電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

イオン選択性微小電極と組み合わせた巨大パッチ法は、イオンフラックスの検出と定量に使用される汎用性の高い方法です。具体的には、細胞膜上に発現する電気中性イオントランスポーターであるナトリウム-水素交換体またはNHEの活性によって生成されるプロトンフラックスを測定するために使用されます。ナトリウム-水素交換体は、ここではオレンジ色のリングとして示されている、原形質膜のすぐ近くに陽子の勾配を生成します。

細胞膜を横切るプロトンのこの勾配は、プロトン選択的微小電極を使用する技術と組み合わせた全細胞パッチクランプ記録によって測定されます。プロトン選択性微小電極は、細胞表面の近くに移動し、ここで位置Aに示されている細胞から移動する陽子のフラックスを記録します。そして、細胞表面から離れて、位置Bで示される溶液中に存在する遊離プロトン濃度を記録します。次に、細胞膜に近い位置Aに戻り、 反復的な振動運動で。AからBへの電圧差は記録され、NHEアクティビティの代表に依存します。

細胞膜を横切るプロトンなどのトランスポーターイオンは、生命に不可欠なプロセスに影響を与えます。したがって、pHの変化は、原形質膜プロトン排除システムであるナトリウム-プロトン交換体を含む一連の分子によって厳密に制御されています。振動性pH微小電極と全細胞パッチクランプの組み合わせは、ナトリウム-プロトン交換活性によって媒介されるプロトンフラックスを研究するための新しいアプローチです。

この方法の適用は、中程度の感度、時間分解能、細胞内環境の別の良好な制御など、ナトリウム-プロトン交換体の活性を測定するために一般的に使用される技術の主要な制限のいくつかを克服します。私は、共同研究者であるビクター・バビッチ博士と一緒に、その方法のデモンストレーションを行います。マシュー・ヘンリー博士がナレーターを務めます。

方法の応用を実証します ナトリウム-プロトン交換体 腸および腎上膜を横切る水中の塩の吸収の主要な調節因子であるアイソフォーム3の活性。プロトン濃度を測定するためのプロトン選択性微小電極は、標準的なホウケイ酸ガラス管から製造されています。外径1.2mmのフィラメントなしのホウケイ酸ガラス電極は、従来のダブルプルプロトコルを使用して、垂直プーラーで引っ張られます。

直径2〜3マイクロメートルのピペットチップが得られます。ピペットは、ピペットの先端を上にしてジャーホルダーに入れられます。次に、ピペットをシリコン化するための混合物を調製します。

瓶に注ぎ、蓋をしっかりと閉めます。ピペットは、シリコナイズ混合物と24〜48時間インキュベートされます。注意して、混合物を準備し、換気の良い化学薬品フュームフードで室温でピペットをシリコン化してください。

ピペットに適切なイオン選択性樹脂を戻し、ピペットの先端を下に向けてジャーホルダーに垂直に慎重に置きます。パッチクランプの準備をするには、まず、外径2mm、内径1.4mmの薄肉ホウケイ酸ガラスから、従来のダブルプルプロトコルを使用して垂直プーラーでパッチクランプピペットを引っ張ります。倒立顕微鏡のステージに取り付けられたマイクロフォージを使用して、幅の広いピペットチップを作成します。

ピペットをマイクロフォージの太いプラチナワイヤーの近くに置きます。電流のオンとオフを制御するフットスイッチを使用して加熱します。マイクロフォージの太いプラチナワイヤーの中央を覆う低融点ガラスを加熱し、ピペットの先端を溶けた軟質ガラスに近づけます。

加熱により、プラチナ線がわずかに中心に向かって移動します。プラチナワイヤーが初期位置に戻り、ピペットチップが折れます。目的の先端径が得られるまで手順を繰り返し、最後に熱を加えて先端を滑らかにします。

ピペットチップは、マイクロフォージで研磨した後の直径が10マイクロメートルです。太いプラチナ線を使用すると、電気をつけた後の膨張が少なく、過大な電流でワイヤーやピペットが過熱する可能性が少ないという利点があります。細胞がトリプシンを使用して解離し、トリプシン化がブロックされた後、細胞は凝集の形成を防ぐためにロッキング付きのシェーカー上に維持されます。

これは、トリプシン処理後最大2時間行われます。電気生理学のセットアップは、灌流システム内の溶液の温度を調整するための温度コントローラーで構成されています。すべての実験は摂氏約37度で行われます。

また、蛍光イメージング用のフィルターホイールを制御する光学フィルタースイッチャーも搭載しています。灌流システムバルブの開閉を調整する灌流システムバルブコントローラー。そして、記録室の温度を調整するための温度調節器。

波形を観察するためのオシロスコープとパッチクランプアンプ。このCapmeterソフトウェアを実行しているコンピューター。また、イオン選択性微小電極信号を記録する電位計もあります。

そして、電位計の信号を増幅するための差動増幅器。電気生理学のセットアップには、ステージコントローラー付きの倒立顕微鏡、顕微鏡の左右の部位に配置されたコントローラー付きの2つのマイクロマニピュレーター、インラインソリューションヒーター付きの灌流システムも装備されています。イオン選択性微小電極ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けた後、パッチクランプピペットに細胞内溶液を埋め戻します。

溶液がピペットの先端に達していることを確認してください。ピペットの先端の気泡を取り除くために、数回の軽くたたく必要がある場合があります。次に、パッチクランプピペットを電気生理学セットアップのヘッドステージに取り付けます。

健康に見える細胞を、規定量の浴液で満たされた記録チャンバーに穏やかに移します。ヘッドステージを水平軸に対して45度の角度に保つことが重要です。これにより、ピペットの進入角度が高耐性シールの形成に適したものになります。

パッチクランプピペットを浴液で下げている間に、ピペットに少量の陽圧を加えて、先端が詰まる可能性を減らします。セルを選択し、少量の陽圧でアプローチします。先端が細胞に近づいたら、パッチクランプピペットの移動を停止します。

浴溶液中のイオン選択性微小電極を、パッチクランプピペットチップと同じ焦点面になるまで下げます。ピペットがセルの中央に配置されたら、少量の負圧を加えてシールを開始します。メガオームシールは数秒以内に得られます。

保持電位がアンプによってゼロミリボルトに維持されていることを確認してください。最後に、一連の短い吸引パルスで細胞膜を破裂させ、記録を開始します。ジャイアントパッチレコーディング法を用いることで、ピペット内灌流システムを介してガラスピペット内で溶液を迅速に灌流し、イオン、脂質、タンパク質の細胞内含量を修飾することができます。

イオン選択性微小電極ピペットをパッチクランプピペットで保持されている細胞の近くに置き、イオン選択性微小電極ピペットを細胞内および細胞から移動させることにより、イオン選択性微小電極ピペットの振動を開始する。この技術を適用すると、ナトリウム-水素交換体の分子調節を研究することができます。ジャイアントパッチ法を利用して、ATPと脂質の細胞内組成をピペット内灌流システムによって修飾しました。

細胞内ATPを加水分解し、ホスホイノシチド含有量を減少させるアピラーゼの細胞内灌流により、NHEアイソフォーム3の活性が50%減少しました。NHE3活性に対するアピラーゼ効果は、ホスホイノシチドであるPIP2の細胞内灌流によって逆転しなかった。しかし、ホホイノシチドであるPIP3の細胞内灌流により、この状態は逆転しました。

NHE活性の測定は、プロトン選択性微小電極とパッチクランプ法の組み合わせを利用しています。これにより、ホスホイノシチドと下流のシグナルカスケードによるNHEの差動制御の背後にある分子基盤の研究が可能になります。このビデオを見れば、振動性pH微小電極と全細胞パッチクランプを組み合わせてナトリウム-プロトン交換体の活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。

そして、メソッドの可能な適用例。