Name: 分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶシロイヌナズナ由来ミトコンドリアの分離と呼吸測定法。密度勾配遠心分離を用いて純粋で機能的なミトコンドリアを調製し、植物のエネルギー代謝とストレス耐性の研究に活用できます。

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この研究、オーストラリア研究協議会優秀センターのプラント エネルギー生物学 CE140100008、オーストラリア研究協議会未来フェローシップ (FT130100112) を MWM とフョードル ・ リュネン研究員 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルトによって支えられました財団、ドイツ) JS に。

このプロトコルはそのまま土壌コロイドの連続密度勾配を使用して上に成長したシロイヌナズナ器官ミトコンドリアの分離に使用されます。4 ° C で行われているすべてのプロシージャの次の材料のコレクション
1. 粉砕媒体、洗浄バッファー、およびグラデーションのソリューションの準備
<ol><li>研磨媒体 (マイナス アスコルビン酸とシステイン) とテーブル1 2 x 洗浄バッファーの 200 mL 1 日分離前に 300 mL を準備、4 ° C で冷える 注: アスコルビン酸ナトリウムと L-システイン (遊離塩基) 17.84 mM, 20.36 mM の最終的な集中にそれぞれ追加、分離の朝に研削中にします。ミトコンドリアが使用される西部のしみまたはブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルのゲルの電気泳動 (BN-PAGE) 分析、BSA のない洗浄バッファー x 2 を構成します。</li>
	<li>ミトコンドリアの分離 (図 1と表 1) の朝にグラデーションを準備します。<ol>
<li>重いと光のグラデーションのソリューションは、2 つのビーカー。それぞれの 35 mL で 2 つの勾配管十分です。</li>
		<li>グラデーションの注ぎ口と PVC 蠕動チューブを脱イオン水の部屋を洗って、すべての管から管を通しても流れを確保します。</li>
		<li>場所 2 遠沈管 (50 mL) PVC チューブ蠕動アウトレットで氷の上のわずかな角度ではチューブの下側にグラデーションのソリューションが実行されるようにチューブの内側にテープで固定。</li>
		<li>内側と外側の部屋 (ダウン黒レバー) の間の接続を閉じます。マグネチックスターラー内側のチャンバー内の小さな攪拌棒にグラデーションの注ぎ口を配置します。</li>
		<li>内側のチャンバー (チューブのコンセントを商工会議所) に 35 mL 重勾配液を注ぐ。(300 mL/h) を高速に設定されて蠕動性ポンプ率で残りは半分まで氷上に置いた 2 つの遠沈管に重勾配液を調剤します。</li>
		<li>外側の商工会議所 (商工会議所管出口なし) に 35 mL の光勾配溶液を注ぐ。チャンバー (黒プッシュ レバーを途中で) の間の接続を開き、穏やかに混合するソリューションを許可します。磁性攪拌器を使用してソリューションをミックスします。</li>
		<li>ソリューションをゆっくりと実行を許可する (60 mL/h) 2 つのチャンバーからミックス グラデーション ミックスのすべてまで 0 - 4.4% (w/v) ポリビニルピロリドン (PVP) グラデーション入り管。手順 2.12 で使用する準備ができるまで氷でグラデーションをしてください。 メモ: グラデーションが準備されると、希釈洗浄媒体 prechilled 脱イオン水と 4 ° C で維持寒さ 1 x x 2</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 均質化とミトコンドリアの分離
<ol><li>ハサミで土で 4 週間の古いシロイヌナズナ栽培全体ロゼット組織を切り取り、少なくとも 80 植物 1 の準備のため必要となります。 注: 10 14 日古い水文化、最小 5 ポット/準備、または 4 板の最小培地・培基底塩混合物 (MS) 寒天上に成長した 2 週間の古い苗も使用される場合があります。</li>
	<li>予冷 4 ° C の大きなモルタルと乳棒粉砕媒体 (表 1) の 75 mL と小さな断片にカットされている植物材料の半分を配置し、組織の大きな作品が残っていないまで数分間、広く挽きます。</li>
	<li>中古ウェットろ過材 (22-25 μ m 孔サイズ) と粉砕媒体の 4 層と 500 mL の三角フラスコにプラスチック漏斗を介してろ過材の 4 層を磨砕液をフィルターします。</li>
	<li>研削中の 75 ml の別組織の残りの半分を挽きます。</li>
	<li>濾材の乳剤を組み合わせるし、フィルターを通して可能な磨砕液と同じくらい。</li>
	<li>粉砕媒体、500 mL 三角フラスコにもう一度フィルターの残り 150 mL でもう一度ろ過材に残った残存組織を挽きます。</li>
	<li>2,500 x g で 5 分間固定角ロータ 4 ° C で 8 中古冷蔵 50 mL プラスチック遠心管にフィルターのホモジネートを遠心します。</li>
	<li>きれいな遠心チューブに上清を注ぐ (50 mL; 緑のペレットを妨害しない) と 4 ° C で 17,500 x g で固定角ロータで 20 分間遠心します。</li>
	<li>破棄すべてが < 吸引により上清の 3 mL (またはペレットを乱すことがなくオフ優しく注ぐ)。優しく小さな細かいブラシを使用して残留清でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>各管に洗浄バッファー x 1 の 10 mL を追加し、4 管を組み合わせて 1 きれいな遠心管 (2 管の結果など)。</li>
	<li>1 x 50 mL 洗浄バッファーでこれらの管を記入し、手順 2.7 2.9 を繰り返します。</li>
	<li>プール 1 粗ミトコンドリア餌スポイトを使用して管し、罰金の絵筆で均等に分散 (少量の洗浄バッファーが使用できますが、最終巻は、グラデーションの上に合うように 3 mL 以下にする必要があります)。優しく 2 連続 0 - 4.4% (w/v) PVP グラデーションの上に落とすとミトコンドリアの懸濁液を層します。</li>
	<li>チューブ (1 x 洗浄バッファーを使用して) 重量によってバランスをとるし、40 分休憩がオフになっていることを確認のための 4 ° C で 40,000 × g で遠心分離機します。ミトコンドリア、管の下部にあるバンドに移行するまたは (曇り、黄色バンドによって識別される管の下部に重液に存在します。図 2)。</li>
	<li>吸引によりミトコンドリアのバンド上のソリューションの上部 5 cm を慎重に取り外します。</li>
	<li>2 クリーン チューブにミトコンドリアを含む残りのソリューションを配布し、洗浄バッファー x 1 と入力します。プラスチック パラフィン フィルムでチューブの口を覆っていると数回の反転によって、コロイドの密度勾配とミトコンドリアを均等に配る。遅いブレーキ 4 ° C で 31,000 × gで 15 分間遠心します。 注: 遠心分離の前に確認、ミトコンドリアと残りのコロイドの密度勾配を均等に分散します。さもなければ、コロイド密度勾配が管の底に集中、ミトコンドリアのペレット化を防ぐ。</li>
	<li>吸引、塗りつぶし 1 x 洗浄管 50 mL までのバッファーし、混合して再び反転して上清を削除します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 31,000 × g で 15 分間遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、変更された 200 μ L ヒント (その端の開口部の上の先端を少しカット) とピペットを使用して可能な限り小さなとしてミトコンドリア ペレット ボリューム (〜 500 μ L) を収集します。1.5 mL チューブにミトコンドリアを配置し、即座の使用または-80 ° C でストアの氷の上に維持 注: 場合ミトコンドリアは、ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) に使用される、BN-PAGE - またはイムノブロット分析使用 BSA のない洗浄バッファー x 1 (すなわち、ステップ 2.15 と 2.16) 最終的な洗浄のため。</li>
	<li>ブラッドフォード法によるミトコンドリアのタンパク質濃度を決定します。 注: の 4 ° C で使用するまで-80 ° c ストア ペレット BN-PAGE-遠心分離機因数。酸素消費量測定では、唯一の新鮮単離ミトコンドリアを使用できます。</li>
</ol>3. 酸素消費量測定
注: による酸素消費量たて分離植物ミトコンドリアはミトコンドリア イヌイット、チトクロームc経路アクティビティ、および代替経路の活性の測定を有効にする、クラーク型の酸素電極で分析できます。
<ol><li>ソフトウェアのインストール<ol>
<li>インストール ライセンス酸素酸素消費量測定に使用するコンピューターにソフトウェアを監視します。</li>
	</ol></li>
	<li>呼吸中、基板、化学貯蔵液およびクラーク型の酸素電極の作製<ol>
<li>酸素消費量の測定に使われる呼吸媒体 (300 mM ショ糖、10 mM の NaCl、5 mM KH2PO4、2 mM MgSO40.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) 10 mM TES (pH 7.2)) を準備します。</li>
		<li>基板、阻害剤、およびミトコンドリア呼吸 (表 2) を測定するエフェクタを準備します。これらを以前作成し、-20 ° C で保存 注: pH 7.0 に有機酸などの酸性の溶液の pH を中和する NaOH を使用する前に使用しています。</li>
		<li>呼吸中長期分析室 (25 ° C) として同じ温度を暖めます。</li>
		<li>クラーク型の酸素電極メーカーのプロトコルで説明されているように組み立てます。</li>
		<li>測定室に 1 mL の空気飽和水 (空気飽和水は精力的に大きな三角フラスコに少量の純水を揺することによって得られる) を配置します。かくはんに切り替えるにはするには、「攪拌速度」ボタンをクリックします。"On"ボタンをクリックし、攪拌速度を 65 rpm に設定。継続する"OK"をクリックします。25 ° C で水を継続的にかき混ぜる</li>
	</ol></li>
	<li>酸素電極の校正<ol>
<li>測定室 (25 ° C) として同じ温度を校正に使用される水を温めます。</li>
		<li>現在の安定化し、酸素電極を校正するを待ちます。</li>
		<li>酸素電極の校正を開始するには、「調整」ボタンをクリックして、を選択し、「空気飽和水」「液体位相校正」</li>
		<li>新しいウィンドウが (酸素キャリブレーション (液相) - 5 のステップ 1) を開きます。(電極のコントロール ボックスに接続されているチャネル) を調整し、(セット 25 ° C に「商工会議所温度」と「大気圧」101.32 kpa) の変数を入力するチャンネルを選択します。OK をクリックして""続行します。</li>
		<li>次攪拌速度 (65 rpm) (5 の手順 2)、セットアップのステップして続行する"OK"をクリックします。</li>
		<li>5 の手順 3 で高原に到達する信号を待ちます。言葉「高原に達した OK を押して続行します"がボックスに表示されます。継続する"OK"をクリックします。</li>
		<li>5 の手順 4、亜ジチオン酸ナトリウム 5 mg を追加することによってゼロ酸素チャンバーを確立します。継続する"OK"をクリックします。 注: 酸素濃度の低下がトレースに表示されます、0 に到達する必要があります。</li>
		<li>キャリブレーション (5 のステップ 5) の最後のステップで高原に到達する信号を待ちます。言葉「高原に達した OK を押して続行します"がボックスに表示されます。継続する"OK"をクリックします。</li>
		<li>キャリブレーションを保存する「校正の保存」をクリックします。新しいウィンドウが開きます。酸素制御ボックスの新しい調整内容を保存することを確認して「OK」をクリックします。 注: 成功した校正後ラベル「酸素 (nmol/mL)」が y 軸に表示されます。</li>
		<li>キャリブレーション後に、適切な洗浄を確実に (少なくとも 5-10 回) チャンバー内に水を洗浄によって測定チャンバーをきれい。測定に呼吸媒体の場所 1 mL は商工会議所、酸素消費トレースが線形になるまで数分間平衡に膜ができます。</li>
		<li>良いスロープ ビューを取得する酸素消費トレースの規模に適応します。"ズーム XY"をクリックし、変数を入力 (0 - に「酸素」を設定 300 と 0 - 45 分に「時間軸」)。</li>
	</ol></li>
	<li>ミトコンドリアの整合性の定量<ol>
<li>プランジャー オープン、反応室に 970 μ L 空気飽和呼吸媒体を追加します。</li>
		<li>(総蛋白はその後の計算に含まれる必要があります) ミトコンドリア分離後決定として 30 μ L 分離ミトコンドリアや合計のミトコンドリア蛋白質の 150 μ g を追加カットの先端のピペットを使用して反応室へ。</li>
		<li>継続的に 25 ° c (65 rpm) バー マグネチックスターラーを使用して、ソリューションを空気飽和状態にミトコンドリアの懸濁液をかき混ぜます。</li>
		<li>プランジャーとチャンバーのシール、酸素消費量を記録する「録音を開始」をクリックし、、(1-2 分) を安定させるために酸素消費トレース。</li>
		<li>アスコルビン酸 10 mM、25 μ M シトクロムc "洗剤"する前にレートを取得する 5 分を追加した後、手動で酸素消費率を決定します。 注: 基板、阻害剤、およびトレースで直接エフェクターの追加のラベル、「イベント マークの追加」ボタンをクリックし、、対応するラベル指定を入力します。継続する"OK"をクリックします。</li>
		<li>"洗剤"後率を与えるに 0.05% (v/v) 洗剤を追加した後 3 分の手動での酸素消費率を決定します。「録画を停止」をクリック</li>
		<li>「料金の変更表」ボタンをクリックします。2 カーソルがグラフ画面上の縦線として表示されます。間隔を定義するトレースの必要な位置にカーソル速度のペアをドラッグします。左率のカーソルを使用してトレースに沿って間隔を移動します。間隔の右の速度のカーソルを使用してそれ自体を設定します。監視ソフトウェア自動的に酸素は、トレースに沿って速度間隔のカーソルを移動しながら 2 つのカーソル間ベスト フィットの直線を描画します。</li>
		<li>目的の間隔と位置を定義すると、単価を右クリックでテーブルに、カーソルが 2 の 1 で入力し、「テーブルにレートを追加」を選択メインの単価表に単価を表示することを確認するには、「追加」をクリックします。</li>
		<li>"洗剤"の前に速度をパーセンテージとして表される"洗剤"後レートによって除算ミトコンドリアの整合性を計算し、100 からそれを減算します。</li>
	</ol></li>
	<li>ミトコンドリア呼吸の定量<ol>
<li>プランジャー オープン、反応室の呼吸の空気飽和中 970 μ L を追加します。500 μ M ATP や 30 μ L 分離ミトコンドリア呼吸反応チャンバ中にカットでピペットを使用して合計のミトコンドリア蛋白質の 150 μ g を追加します。</li>
		<li>25 ° C で (65 rpm) バー マグネチックスターラーを使用して継続的にミトコンドリアの懸濁液をかき混ぜる</li>
		<li>プランジャーを閉じ、酸素消費量を記録し、(線形酸素消費トレースのとき) を安定させるために酸素消費速度の 1-2 分待つ」記録を開始」をクリックします。5 mM コハク酸を追加します。約 2 分間の酸素消費率を記録します。 注: 基板、阻害剤、およびトレースで直接エフェクターの追加のラベル、「イベント マークの追加」ボタンをクリックし、、対応するラベル指定を入力します。継続する"OK"をクリックします。</li>
		<li>1 mM アデノシン二リン酸 (ADP) を追加します。2 分の酸素消費率の記録が再開します。</li>
		<li>1 mM NADH を追加します。4 8 分の酸素消費率を記録します。このレートは、チトクロム酸化酵素を介して呼吸の容量です。</li>
		<li>チトクロームc経路を阻害するため 1 mM シアン化カリウム (KCN) (または 2.5 μ M myxothiazol または 5 μ M アンチマイシン A) を追加し、代替酸化酵素による酸素消費量を観察する約 2 分を記録し続けます。</li>
		<li>5 mM ジチオトレイトール (DTT) と代替オキシダーゼを完全にアクティブにする 10 mM ピルビン酸を追加します。5-7 分の記録し続けます: 代替オキシダーゼの容量です。</li>
		<li>500 μ M n-プロピルガ レート (nPG) を追加し、2 分間記録します。これは化学的に禁じることができない残留酸素消費率を査定します。それはミトコンドリアの起源する可能性が高いではないと記録、その他の料金からこの率を減算します。シトクロムcと (KCN と nPG) ことによって、AOX 経路の抑制後まだ発生して酸素消費量は、ペルオキシダーゼ ミトコン ドリア9の汚染物質として存在に由来すると思われます。</li>
		<li>「録画を停止」をクリック</li>
		<li>「料金の変更表」ボタンをクリックして単価を右クリックでテーブルに 2 つカーソルのいずれかで入力と「テーブルにレートの追加」を選択。メインの単価表に単価を表示することを確認するには、「追加」をクリックします。 注: とき有機溶剤に溶解したエフェクタを追加 (e.g。、アンチマイシン A、nPG、myxothiazol)、商工会議所およびプランジャー エタノールで洗浄する必要があります、適切な洗浄を確保するには、水が。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Day, D. A. <a target="_blank" href="https://santai.ichotels.com.tr/lib/download/asin=1493926381">Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology.</a> Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).</li>
<li>Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+function-location+nexus%3A+Using+multiple+lines+of+evidence+in+defining+the+subcellular+location+of+plant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins.</a> Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).</li>
<li>Eubel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-flow+electrophoresis+for+purification+of+plant+mitochondria+by+surface+charge%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge.</a> Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).</li>
<li>Murcha, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+into+plant+mitochondria%3A+Signals%2C+machinery%2C+processing%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation.</a> J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).</li>
<li>Carrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+defining+dual-targeted+proteins+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis.</a> Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).</li>
<li>Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+perspectives+in+the+redox+code+-+Mass+spectrometric+proteomics+studies+of+moonlighting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. , (2016).</li>
<li>Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/275287537_Biochemical_Characterization_of_Chlorophyll-Free_Mitochondria_From_Pea_Leaves">Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves.</a> Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Cheah, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+oxygen+kinetic+isotope+effects+using+membrane+inlet+mass+spectrometry+can+differentiate+between+oxidases+for+mechanistic+studies+and+calculation+of+their+contributions+to+oxygen+consumption+in+whole+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues.</a> Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).</li>
<li>Chrobok, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metabolic+role+of+mitochondria+during+developmental+leaf+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).</li>
<li>Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+proteomics+of+root+and+shoot+mitochondria+and+transcript+analysis+to+define+constitutive+and+variable+components+in+plant+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria.</a> Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).</li>
<li>Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proteome+heterogeneity+between+tissues+from+the+vegetative+and+reproductive+stages+of+Arabidopsis+thaliana+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development.</a> J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).</li>
<li>Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+mitochondrial+respiration+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).</li>
<li>Peters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+-+complex+II+ratio+strongly+differs+in+various+organs+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).</li>
<li>Werhahn, W. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC64895/">Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20.</a> Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).</li>
<li>Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+analysis+of+the+rice+mitochondrial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome.</a> Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).</li>
</ol>

著者は利害の衝突を宣言しません。

通常、シロイヌナズナからミトコンドリアの分離は徹底的な研磨と 5 mg を超える利回りが得られますが約 80-100 の 3 - 4 週間の古い植物からミトコンドリアの 3 mg を利回りを残します。収量は生育条件によって異なります、老化9の中にも維持されるように思われますがミトコンドリアの構造は、senesce の葉、劇的に減少します。良好な収率を取得する最も重要な機能の 1 つは、ミトコンドリアを解放する細胞を溶解する研磨方法です。機械的研削装置の数は購入可能な中、シロイヌナズナの乳鉢と乳棒で粉砕を実現収量の面で一貫して良好な結果として細胞内小器官にはほとんど損傷を持つ細胞を溶かすこと機械研削盤は高速ですが、最適化を必要し、する研削に必要な量は、組織によって異なります。モルタルと乳棒、しばしば便利と効率的組織のスライスまたは研削前にナイフやハサミでカット。4 ° C で実施される必要があるすべてのステップのとおりと精製ミトコンドリアの洗浄ペレットを取得するために研削の端から全体の手順は、約 4 時間を取る必要があります。洗剤または管またはグラデーションのメルターで他の試薬の痕跡は、収量...

植物ミトコンドリア研究の歴史は、100 年1以上さかのぼります。無傷ミトコンドリアが 1950 年代初頭に隔離された最初差動遠心分離を使用します。1980 年代におけるコロイドの密度勾配の出現は、浸透圧調節を受けることがなく精製するミトコンドリアを許可しました。グラデーション精製ミトコンドリアは質量分析法の感度のためのほとんどの目的に適しているも比較的軽微な汚染物質検出することができます、不適切なミトコンドリアの場所2を割り当てることができます。プラスチド局在型の両方を削除フリーフロー電気泳動することができますの使用とペルオキシソーム汚染3、無料が、フローの電気泳動は専門性の高い技術と研究の大半には必要ありません。さらに、そのデュアルまたは複数のターゲット蛋白質の思い出したする必要がある蛋白質の場所を決定するときにセルに発生します。葉緑体/プラスチドとミトコンドリアの4、およびミトコンドリア標的蛋白質の数の以上 100 デュアル ターゲットタンパク質を説明し、ペルオキシソームでは5が知られています。さらに、特定の刺激、酸化ストレスなどの下で蛋白質の再配置は、細胞生物学6新興テーマです。このように、蛋白質の位置を学び、生物学の文脈で検討する必要が、さまざまなアプローチ、決定および場所2を確認します。
ミトコンドリア、通常の均質化によって植物組織から分離されて、バランスがミトコンドリアを解放する細胞壁を壊して開けるとミトコンドリアを損傷されていない間必要です。伝統的に、ジャガイモとカリフラワー、均質化は、活動を維持するためにさまざまなコンポーネントのバッファーで抽出液を作る家庭用ミキサー/ジューサー装置を使用します。エンドウ葉からミトコンドリアの分離 (稚苗 (~ 10 日古い) を使用してミトコンドリアの分離のための普及した材料は、葉材が柔らかくて、細胞を溶解するミキサーを利用しています。シロイヌナズナT-DNA 挿入ノック アウトの行の可用性と機能研究を実施するミトコンドリアを浄化することができる必要がある葉、根、花からミトコンドリアの分離法の開発組織。全体的に他の植物の開発方法を最適化するために必要な材料の研削役得で、よく7に働いた。シロイヌナズナのこれはさまざまな方法 (下記参照) で達成することができます、組織の種類 (撮影対ルート) によって異なります。さまざまな器官からミトコンドリアの密度として連続的な勾配の使用を最適化することも、または発達段階を意味する彼らは別様に移行することができます。したがって、最大分離のためグラデーションの密度は、洗練された最高の分離を達成するためにことを確認することができます。
一度精製したタンパク質、tRNA の吸収実験、酵素活性測定法、呼吸鎖測定および西部のしみの分析を含む研究のさまざまなミトコンドリアを使用ことができます。ミトコン ドリアは、蛋白質量の質量分析にも使用できます。複数の反応 (MRM) 分析を監視可能の定量化タンパク質を定義しますが、重要な分析法の開発を必要とする対象となります。これに対し、ジメチルまたは他同位体ラベル8による定量化は、生物学的知見を明らかにする使用することができます全体のプロテオームの間での違いを識別するに発見アプローチを提供します。

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>AOX antibody</td><td>from Tom Elthon</td><td></td><td>Elthon et al., 1989</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td>化学</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Clarity western ECL substrate</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>シトクロームc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td>化学</td></tr><tr><td>Difco 寒天、粒状</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td>化学</td></tr><tr><td>ジチオトレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>化学</td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>化学</td></tr><tr><td>Gamborg B-5 基礎培地</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>化学</td></tr><tr><td>Gamborg ビタミン溶液 (1000x)</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>化学</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H + L)-HRP コンジュゲート</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1706516-2ml</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG (H + L)-HRP コンジュゲート</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1706515-2ml</td><td>化学</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>シグマ</td><td>C7352-100G</td><td>化学</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>230391</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>村重 &Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ndufs4 antibody</td><td>from Etienne Meyer</td><td></td><td>Meyer et al., 2009</td></tr><tr><td>n-Propyl galaate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>化学、コロイド密度勾配</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン (PVP40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>化学</td></tr><tr><td>シアン化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>化学</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>化学</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>化学</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>化学</td></tr>ナトリウム<tr><td>ジチオナイト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>化学</td></tr>ナトリウム <tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>ナトリウム</td><td>Sigma A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>化学コハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>化学</td></tr>ス<tr><td>クロース</td><td>Chem-Supply</td><td>SA030</td><td>化学</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td>化学</td></tr><tr><td>ピロリン酸四ナトリウム (Na4P2O7 & middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704271</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Chemical, detergent</td></tr><tr><td>Western Blocking Reagent</td><td>シグマ</td><td>11921681001</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>バランス</td><td>メトラー・トレド</td><td>XS204</td><td>機器</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Avanti J-26XP</td><td>機器</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>機器</td></tr><tr><td>サーキュレーター</td><td>ジュラボ</td><td>1124971</td><td>取り付け酸素電極チャンバー</td></tr><tr><td>コニカルフラスコ</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>スポイト</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>JA25.5</td><td>機器</td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Alimenti</td>あたり <td>14 cm</td><td>フィルタリング用</td></tr><tr><td>グラジエント注ぎ器</td><td>バイオ・ラッド</td><td>165-4120</td><td>グラジエントの準備用</td></tr><tr><td>マグネティックスターラー ATE</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20300165</td><td>機器</td></tr><tr><td>ミラクロス</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>ろ過材</td></tr><tr><td>乳鉢と乳棒</td><td>ジェイミー・オリバー</td><td>花崗岩、6インチ</td><td>機器</td></tr><tr><td>O2view</td><td>ハンザテック機器</td><td></td><td>酸素モニタリングソフトウェア</td></tr><tr><td>オキシグラフプラスシステム</td><td>ハンザテック機器</td><td>1187253</td><td>クラーク型酸素電極</td></tr><tr><td>絵筆</td><td>アーティスト第一選択</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM-996</td><td>プラスチックパラフィンフィルム</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>F155001</td><td>勾配の準備のために</td></tr><tr><td>PVC蠕動チューブ</td><td>ギルソン</td><td>F117930</td><td>勾配の準備のために</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>機器</td></tr></tbody></table>

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

ミトコンドリアは植物、特にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) やフラビン アデニンなど削減化合物の酸化からアデノシン三リン酸 (ATP) の生産の多くの代謝経路に関与する重要な細胞内小器官型 (FADH2)。シロイヌナズナのゲノムの完全な注釈が確立して最も広くプラント モデルを使用し、したがってさまざまな器官 (葉や根、花) からミトコンドリアを浄化するために必要なツールをフル活用する必要があること今ミトコンドリアの生物学を研究するシロイヌナズナ用があります。ミトコンドリアは、様々 なアプローチ、続いて連続コロイド密度勾配を使用して更に精製粗ミトコンドリア ペレットを生産差動遠心分離手順の一連を使用して組織の均質化によって分離します。遠心分離。コロイド密度材料がその後複数の遠心分離手順によって削除されます。新鮮な葉のティッシュの 100 g から始まって、ミトコンドリアの 2-3 mg 日常的に取得できます。これらのミトコンドリアの呼吸実験阻害剤及び各種の基材を使用しているを確認する能力を持つ 100 250 nmol O2分-1 mg ミトコンドリア蛋白-1 (NADH 依存率) の典型的な率を表示します。基板を酸化と代替とチトクローム ターミナル オキシダーゼの容量。このプロトコルでは、シロイヌナズナ葉連続コロイド密度勾配および精製された植物ミトコンドリアの効率的な呼吸測定を使用してからミトコンドリアの分離法について説明します。

このプロトコルを使用して、SDS-PAGE とイムノブロットによって異なるミトコンドリア蛋白質を検出することができました。図 3 aに示すように、水の培養組織から分離したタンパク質はかすかなバンド (2 μ g) を検出するのに十分です。信号強度は、ロード量に比例して増加します。プレート (図 3 b)、高い光ストレスへの応答上に成長した組織から分離したミトコンドリアの異なった遺伝子型の治療は代替オキシダーゼ抗体バイオアセッテイによって分析できます。
ミトコンドリア ・ チトクロムc経路活性代替経路のイヌイットは、新鮮単離ミトコンドリア サンプルを使用して測定できます。説明の隔離プロシージャ (図 4 a) の中にミトコンドリアの整合性はよく保持されます。チ...

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

無傷で純粋な植物ミトコンドリアを単離する全体的な目標は、呼吸、ミトコンドリア組成、生合成、および代謝を研究することです。この方法は、変化する環境条件下でのミトコンドリアの重要性やストレス耐性など、植物エネルギー生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、比較的少量の植物組織から十分な量の純粋で無傷の機能的なミトコンドリアを単離できることです。手順を実演するのは、私の研究室のWenhui LyuとJennifer Selinskiです。ミトコンドリア単離の日に、グラジエントポアラーとPVCペリスタルティックチューブを脱イオン水で洗浄し、グラジエントを準備します。50 mL遠心分離チューブ2本を氷上に配置し、チューブの出口がチューブの壁に接触するように傾けます。次に、黒いレバーを下に回して、内側と外側のチャンバー間の接続を閉じます。マグネチックスターバー付きのグラジエントポアラーを、マグネチックスターラーの内部チャンバー内に置きます。次に、35 mLのヘビーグラジエント溶液をインナーチャンバーに注ぎます。ヘビーグラジエント溶液の半分をペリスタルティックポンプで毎時300mLで、氷上に保管した2本の遠心チューブに分注します。次に、35 mLの光勾配溶液を外側のチャンバーに注ぎます。すぐに、黒いレバーを半分上げて、溶液が穏やかに混合されるように、内側と外側のチャンバー間の接続を再開します。グラジエント混合物全体をチャンバーから 60 mL の速度で排出し、2 つの連続した 0% から 4.4% PVP のグラジエントを形成します。使用する前に、常に氷の上に勾配を保管してください。植物組織を過度に接地しないことが大切です、さもなければミトコンドリアは壊れます。単一の調製物の場合、土壌で栽培された少なくとも80の4週齢のシロイヌナズナ植物からロゼット組織全体を切断します。次に、切断した植物組織の半分を、75mLの粉砕媒体を含む冷却された大きな乳鉢と乳棒に加えます。次に、粉砕媒体を使用して、細孔径が20〜25mの4層のろ過材料を湿らせます。プラスチック製の漏斗を使用して、ろ過材の4つの層すべてでホモジニーをろ過し、500 mLの円錐形フラスコに集めます。さらに75mLの粉砕用メディウムを使用して、組織の残りの半分を粉砕します。次に、ろ過材料中のホモジネート全体を混合して、可能な限りろ過します。150 mLの粉砕媒体を使用して、ろ過材料に残っているすべての組織を粉砕し、500 mLの円錐フラスコにろ過します。ろ過したホモジネートを、あらかじめ冷却した8本の50mLプラスチック遠心チューブに分配します。そして、固定角度ローターで摂氏4度で2, 500gで5分間遠心分離します。上清をきれいな遠心分離管に注いだ後、固定角度ローターで17, 500g、摂氏

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。...

ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。...

シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

クロロフィル蛍光を用いて低CO2 処理後の植物の光合成効率の変化を測定する手法について述べる。...

クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。...

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

学ぶシロイヌナズナ由来ミトコンドリアの分離と呼吸測定法。密度勾配遠心分離を用いて純粋で機能的なミトコンドリアを調製し、植物のエネルギー代謝とストレス耐性の研究に活用できます。

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

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