ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出
2018年3月2日
増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC 発育に及ぼす関連成長因子と治療の評価ができます。
このプロトコルの全体的な目標は、ヒト神経前駆細胞の初期の脳発生プロセスを迅速かつ再現可能な方法で特徴付け、これらのプロセスを調節する重要な細胞外因子の影響を定義することです。この方法は、神経精神医学および神経発達障害の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。たとえば、影響を受けたすべての個人が同じ細胞異常を持っているのか、それともそれぞれが特定の機能障害を示しているのか?当社のプロトコルの主な利点は、迅速で再現性が高く、実装が容易であることです。
この方法は、神経発達障害への洞察を提供するために使用できますが、アルツハイマー病やうつ病などの神経変性障害や神経精神障害の研究にも使用できます。一部の技術では、細胞をある皿から別の皿に移動させたり、視覚的なデモンストレーションを通じて最もよく伝達される形態学的解析が必要なため、これらの方法のいくつかを視覚的にデモンストレーションする必要があります。ヒト神経前駆細胞を持ち上げるには、培地を吸引し、1Xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を一度洗浄します。
リン酸緩衝生理食塩水を吸引し、神経前駆細胞の入ったウェルに500マイクロリットルの1X細胞剥離液を加えます。次に、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、P1000ピペットを使用して、室温で維持された500マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を追加し、細胞を洗浄して除去します。
次に、リン酸緩衝生理食塩水中の細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水でウェルを再度洗浄し、洗浄液をチューブに移します。次に、細胞を300 Gで5分間回転させてペレットを形成します。
次に、上清を捨て、ペレットを1〜5ミリリットルの予熱したDMEM F12培地に再懸濁します。24ウェルプレートの三重ウェルに100, 000個の細胞をプレートします。46時間後、トリチウム化チミジンを培地に加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。
次に、培地を取り除いた後、予め温めた0.25%トリプシンEDTAを300マイクロリットル加え、摂氏37度で20分間インキュベートして細胞をバラバラにしてDNAを放出します。次に、セルハーベスターを回してポンプをオンにします。セルハーベスターに濾紙を置きます。
セルハーベスターのチューブを空のブランクトレイに集め続けます。次に、プレウォッシュを押して濾紙を濡らします。収集チューブをサンプルウェルに入れて開始します。
ホット光源を使用して濾紙を乾燥させ、対応するバイアルをトレイに並べます。バイアルに紙のチャッドを打ち抜き、各バイアルに2ミリリットルの液体シンチレーションカクテルを追加します。シンチレーションカウンターでバイアルを1時間インキュベートしてから、機械を操作して、活性DNA合成を反映する各サンプルの1分あたりのカウントを取得します。
35ミリメートルの培養皿に500, 000個の細胞を播種します。次に、皿を四方八方に攪拌して、細胞を均等に分散させます。次に、細胞を摂氏37度で46時間インキュベートします。
次に、5ミリモルEdUのミリリットルあたり2マイクロリットルを培養物に加え、2時間インキュベートします。次に、細胞を解離してペレット化します。細胞ペレットに、成長因子または薬物の有無にかかわらず、30%増殖培地を3ミリリットル加えます。
細胞懸濁液1ミリリットルをプレコート皿にプレートし、プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。培養中の神経前駆細胞数を調べるには、2日後に微量遠心チューブを標識して調製します。次に、ウェルから培地を吸引し、200マイクロリットルの1X細胞剥離溶液を加え、プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。
細胞剥離後、300マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水を各ウェルに加えます。P1000ピペットを使用して細胞溶液を数回ピペットし、細胞をプレートから分離します。次に、調製した1.5ミリリットルのチューブにセル溶液を移し、チューブを2〜3回反転させます。
ピペットを使用して、チューブの半分まで50マイクロリットルの細胞を引き出し、0.5ミリリットルのチューブでトリパンブルー溶液に加えます。次に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。ニューロスフェアを形成するには、100%膨張培地1ミリリットルをコーティング基板なしで35ミリメートルの皿にピペットで入れます。
次に、これらの各プレートに100万個の神経前駆細胞を追加し、プレートを摂氏37度で48〜96時間インキュベートします。ニューロスフェアの移動用にプレートを準備するには、ECM模倣ゲルアリコートを6ミリリットルの30%膨張培地に溶解します。6ウェルプレートの1ウェルに30%膨張培地を含むECM模倣ゲル1ミリリットルを加えます。
次に、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。ニューロスフェアをプレートするには、ピペットを使用して35ミリメートル皿から培地中の細胞を採取し、円錐形のチューブに移します。次に、チューブを100 Gで回転させて、ニューロスフェアをペレット化します。
次に、ペレットを1〜3ミリリットルの予熱した30%膨張培地に再懸濁します。次に、再懸濁したニューロスフェアの200マイクロリットルを、ECM模倣ゲルを含む6ウェルプレートにピペットで入れ、30%膨張培地でプレートを揺さぶる。次に、プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。
ECM模倣ゲルを30%増殖培地で吸引し、4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を30分間固定します。ニューロスフェアを解析するには、10倍の倍率で位相コントラスト設定を使用して画像をキャプチャします。NIH ImageJソフトウェアを使用して、ニューロスフェアの平均移動を測定します。
ImageJでは、フリーハンドの線ツールを使用して、ニューロスフェアの外側の輪郭をトレースします。次に、測定機能を使用してトレース領域を計算し、球の内部セル質量をトレースします。ニューロスフェアの総面積から内部細胞の質量を差し引いて、平均移動を定量化します。
免疫細胞化学的染色は、細胞骨格タンパク質およびSOX2、PAX6、ネスチンなどの転写因子の3代目における神経前駆細胞の発現を研究するために行われました。次に、位相コントラスト画像を撮影して、神経突起を持つ細胞を同定しました。この画像から、2つの細胞体以上の突起を持つ細胞は神経突起を持つ細胞と考えられ、2つの細胞体より短い突起を持つ細胞は神経突起を持つ細胞とは見なされません。
ニューロスフェアの形成を確認するために、72時間時点で収集されたニューロスフェアのサイズが80マイクロメートルから120マイクロメートルの間であり、したがって移動アッセイに使用できることを示す位相コントラスト画像を撮影しました。増殖能力を定義するために、神経前駆細胞をコントロールまたは線維芽細胞成長因子条件で増殖させ、EdUの存在について染色した。位相差蛍光画像は、線維芽細胞増殖因子で処理された細胞は、EdU染色で示されるように、S期に関与する細胞の割合が高いことを示しています。
次に、神経突起の伸長を確認するために、細胞をコントロール条件でアッセイし、PACAPと比較しました。位相差画像が撮影され、PACAP処理下で神経突起を持つ細胞の数が増加していることが示されました。次に、ニューロスフェアの移動を理解するために、細胞をPACAPニューロペプチドで処理しました。
得られた位相コントラスト画像は、コントロールと比較してニューロスフェアの移動が増加していることを示しています。私たちのプロトコルには、それぞれ異なる時間を必要とする多くの技術とアッセイが含まれています。習得すると、平均的なアッセイのセットアップには2〜3時間、分析には30分から3時間かかる場合があります。
これらの手順を実行する際には、高品質の神経前駆細胞を使用していること、およびこれらの細胞が完全に解離し、ニューロスフィアアッセイを除くすべての条件で均一に分布していることを確認することが重要です。これらの手順に続いて、ウェスタンブロッティング、QRT-PCR、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどの他の分析を実施して、基礎となるメカニズムを特徴付けることができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
このプロトコルは、ヒトの神経前駆細胞（NPC）における初期の脳発達プロセスを迅速かつ再現可能な方法で特徴づけます。また、これらのプロセスに対する細胞外因子の効果を定義し、神経精神医学および神経発達障害の理解を助けます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経発達
- 神経精神医学
- 細胞生物学
背景
- 神経発達プロセスは神経精神疾患で中断される可能性があります。
- これらのプロセスを理解することは、影響を受けた個人の細胞異常に対処する上で重要です。
- NPC評価のプロトコルは様々な障害に関する洞察を提供できます。
- 視覚的な実演は複雑な技術の理解を強化します。
研究の目的
- ヒトiPS細胞由来のNPCにおける神経発達プロセスを評価すること。
- 成長因子と治療薬のNPC発達への影響を評価すること。
- 神経精神疾患における細胞異常を探索すること。
使用された方法
- 形態学的分析によるNPCの特徴づけ。
- 細胞外因子の効果の評価。
- 細胞操作のための迅速で再現可能なプロトコル。
- 複雑な技術のための視覚的実演。
主要な結果
- プロトコルは神経発達プロセスを効果的に評価します。
- 成長因子はNPCの発達に大きな影響を与えます。
- 方法論は神経発達および神経変性疾患に関する洞察を提供します。
- 視覚的補助は細胞操作技術の理解を改善します。
結論
- このプロトコルは迅速で、高度に再現可能で、実施が容易です。
- 神経精神医学における重要な疑問に対処できます。
- 得られた洞察は障害の治療戦略に情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of human neural precursor cells (NPCs) enables early-stage interrogation of neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. This approach provides a scalable, reproducible platform for assessing the impact of growth factors and compounds on proliferation, migration, and differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Integration of these assays into discovery pipelines accelerates disease-relevant hypothesis testing and portfolio triage for CNS drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assessment of disease-relevant cellular phenotypes in human NPCs.
- Supports functional validation of targets affecting proliferation, migration, and differentiation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying responses to growth factors and candidate drugs.
- Provides a platform for comparative analysis across patient-derived and control NPCs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assays for proliferation and migration readouts.
- Enables reproducible quantification of neurite outgrowth and neurosphere migration.
- Supports assay scalability and cross-laboratory reproducibility for compound screening.
- Prepares validated NPC systems for downstream molecular and phenotypic analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cellular phenotypes with disease-relevant mechanisms implicated in neurodevelopmental disorders.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical model validation.
- Supports identification of translational biomarkers linked to early neurodevelopmental processes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of CNS therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This NPC-based phenotyping platform fits at the intersection of early discovery, target validation, and preclinical research for CNS indications.
- Discovery Biology: Provides quantitative assays for hypothesis testing of proliferation, migration, and differentiation in human NPCs.
- Screening: Offers reproducible, scalable readouts for compound and growth factor effects on neurodevelopmental phenotypes.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., DNA synthesis, migration area) enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges early cellular phenotypes to disease mechanisms and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput platform for diverse neurodevelopmental and neuropsychiatric research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target and pathway selection for CNS disorders.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible assays for early-stage decision making.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to imaging, cell counting, and molecular analysis instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay reproducibility.
- Adaptation may be needed for different hiPSC lines or disease models.
- Assay throughput and analysis time depend on operator proficiency and infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
Collecting NPCs for Plating of Experimental Conditions
2:30
Neural Precursor Cell DNA Synthesis Assay
3:47
S Phase Entry Assay
4:39
Neural Precursor Cell Number Assay
5:41
Neural Precursor Cell Neurosphere Migration Assay
7:58
Results: Use of Phase-contrast and Fluorescence Microscopy to Study the Proliferation, Migration, and Neurite Outgrowth of Neural Precursor Cells
9:51
Conclusion
