別の研究グループがときに発生する混乱を避けること、家族の各メンバーを一意に識別できるように命名システムの必要性もあります。
配慮後、グレープバインの科学界はシロイヌナズナ遺伝子との類似性に基づくファミリ名グレープバイン遺伝子に合意し、一連のグレープバインには、新しい遺伝子家族の記述に適用する必要がありますルールを確立基本的にはブドウとシロイヌナズナの家族8間の塩基配列の系統発生の比較から始まってください。したがって、唯一の遺伝子が既に注釈、シロイヌナズナの名前が正しくは、グレイプバインの命名法で使用できます。ここで説明したシロイヌナズナにおけるブドウ ATL 第オーソロガス識別のため適用手順は、正しいグレープバイン遺伝子家族の命名法の割り当ての要求を満たすためにのみしたがって実施さ...

最後の十年の間に、ブドウのゲノムの多くの研究きました。ブドウは、果実の発育と生物的・非生物的ストレスに対する樹木の反応研究のためのモデルとなっている認識された経済的に関連する作物です。このコンテキストでは、2007年1のヴィティス ・ ヴィニヘラ品種 PN40024 ゲノムと 2011年2内の更新されたバージョンのリリースは、"Omics"-スケール データの急速な蓄積と高スループット研究のバーストをもたらした。公開されたシーケンス データに基づいて、(一般に節約されたモチーフ、構造や機能の類似性と進化の関係を共有するタンパク質から成る) のある特定の遺伝子家族の包括的な分析を実行できるを明らかにする、分子機能と進化、遺伝子発現プロファイル。これらの分析は、遺伝子ファミリーがゲノム全体のレベルでの生理学的プロセスを制御する方法を理解することに貢献できます。
プラントのライフ サイクルの多くの側面は、規則的な細胞プロセスを確保するため売り上げ高は微調整を必要とする主要タンパク質のユビキチンを介した分解によって規制されています。重要なユビキチンを介した分解プロセスのコンポーネント、E3 ユビキチンリ ガーゼ、特定のターゲット3の採用により、システムの柔軟性のために責任があります。したがって、これらの酵素は、シロイヌナズナのゲノム4、特定の標的タンパク質のユビキチン化の演技各 E3 ユビキチンリ ガーゼで予測した約 1,400 E3 リガーゼ エンコーディング遺伝子を持つ巨大な遺伝子家族を表しています。植物の細胞の調節において基質特異的ユビキチン化の重要性にもかかわらずユビキチン経路の規制方法について知られている少しといくつかのケースでのみ標的タンパク質が同定されています。このような特異性と調節のメカニズムを解読するのに依存している最初同定と解析、特に、システムのさまざまなコンポーネントの E3 リガーゼ。ユビキチンリ ガーゼの間で ATL 亜科はシロイヌナズナリング H2 指ドメイン5,6、防衛およびホルモンの応答7で役割を果たしてそれらのいくつかの表示で識別された 91 のメンバーによって特徴付けられます。
新しい遺伝子家族のメンバーを定義する最初の重要なステップは、コンセンサス モチーフ、キー ドメイン蛋白質シーケンスの特性など、家族の機能の正確な定義です。確かに、高炉解析に基づくすべての遺伝子家族のメンバーの信頼性の高い検索には、いくつかの必須の順序特性は、特定のタンパク質ドメインのタンパク質機能/活性タンパク質の署名としての責任が必要です。これは、他の植物種の同じ遺伝子ファミリーの前の評価によって促進されるまたは推定一般的なシーケンスを分離する別の植物種で同じファミリーに属する別の遺伝子を分析することによって達成できます。家族付けることも、個別に指定された植物種の国際コンソーシアムによって解決一般的なルールに従います。グレープバインには、例えば、このような手順にさらされてV. vinifera 、 a を含む系統樹の構築を確立するブドウ遺伝子アノテーション (sNCGGa) の超命名委員会の勧告遺伝子の注釈を許可する遺伝子家族のメンバーはヌクレオチド シーケンス8に基づきます。
家族と遺伝子重複調査の染色体の局在は、全ゲノムまたはタンデム重複遺伝子の存在を強調表示できます。このような情報はそれ機能的冗長性を表示したり、さまざまな状況、すなわち、非機能化、新機能、またはサブ機能化9を明らかにするので推定の遺伝子の機能を解明するために有用であります。両方ネオ- とサブ-functionalization は、遺伝的の目新しさは、新しい細胞成分を植物環境10の変化に適応を作成する重要なイベント。特に、遺伝子の重複と新しい遺伝子の生産されたブドウのゲノムの進化の過程で非常に頻繁に、グレイプバインの近位とタンデム重複から新しく形成された遺伝子が新しいを生成する可能性が高い関数11。
遺伝子家族機能の解読においてもう一つ重要な要因は、トランスクリプトームのプロファイルです。トランスクリプトーム データの膨大な量にアクセス権を与えるパブリック データベースの可用性は、大規模なインシリコ発現解析を用いた遺伝子家族のメンバーに推定する機能を割り当てる従って悪用できます。確かに、いくつかの遺伝子が特定の植物器官または一定応力に対する応答の特異な表現を定義済みの条件に対応するタンパク質の推定の役割に関するいくつかのヒントを与えるでき、可能性についての仮説を応援しますさまざまな課題に対応するため重複遺伝子のサブ機能化。その目的のための複数のデータセットを考慮することが重要です: これらはすでに利用可能な遺伝子式マトリックス、グレープバイン器官の発達段階12ゲノム ・ トランスクリプトームのアトラスなどをすることができますまたはアドホックで構築することができます定義応力を受ける特定の植物種のためのトランスクリプトームのデータセットを取得しています。また、単純なアプローチは、2 つの行列を使用して、1 つはペアの類似性データ、他の 1 つのペアの共発現係数適用できます遺伝子ファミリー内のシーケンス類似性と遺伝子発現パターン間の関係を評価します。
この作業の目的も達成するために、タンパク質局在化とリン酸化部位の予測として遺伝子構造、節約された蛋白質のモチーフ、染色体、遺伝子重複と発現パターンを定義するグローバルなアプローチを提供することです、植物の遺伝子ファミリーの網羅的な評価。このような包括的なアプローチは、グレイプバインの ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ家族の特性にここで適用されます。7主要な細胞プロセスの調節に ATL 亜科のメンバーの出現の役割によるとこの作品がよく機能研究のための強い候補者の識別を支援でき最終的に支配する分子メカニズムを解明、この重要な作物の環境への適応。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>パソコン</tr><tr><td>Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)</td><td></td><td></td><td>http://www.megasoftware.net/</td></tr> <tr><td>Motif-based sequence analysis tools (MEME)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://meme-suite.org/ Geneious</td><td>Biomatters Limited</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.geneious.com/ ProtParam ツール</td><td></td><td></td><td>http://web.expasy.org/protparam/</td></tr> <tr><td>ngLOC</td><td></td><td></td><td>http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html</td></tr><tr><td>TargetP v1.1 サーバー</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ Protein Prowler</td><td></td><td></td><td>http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/</td></tr> <tr><td>MUsite</td><td></td><td></td><td>http://musite.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>Pfam</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://pfam.xfam.org/ TMHMM Server v. 2.0</td><td></td><td></td><td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td></tr> <tr><td>ProtScale</td><td></td><td></td><td>http://web.expasy.org/protscale/</td></tr> <tr><td>Grape Genome Database (CRIBI)</td><td></td><td></td><td>http://genomes.cribi.unipd.it/grape/</td></tr> <tr><td>PhenoGram</td><td></td><td></td><td>http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot</td></tr><tr><td>MCScanX</td><td></td><td></td><td>http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/</td></tr> <tr><td>Interactive Tree Of Life (iTOL)</td><td></td><td></td><td>http://itol.embl.de/</td></tr> <tr><td>UniProt</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.uniprot.org/ Phylogeny.fr</td><td></td><td></td><td>http://www.phylogeny.fr/index.cgi</td></tr><tr><td>MUSCLE</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ Gblocks Server</td><td></td><td></td><td>http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html</td></tr><tr><td>Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix</td><td></td><td></td><td>https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012</td></tr><tr><td>Multi Experiment Viewer (MeV)</td><td></td><td></td><td>http://mev.tm4.org/#/welcome</td></tr><tr><td>Sequence Read Archive (SRA)</td><td></td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>EMBOSSニードル (EMBL-EBI)</td><td></td><td></td><td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/</td></tr></tbody></table>

ゲノムワイドな探索とグレープバインで atl e3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

家族の遺伝子の分類と命名はできる符号化された蛋白質の多様性の説明と家族の家族機能シーケンス モチーフのまたは特定の存在など、いくつかの機能に基づく予測に大きく貢献します。翻訳後修飾と異なる条件での家族のメンバーの表現のプロフィールのためのサイト。この作品では、遺伝子家族特性評価のための詳しいプロトコルについて説明します。ここでは、プロシージャは、グレイプバインのLevadura でシロイヌナズナ Tóxicos (ATL) E3 ユビキチンリ ガーゼ家族の評価に適用されます。メソッドは、家族、遺伝子の局在化、構造、および重複の特性、保存されている蛋白質のモチーフの解析、タンパク質の局在化とリン酸化部位の予測の網羅的同定と同様遺伝子発現プロファイリング異なる dataset の家族間で。実験目的によってそれ以上の分析に拡張すること、そのようなプロシージャはゲノムのデータが利用可能なすべての植物種の遺伝子家族に適用できる、興味深い候補者を識別するために貴重な情報を提供します機能の研究、植物の環境適応の分子メカニズムに洞察力を与えます。

BLASTp 検索を通じてシロイヌナズナ ATL2 (At3g16720) に最も近いブドウのゲノムの ATL の家族のメンバーを調査するためのプローブとして使用されたように遺伝子 VIT_05s0077g01970 (V. vinifera cv ピノ ・ ノワール PN40024)。PSI-BLAST 解析は、(図 1 a) ブドウ ATL 遺伝子ファミリーに属すると推定される遺伝子のリストを明らかにいくつかのサイクル後に収束。各候補者のための正規のリング H2 ドメインの存在は、分析 (図 1 b) で識別されたすべてのエントリの筋肉の配置を視覚により評価しました。前に 3 番目のシステイン プロリン残基と同様、間隔を正しく保存されたアミノ酸、2 つのヒスチジン残基を含む遺伝子だけは、シロイヌナズナ5の元の ATL の定義によると投槍兵として考慮さ...

この記事は、同定とLevadura でシロイヌナズナ Tóxicos (ATL) E3 ユビキチンリ ガーゼの家族に適用されるグレイプバインの遺伝子ファミリーの解析手順を説明します。

ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリ ガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...

この手順の全体的な目標は、遺伝子構造の定義、関連するタンパク質モチーフ、染色体の位置、遺伝子重複、発現パターンなど、植物の遺伝子ファミリーをグローバルなアプローチで網羅的に特徴付けることです。この方法は、家族のメンバーの世界ゲノム同定や遺伝子発現解析によるトランスクリプトーミーなど、家族内の植物の分類における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順全体の主な利点は、完全な遺伝子ファミリーの特性評価を達成するための実験ステップの網羅的なリストを提供することです。この手順は、遺伝データが利用可能なあらゆる植物種の任意の遺伝子ファミリーに適用できます。さらに、このアプローチは、機能研究の興味深い候補を特定するための貴重な情報を提供します。全手順を実演するのは、私の研究室のピエトロ・アリアーニです。Blast の Web ページを開き、タンパク質 blast セクションをクリックします。「Enter query sequence」フィールドに、他のファミリーメンバーを同定するためのプローブとして使用されるタンパク質のアミノ酸配列を入力します。ファミリーを特徴付けるすべての重要な特徴を持つタンパク質を使用してください。次に、検索セットを選択するフィールドで、参照タンパク質データベースと目的の生物を選択します。次に、フィールド・プログラム選択で、PSI-BLAST アルゴリズムを選択します。必要に応じて、アルゴリズムパラメータをクリックして、最大ターゲットシーケンスやスコアリングマトリックスなどの高度なパラメータを調整します。E 値はしきい値で、この検索では 005 から 001 に減少します。[BLAST]ボタンをクリックして、解析を実行します。クエリに対する相対的な一致を表示しているすべてのシーケンスから、ファミリーに明らかに属していないエントリの選択を解除します。これを行うには、PSI-BLASTの選択列のチェックマークをクリックします。次に、goボタンをクリックして2回目のPSI-BLAST反復を実行します。新しく同定されたすべての配列は黄色で強調表示されます。再度、ファミリーに属さないヒットの選択を解除します。アルゴリズムが関連するエントリを見つけられないか、収束に達するまで、このプロセスを続けます。すべての偽陽性が取り除かれたら、アミノ酸配列をFASTA形式のファイルに収集し、そのファイルをバイオインフォマティクスソフトウェアスイートにアップロードします。次に、インポートしたすべてのシーケンスをリストから選択し、ツールバーのalign/assembleボタンをクリックします。次に、[ペアワイズマルチプルアライメント]をクリックし、[MUSCLEアライメント]と[OK]を選択します。配置はデフォルトを使用して行われるようになります。次に、アラインメントの配列ロゴを視覚化し、遺伝子を視覚的に検査して偽陽性を検索します。タンパク質の物理的パラメータとドメイン、染色体分布、重複、およびエクソンイントロン組織のさらなる解析は、テキストプロトコルに記載されています。次に、高品質の系統樹の構築と家族命名法の定義を通じて、ATLファミリーメンバー間の関係を分析します。まず、ブドウのつる遺伝子命名法の参照として必要なアラブの採用systeliana ATL配列を、参照用のUmoProtデータベースから取得します。次に、系統解析のために、ブドウの木とシロイヌナズナの遺伝子ファミリーメンバーのすべての塩基配列を含む FASTA ファイルを作成します。次に、phylogeny Franceのホームページを参照し、系統解析パイプラインを選択します。ほとんどの場合、ワンクリックが適していますが、必要に応じて、詳細オプションを使用して特定の詳細設定を選択したり、アラカルトオプションを使用して完全にカスタマイズされた分析を選択したりすることができます。次に、解析の名前を入力し、FASTAファイルをアップロードします。次に、[送信] をクリックして分析を実行します。この手順でエラーメッセージが表示される場合は、系統発生スイートパイプラインの各ステップを個別に完了します。まず、MUSCLEソフトウェアのホームページに移動し、FASTAファイルをアップロードします。出力形式としてPearson FASTAを選択し、送信します。次に、ファイルをFASTA形式でダウンロードし、位置がずれている位置を排除します。G-blockサーバーツールを開き、アラインメントFASTAファイルをアップロードし、配列の種類としてDNAを選択し、解析に最も適したストリンジェンシーを選択します。ブドウのつるATL遺伝子ファミリーのアラインメントについては、配列の分岐が大きいため、選択が厳密でないために提案された3つのオプションすべてを選択します。次に、[ブロックの取得] をクリックして解析を実行します。結果を保存するには、出力ページの下部にある結果の配置をクリックし、新しいFASTAファイルを作成します。Gブロックは、DNAの発散領域または突起アライメントのアライメントが不十分な位置を排除し、系統解析により適したものになります。この手順では、列の厳密性に対するインペリクル パラメーターの選択は、列が 3 つの負債であることを確認するために重要です。ツリーを完成させるために、Phylogeny Franceのホームページに移動します。そこで、アラカルト パイプラインを選択し、複数の配置と配置のキュレーションのオプションの選択を解除します。次に、「ワークフローの作成」をクリックし、GブロックでキュレーションされたFASTAファイルをアップロードし、ブートストラップ手順を選択して、デフォルトのパラメーターと設定を使用します。最後に、[送信] をクリックして分析を実行します。これで、段階的なプロセスは完了です。系統樹が作成されたので、ブートストラップ値が70%未満のサポートが不十分なブランチを折りたたむ次に、最終結果をNewick形式でダウンロードして、さらに分析します。テキストプロトコルは、系統発生に基づいて遺伝子名を割り当てる方法を提供します。このプロトコルでは、遺伝子発現ライブラリから取得したarma正規化された発現値のタップされた行付きテキスト形式のファイルを作成します。各ファミリー遺伝子の値を同じパターン行の下に整理します。次に、Multi-experiment Viewerソフトウェアを使用して、階層型バイクラスター分析を実行します。まず、作業データマトリックスをアップロードし、テキストファイルを選択します。単色配列を選択し、自動注釈が指定されていない場合は、注釈の読み込みから目盛りを削除します。式テーブル プレビューの左上の式の値を選択し、読み込みボタンをクリックします。次に、Log2変換と遺伝子/行の正規化を適用してデータを調整します。次に、適切なスケール制限を設定します。次に、階層クラスタリングを計算します。ordering optimizationフィールドで、optimize gene leaf orderおよびoptimize sample leaf orderを選択します。次に、リンケージ方法選択フィールドで平均リンケージクラスタリングを選択し、距離行列選択フィールドでピアソン相関を選択します。次に、[OK]をクリックして解析を実行します。ウィンドウの左側のパネルで結果を表示し、ファイルメニューの[画像を保存]をクリックしてヒートマップをエクスポートします。BLAST-P検索によると、シロイヌナズナATL2に最も類似した遺伝子は、ブドウのつるゲノムのATLファミリーメンバーを調査するために使用されました。PSI BLAST解析は数サイクル後に収束し、遺伝子ファミリーの推定遺伝子のリストを提供しました。各候補の正準環H2ドメインの存在は、MUSCLEアラインメントの目視検査によって評価されました。これにより、検索は96のブドウの遺伝子に絞り込まれました。同定された遺伝子の系統解析を行い、それらをシロイヌナズナATL遺伝子ファミリーと比較した。命名法には、96のブドウのつるATLのうち13がシロイヌナズナATL遺伝子オルソログとして特定の識別子を付与された。階層的なバイクラスター解析を使用して、同定された遺伝子をブドウの木のグローバル遺伝子発現アトラスにマッピングすると、96個すべてが少なくとも1つの組織で発現しており、5つの発現クラスターを同定できることが示されました。同様のアプローチを適用して、生物的ストレスに応答したこれらの遺伝子の発現を研究しました。病原体感染に応答してATL遺伝子ファミリーが直接関与しており、62の遺伝子が少なくとも2つの条件で有意な調節を示した。このビデオを見れば、遺伝子ファミリーの特性評価に使用されるソフトウェアの扱い方について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、特定の遺伝子ファミリーの特性と、全ゲノムファミリーメンバーの同定に使用される対応するプローブを慎重に定義することが重要です。この手順に従うと、遺伝子ファミリーの命名法の帰属に必要な種以外のいくつかの種に基づいて追加の系統樹を作成することにより、遺伝子ファミリーの進化とP30の機能を調べることができます。

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生物学

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ゲノムワイドな探索とグレープバインで ATL E3 ユビキチンリガーゼ遺伝子家族の表現メタ分析のための包括的なワークフロー

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