新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための信頼性の高い方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。

この手順の全体的な目標は、マウスの内耳にアクセスして遺伝子送達を行うことです。この方法は、効率的な方法でマウスの内耳に遺伝子治療を行うのに役立ちます。この手法の主な利点は、信頼性が高く、習得が容易であることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、マウスの内耳のサイズが小さいため、苦労します。しかし、練習すれば、ほとんどの人は10分以内に外科的解剖を完了することができます。滅菌器具で手順を開始し、ビーズ滅菌器の電源を入れて動物間の器具を清掃します。

マイクロインジェクターに取り付けられた直径10ミクロンのマイクロピペットに治療用ウイルスをロードします。私たちの実験で使用したウイルスベクターはAAV28-whirlinで、1ミリリットルあたり10〜13ゲノムコピーの力価があります。この動画では、見やすくするためにメチレンブルーの染料を使用しました。

耳の後ろの皮膚を3つのベタジンスクラブできれいにし、続いてアルコールワイプします。次に、マイクロハサミを使用して、耳の約2ミリメートル後ろに耳介後骨を作成し、下にある軟組織を分割します。顔面神経と水疱を特定します。

胸鎖乳突筋は顔面神経に対して垂直にあります。アブミ骨動脈は、便利なランドマークであるブラを通して見ることができます。顔面神経を上および後方にたどって、後半規管を見つけます。

マイクロハサミを使用して、後半規管を覆っている筋繊維と軟組織を切除します。次に、マイクロインジェクターに装填したガラスマイクロピペットで後半規管を貫通し、色素を内耳に注入します。典型的には、49ナノリットルの合計20回の注射が、約1マイクロリットルの総量に対して、40秒にわたって後半規管に送達される。

最後の容量を投与した直後にピペットを引き出します。次に、5-0ポリグラクチン縫合糸を使用して皮膚切開部を閉じます。このビデオに示すように、新生児ホワーラーマウスにAAV8-ワーリンを注射すると、卵形有毛細胞に緑色で示されるワーリン発現が得られました。

形質導入された有毛細胞は、反対側の注射されていない耳の有毛細胞と比較して、赤で示される細長い立体繊毛を持っていました。AAV8-whirlinの後方半規管注射も、whirlerマウスの蝸牛有毛細胞の形質導入をもたらしました。形質導入された有毛細胞は、立体繊毛の先端で渦巻きを発現し、反対側の非注射耳からの有毛細胞と比較して細長い立体繊毛を持っていました。

この手順に続いて、ABIやステレオテストなどの他の方法を実行して、内耳遺伝子送達が聴覚および前庭機能に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、内耳遺伝子送達の分野の研究者がマウスの内耳における遺伝子送達の欠陥を調査する道を開きました。