Name: 3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学ぶ神経前駆細胞の分離培養とクロマチン免疫沈降法を用いたH3K79me2解析。脳発生におけるエピジェネティック修飾の動態を解明し、神経発生メカニズムの理解に貢献する再現性の高い実験手法です。

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アンリエット ・ Bertemes は、ラボ内 CGN 栽培プロトコルを確立する支援を感謝いたします。このメソッドの紙は、DFG 資金 CRC992 医療エピジェネティクスによるテレビへの資金によって支えられました。著者はフライブルクの銀河チームのサポートを認める: 教授 Rolf Backofen、バイオインフォマティクス、アルベルト ・ ルートヴィヒ大学フライブルク、ドイツ共同研究センター 992 医療エピジェネティクス (DFG グラント SFB 992/1 2012) によって資金を供給、Björn Grüning Pavankumar Videmドイツ連邦教育省および研究 (BMBF グラント 031 A538A RBC (de。NBI))。

<ol><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li>
<li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li>
<li>Götz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development%3A+the+art+of+generating+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).</li>
<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
<li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li>
<li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li>
<li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li>
<li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li>
<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li>
<li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
<li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tale+beyond+the+tail%3A+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li>
<li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485(2015).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li>
<li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Af9%2FMllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li>
<li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137(2008).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoidl%2C+D+%22Histone+modifications+during+cerebral+cortex+development%22">Histone modifications during cerebral cortex development</a>. , (2015).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP+with+Native+Chromatin%3A+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22%5BJournal%5D)">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ヒストン修飾、転写因子、ヒストン コード リーダー、作家、または消しゴムのゲノムの占有を検出するクロマチン免疫沈降を実行する 2 つの主要な方法があります。ヌクレアーゼ消化、ネイティブのクロマチン免疫沈降を用いたネイティブ チップであると、ヌクレオソームと他の DNA に接続されたタンパク質が DNA にしたバインドされて PFA 固定、せん断されたクロマチンを使用して提案手法39. その高い抗体検出率とネイティブのチップは、クロマチンからヒストンのメチル化の適用されるべきし、ヒストンのメチル化、チップ全体で比較的安定しています。だ開始材料の大規模な量が必要なので大脳皮質や小脳の開発を研究するため該当するマウスの脳細胞の数は通常限られています。抗体は一般に非固定材料に対して発生しますが、抗体は特にチップ qPCR 解析と immunoblots (図 2 a 減少 H3K79me2 信号に DOT1L リードの特異的阻害後に H3K79me2 を検出した事を証明できました、図 3 a</s...

脳の感覚, モータ, と認知機能が非常に複雑で物理的な環境の変化に影響を受けやすいです。脳は、深くつながっています 3 つの一般的な部分、後肢-、半ばと前脳, で構成されています。前脳, 内終脳は背終 (DT) と腹側終 (VT) に分けることができます。マウスの DT は、「インサイド アウト」方法1で E11.5 と E18.5 間形作られる六つの皮質層で構成されています。VT には、開発後大脳基底核2,3を形成する神経節隆起が含まれています。いくつかの細胞の種類で分類できます哺乳類の中枢神経系神経細胞やアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト4など5時間空間的方法を開発します。まず、神経前駆細胞 (Npc) はニューロン、介在ニューロン VT と投射ニューロンの種類に、DT ではグリア細胞 (例えば、アストロ サイト6) に上昇を与えます。皮質過程を最も表面的な層 (層)、最初に形成、カハール ・ レチウス細胞を含みます。Npc を生成 E12.5 と E14.5 の間より深い神経層 (VI, V) 中を生じさせる上層 (第四) ニューロン7,814.5 16.5、前駆細胞の間。軸索の身元は、異なるモルフォゲン誘起の時間空間的転写プログラムおよびまたエピジェネティック プログラム2に指定します。
モーターの調整に関与しているが、小脳は菱脳にありマウス9で E10 と約 P20 の間成長します。小脳皮質と小脳核10が含まれています。成人の小脳皮質は 3 層、最も外側の分子層、プルキンエ細胞層、顆粒ニューロンの10を含む最も内側の顆粒層から成っています。小脳顆粒細胞は最小のニューロンで、脊椎動物の脳11すべての神経細胞の約 80% を表しています。彼らは外部の胚のゾーンに位置する前駆体から開発し、彼らの先12プルキンエ細胞層を移行します。終脳、小脳の開発はいくつかの重要なモルフォゲンによって調整される、ように時間と空間に依存した特定の機能を持っているし、開始は転写プログラム10に定義されています。
大脳皮質と小脳の層の開発は、特定のモルフォゲンの転写式で、したがって、DNA のクロマチンの状態によって制御されます。簡易ビューでクロマチンの状態を転写活性状態としてユークロマチンと転写活性サイレント領域として異質染色質に分割できます。クロマチンの基本単位としてヌクレオソームには、各コアのヒストン H2A、H2B、H3、H4、147 の塩基対の DNA13に囲まれた 2 つのコピーが含まれています。ヒストンは、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、sumo 化、ADP リボシル化、脱アミノ化、およびプロリン異性化14,15によって高いファーストクリーニング変更します。ヒストンのリジンのメチル化は転写、複製、組み換え16、DNA 損傷応答17、およびゲノムインプリンティング18制御する最も安定したヒストン修飾と見なされます。リシンはモノラル、ディ、またはトリ メチル19アクセス可能なヒストンの尾にだけでなく、ヒストン20の球状ドメイン内で表示できます。H3K4 H3K36 で特定のメチル化は、主ユークロマチン、H3K9、H3K27、または H4K20 で特定のメチル化は主にヘテロクロマチン領域、すべての残基がヒストンの尾14,内にある19,21。H3K79 のメチル化はヒストンの球状ドメイン内にあるし、転写活性、発現不活性ゲノム領域22とも関連付けられています。それは、酵母や子牛の胸腺、鶏、人間23で観察されているので変更は保存されました。H3K79 モノ, ジおよびトリメチル (H3K79me1、me2、me3) は、ヒストンのメチル化酵素 DOT1L24,25と26核設定ドメインを含むタンパク質 2 (Nsd2) によって触媒されます。DOT1L は、増殖、DNA 修復、27の reprograming 携帯電話で関与しています。マウスでDot1lの損失は、発達段階 E10.528,29周り出生前の死に します。心臓の発達過程および myocardiocyte の分化は、DOT1L は遺伝子発現の規則30に不可欠です。中枢神経系における DOT1L 関数は、神経管開発31で関与する可能性があります、それはTbr1の抑制に関与する-脳開発32中、式小胞体ストレスによる機能可能性があります応答遺伝子33。コンテキスト依存のアクティブ化または中枢神経系の開発のような体内状況に特に H3K79me の抑制作用は、日付には部分的に32を理解専用です。H3K79 のメチル化はヒストン 3 の球状ドメインにあるので、柔軟なヒストンの尾23での変更と比較してアクセスしにくい立体です。H3K79 メチル化の機能を理解し、その場所とゲノム環境を決定する信頼性と再現性の高い分析法が必要です。QPCR や時点の異なるシーケンスを介して H3K79 のメチル化を分析する、異なる神経前駆細胞 (皮質のクリック単価) と小脳の CGNPs、DOT1L 阻害剤治療、チップ メソッドの分離手法を提示するこの方法で大脳皮質と小脳の開発中にポイント。プロトコルとその可能性の概要については、図 1を参照してください。

<table><tbody><tr><td>抗GAPDH</td><td>抗体 Abcam</td><td>ab8245</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: 免疫ブロット希釈率 1:5000</td></tr><tr><td>抗H3</td><td></td>抗体 <td>ab1791</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: イムノブロット希釈率 1:3000</td></tr><tr><td>抗H3K79me2</td><td>ダイアゲノード</td><td>pAb-051-050</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: ChIP抗体</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: イムノブロット希釈液 1:1000</td></tr><tr><td>抗ウサギ-IgG</td><td>ジアゲノード</td><td>C15410206</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: ChIP Ctrl抗体</td></tr><tr><td>抗チューブリンα</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Category: 抗体 略語/コメント: イムノブロット希釈液 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: CCM</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td>ズ<td>17504044Category: Cell culture 略語/コメント: CCMバイオアナライザーAgilent</td></tr><tr><td></td><td>テクノロジー</td>ズ<td>の場合 G2940CA</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: せん断クロマチン</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>の分析B01020001</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: 超音波処理装置</td></tr><tr><td>ホウ酸pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CPC培養用</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: For CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: 磁気ビーズ、ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>用Category: DOT1L inhibition 略語/コメント: 細胞培養におけるDOT1L阻害の場合</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: EDTA</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CPC単離とCGM</td></tr><tr><td>グルコース</td>用 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: CGNP単離用</td></tr><tr><td>グルタチオン(1.25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CCM用</td></tr><tr><td></td><td>Glycine Carl Roth</td><td>3187</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: 細胞固定用</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis 略語/コメント: DNA polymerase master mix for qPCR</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: HBSS</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td></td> <td>25030081Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>の場合L2020</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: 塩化リチウムのCPC培養用</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: LiCl</td></tr><tr><td>N2サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: Fluorospectrometer for DNA quantification</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td></td><td>NEB E7645S</td><td>Category: ChIP Analysis 略語/コメント: Library preparation</td></tr><tr><td>NEB次のマルチプレックスオリゴ for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library</td></tr> preparation <tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CCM</td></tr><tr><td>NP-40代替</td><td>カルバイオケム</td><td>の場合 492016</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: ChIPバッファー</td></tr>パラ<tr><td>ホルムアルデヒド</td>の場合 <td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: PFA、細胞固定用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: PSN、CCMおよびCGM</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td>用 <td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: PBS, for CPC isolation</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA定量のための色素の可視化</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CGNP単離用</td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Category: Cell culture 略語/コメント: 塩化カリウムを培養するCPC用</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: KCl, for CGM</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: ChIP</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: DNA精製用キット</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: For ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: 溶出バッファー</td></tr>用 <tr>塩化<td>ナトリウム</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl、ChIPバッファー用</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: ChIP</td></tr><tr><td>ナトリウム用ドデシルサルフェート</td><td>カール・ロス</td><td>183</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: SDS, ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td></tr><tr><td>スーパーオキシドジスムターゼ (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Category: 細胞培養 略語/コメント: CCM</td></tr><tr><td>用 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>カール・ロス</td><td>9090</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: TRIS、ChIPバッファー</td></tr><tr><td>用 トリトンX-100</td><td>カール・ロス</td><td>・X100</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: ChIPバッファー用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CPC単離用</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Category: ChIP 略語/コメント: ビーズ調製用</td></tr><tr><td>その他の実験装置:ノイバウアー計数室、インキュベーター、ローテーター、シェーカー、ダイセクションセット、ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM:皮質細胞培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGM:CGNP細胞培養培地</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

脳の発達は、時間空間的なモルフォゲンや転写の異なるプログラムの勾配によって制御される複雑なプロセスです。また、ヒストンのメチル化などのエピジェネティックなクロマチン修飾の確立およびこのプロセス内で特定のセル運命を維持する重要な役割があります。大多数のヒストンのメチル化はヒストン、修飾子、消しゴム、およびヒストン リーダー蛋白質にアクセス可能な柔軟なヒストンの尾で発生します。対照的に、H3K79 のメチル化はヒストン 3 の球状ドメインに位置し、さまざまな発達機能に関与しています。H3K79 メチル化は進化的に保存されているし、酵母にホモ ・ サピエンスから種の広い範囲で見つけることができます。神経前駆細胞を含む生物内の異なる細胞数の変更が発生します。H3K79 メチル化ヒストン 3 の球状ドメインの場所すると、評価が難しくなります。ここでは、分離する手法を提示して文化大脳皮質前駆細胞 (CPCs) 胎生期大脳皮質の脳組織 (E11.5-E14.5) または小脳顆粒細胞前駆細胞 (CGNPs) 生後組織 (P5-P7)、効率的に immunoprecipitate量的な PCR (qPCR) とゲノム シーケンスの H3K79me2。

神経前駆細胞の分離、培養、H3K79me2 チップ、チップの解析手法の一般的な方式:産後の段階で胚の脳の発達中の異なる時点で大脳皮質前駆細胞や小脳顆粒細胞前駆細胞の H3K79me2 チップを実行するフローチャートを図 1に示します。最初のステップとして、脳が分離して (E11.5 と E14.5) の間終脳や小脳 (P5 P7) が取得します。DT とバーモント州を分割して終脳の異なる領域を分析することが可能です。その後、組織が均質化、神経前駆細胞を分離します。今、前駆細胞の培養と DOT1L 阻害剤とそれらを扱うことが可能です。別の可能性は、前駆細胞を直接解決し、チップ プロシージャにすることです。チップ、クロマチンを 200-500 bp の断片にせん断・ H3K79me2 磁気ビーズ結合抗体とその後培養されます。ビーズを洗浄し、DNA を取得後、qPCR (図 1 a)、シーケンス処理によって、沈殿させた DNA...

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3 の球状ドメインで。

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

この手順の全体的な目標は、脳の発達、特に大脳皮質と小脳におけるエピジェネティックな修飾を分析することです。この方法は、H3K79メチル化のようなヒストン修飾が皮質および小脳の層状化の発達にどのように影響するかなど、神経生物学分野の重要な質問に答えるために使用できます。この技術の主な利点は、特定の発生時点における異なる脳領域におけるヒストン修飾を、遺伝子座特異的またはゲノムワイドにin vivoで研究できることです。P5からP7までの脳とMRIマウスから始めます。すべての髄膜と血管を取り除きます。次に、チップごとに3〜5個の小脳を15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離の前にHBSSグルコースで小脳を洗浄します。チューブを遠心分離して組織を採取します。最終洗浄後、1ミリリットルのピペットで2〜3回ピペッティングし、断片が0.5〜1立方ミリメートルになるまで静かにピペッティングして小脳を均質化します。2.5ミリリットルが残るまで、すべての液体を静かに取り除きます。次に、0.05%トリプシンを大脳を含むHBSSグルコースを含むチューブに加えます。そして、組織を摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。1〜3分ごとに組織を反転させます。インキュベーション後、5ミリリットルのCGNP細胞培養培地(CGM)を追加して消化を停止し、以前と同様に遠心分離により組織を回収します。遠心分離後、上清を取り除き、1ミリリットルのCGMを追加します。1ミリリットルのピペットチップで組織を粉砕し、気泡の形成を防ぎます。次に、5ミリリットルのCGMを加え、混合物を氷上で2分間インキュベートして、組織の残骸を沈殿させます。組織が落ち着いたら、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、残存組織に2ミリリットルのCGMを加え、トリチュレーション手順を繰り返してから、上清を採取して組織の残りを廃棄します。組織の各15ミリリットルチューブから上清をプールし、遠心分離して小脳細胞を収集します。ペレットを10ミリリットルのCGMに再懸濁します。アストロサイトはCGNPよりもポリD-リジンに速く強く接着するため、ポリD-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのウェルに最大4ミリリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度で20分間インキュベートしてアストロサイトを除去します。プレートを振って、上清を15ミリリットルのチューブに集めてから、前と同じように上清を遠心分離します。ペレットを10ミリリットルのCGMに再懸濁し、ノイバウアー計数チャンバーで細胞をカウントします。4〜6時間後、付着したCGNPは丸みを帯びて現れ、増殖します。ポリ-L-オルニチンコーティングプレート上にCGMで細胞を播種し、摂氏37度、CO25%、相対湿度100%でインキュベートします。in vitro(DIV1)で1日経過すると、ほとんどのCGNPは丸くなり、増殖します。一部のCGNPは分化を開始し、ニューロン突起の成長を開始します。培養細胞を固定するには、CGNPを含むウェルに最大1ミリリットルの1%PFAを直接添加します。摂氏22度で5分間インキュベートした後、53マイクロリットルのグリシンを加え、3ミリリットルの氷冷PBSで2回洗浄します。セルスクレーパーを使用して、1ミリリットルのPBSで細胞を採取します。細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、1, 000 gおよび摂氏4度で5分間遠心分離する。上清を除去した後、プロテアーゼ阻害剤を含む700マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、サンプルを摂氏4度で15分間インキュベートします。この間、5分ごとにサンプルをボルテックスします。インキュベーション後、サンプルチューブを分割して、容量がチューブあたり400マイクロリットルを超えないようにします。次に、最大出力で10分間超音波処理して、溶解細胞のクロマチンをせん断します。10分後、サンプルをボルテックスし、次に超音波処理とボルテックスをさらに2回繰り返します。ライセートの残存原子核を位相差顕微鏡またはDAPIを用いた蛍光顕微鏡で確認します。細胞残骸を13, 000g、摂氏4度で10分間遠心分離することにより、ペレット化します。終了したら、上澄み液をプレクリアステップに使用します。サンプルを事前に透明にするには、まず、氷冷したPBS Tweenでサンプルあたり20 μリットルの非標識磁気ビーズを洗浄します。磁気スタンドを使用して洗浄液を取り外してください。次に、600マイクロリットルの希釈バッファーと20マイクロリットルの洗浄済み磁気ビーズを各サンプルに加えてプレクリアし、ローテーター上で摂氏4度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、マグネットスタンドを使用してビーズを取り出します。次に、各ライセートの5%をインプットサンプルとして取り、摂氏マイナス20度で凍結します。抗体カップリングは、サンプルが事前にクリアされている間に行うことができます。前回と同様に、氷冷したPBSトゥイーンでチップあたり45マイクロリットルのプロテインA磁気ビーズを洗います。最終洗浄後、ビーズに氷冷したPBSを1ミリリットル加えます。次に、ビーズの45マイクロリットルアリコートあたり3マイクログラムの抗体を追加します。ローテーター上で摂氏4度で2時間インキュベートし、抗体をビーズに結合させます。インキュベーション時間が経過したら、洗浄した抗体結合ビーズを氷冷PBSの1ビーズ容量に再懸濁します。事前にクリアされた各抽出物を約643.5マイクロリットルの2本のチューブに分割します。同量の希釈バッファーと抗体結合ビーズを添加し、ローテーター上でサンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、氷冷チップバッファー1から3でビーズを4°Cのローテーターでそれぞれ10分間洗浄し、続いてTEバッファーで5分間を3回洗浄します。溶出バッファーを添加し、室温のシェーカーで1, 400 RPMで1時間希釈します。1時間が経過したら、各チップサンプルに10マイクログラムのRnaseを追加し、入力サンプルに5マイクログラムを追加します。サンプルをシェーカーで37°Cで30分間インキュベートします。最後に、チップサンプルあたり100マイクログラムのプロテイナーゼKとインプットあたり50マイクログラムを追加します。摂氏65度、1, 400 RPMで一晩インキュベートします。H3K79ジメチル化レベルは、3日間のCPC培養とSGC 0946によるDOT1L阻害後に減少します。チップ解析後のQCPRにより、ベースラインでヒストン-3-リジン-79メチル化レベルが高い遺伝子が阻害剤治療に最も反応することが明らかになりました。H3K79ジメチル化カバレッジが低い遺伝子では、メチル化レベルに有意な変化は見られませんでした。このヒートマップは、ヒストン-3-リジン-79のメチル化レベルが転写開始部位の周辺でピークに達し、転写終了部位に向かって減少することを示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約1週間で習得できます。このビデオを見れば、単離された脳細胞のヒストン修飾に対するクロマチン免疫沈降の方法について十分に理解できるはずです。

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。...

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

ここで、我々は3次元（3D）文化の中で、生産の拡大、およびimmunolabel生後海馬の神経前駆細胞（NPCに）する方法について説明します。次に、ハイブリッド可視化技術を使用して、我々はimmunolabelled凍結切片のデジタル画像が全体の3Dニューロスフィアを通して免疫陽性細胞の空間的位置を再構築し、マップするために使用することができる方法を示します。...

3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に...

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

このビデオは、成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞(iNPC)を単離する技術を示しています。本稿では、iNPCコロニーを単離し、iNPC集団の継続的な増殖と拡大を促進する適切な培地の存在下で、ラミニン被覆マルチウェルプレートウェルで培養する手順を概説しています。...

成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

このビデオは、マウスの子犬の小脳から小脳神経前駆細胞の分離と培養を示しています。小脳顆粒ニューロン前駆細胞は、接着差によって単離および精製され、アストロサイトを効果的に除去します。これらの培養された前駆細胞は、その後、小脳顆粒ニューロンに分化します。...

マウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞の単離と培養

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

エピジェネティックなメカニズムは、神経膠腫で頻繁に変更されます。クロマチン免疫沈降は、クロマチン構造と遺伝子の転写を調節するヒストンの修正の変更から発生する神経膠腫の遺伝子変異の結果を研究に使用できます。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。...

マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

学ぶ神経前駆細胞の分離培養とクロマチン免疫沈降法を用いたH3K79me2解析。脳発生におけるエピジェネティック修飾の動態を解明し、神経発生メカニズムの理解に貢献する再現性の高い実験手法です。

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

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