Name: 新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: 学ぶ後半規管アプローチによる新生児マウスの内耳遺伝子デリバリー法。外科的解剖とAAVベクター注入により、内耳全体への効率的な遺伝子治療を実現し、聴覚・前庭研究に応用可能です。

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この作品は、高度なイメージング コアに、NIDCD 部の学内研究/NIH (W.W.C. へ DC000082-02) だけでなく、DC000081 からの資金によって支えられました。私たちの動物を気遣うため NIDCD 動物施設スタッフに感謝しております。

動物のすべてのプロシージャは、動物愛護と難聴および他のコミュニケーション無秩序 (NIDCD ASP1378-15) の国立研究所利用委員会によって承認されました。
1. 手順セットアップおよび準備
<ol><li>すべての楽器を実験の初めにエチレンオキ サイドで滅菌します。動物、間ビーズ滅菌を使用して楽器をきれいに。</li>
	<li>マイクロ インジェクターのマイクロ ピペットにウイルスの遺伝子療法を含むソリューションを読み込みます。本研究で使用されるウイルスのベクトルは AAV2/8 有 (1 x 1013ゲノム コピー、1 ミリリットルあたりは、材料の表を参照)。 注: 通常、1.1 μ L の総ボリュームは、ピペットに読み込まれます。</li>
</ol>2. 麻酔
注: この研究で使用されるマウスの緊張はベーキング マウスです。ホモ接合体変異体 (送受信を行って無線/無線) とヘテロ同腹子 (送受信を行って+/無線) 使用されました。
<ol><li>場所別ケージ (ゴミとは別) の母。</li>
	<li>マウスを暖かく保つために循環熱パッド (37.5 ° c セット) ごみ (P0 - P5 子犬) を含むホーム ケージを配置します。</li>
	<li>ラテックス グローブの親指部分をカットし、子犬を配置します。</li>
	<li>ラテックス グローブの親指に ~ 2 分の氷のバケツに子犬を配置します。</li>
	<li>4"× 4" ガーゼ子犬とパックの表面の間で大きな正方形商業プラスチック フリーズ パックに麻酔下の子犬を配置します。</li>
	<li>押しつぶされた氷、頑丈なラテックス手袋を埋めるし、子犬の周りアイス グローブを配置します。</li>
	<li>子犬は適切に (しっかりつま先ピンチを含む) さまざまな刺激への応答の完全な欠如によって麻酔かどうかを確認してください。氷パックに子犬を残して手術 (約 5-10 分) の持続期間のため。 注: 手術中に 15 分以上の氷パックに子犬を残してをお勧めします。</li>
</ol>3. 外科的アプローチ (図 1)
<ol><li>動物の麻酔後は、ヨウ素拭くアルコール ワイプと耳の後ろの皮膚をきれいに。</li>
	<li>耳介後部切開 ~ 2 mm マイクロ-はさみを使って耳の後ろを行い、マイクロはさみで胸鎖乳突筋を分割します。</li>
	<li>顔面神経とブラを識別します。ブラは軟骨と半透明なこの時代であり、顔面神経の内側。アブミ骨動脈は、便利なランドマークは、この年齢でブラを見ることができます。</li>
	<li>上方や後方に顔面神経を従う後半規管 (PSCC) を検索します。筋線維とマイクロはさみを使って後半規管を覆う軟組織を削除します。 注: この年齢で、PSCC は軟骨です。</li>
	<li>ガラス マイクロ ピペット (〜 10 μ m の直径) を用いたマイクロ インジェクター PSCC に浸透します。</li>
	<li>内耳へのウイルスの遺伝子療法を注入します。 注: 合計 49 の 20 注射遺伝子療法の nL を後半規管以上 〜 40 に配信する通常、s (総量 ~ 1 μ L)。使用ウイルスの力価は、1 mL あたり 1 x 1013ゲノム コピーだった。</li>
	<li>5-0 polyglactin の縫合糸を使用して皮膚切開を閉じる。</li>
</ol>4. 術後のケア
<ol><li>定数手動刺激/ローリングと手袋をはめた手指と麻酔からの回復の間に正常な体温を復元する温暖化パッドに子犬を配置します。</li>
	<li>子犬が目を覚まし、その家のケージに配置します。</li>
	<li>家敷にさらされている綿棒を使ってそれぞれの子犬を愛撫します。 注: この目的は再手術を後彼女のごみを受け入れる母親の可能性を高める術前と同様の匂いを嗅ぐマウスを持っていることです。可能であれば、母親から尿を収集し、拒絶反応の可能性をさらに減らすために綿棒を使用して子犬にこすりことができます。</li>
	<li>8、彼女を鈍感に母の鼻に鉱物油を適用し、ホームのケージに母を再導入します。</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

作者に関連する開示があります。

いくつかの外科的アプローチは、齧歯動物の内耳にアクセスに記載されています。後半規管と内リンパ嚢のアプローチは通常前庭器官1をアクセスに使用されるに対し、Cochleostomy と丸い窓のアプローチは、蝸牛にアクセスするよく使用されます。最近の研究では、ウイルスの遺伝子療法の注射は、前庭器官と蝸牛殻5有毛細胞伝達の高効率の結果、後半規管を示した。実際、蝸牛の有毛細胞の情報伝達は、遺伝性難聴、前庭機能不全5,9の同じマウスモデルで丸い窓の注射と比較すると後半規管注射を通してより高いだった。丸い窓と蝸牛の間解剖学的な近接を考えると、丸い窓の注射が後半規管注射に比べて低いの内耳有毛細胞伝達につながることを逆説的なようです。この発見は、蝸牛の水道橋近くに丸い窓があるという事実によって説明されるかもしれない。したがって、丸い窓からウイルスの遺伝子療法を注入すると、その濃度が蝸牛水道10から...

内耳遺伝子治療の調査の急速に発展途上の分野です。それは戦闘の難聴、騒音外傷、遺伝性難聴の損失1に様々 な動物モデルで適用されています。いくつかの最近の研究の後内耳遺伝子療法配信2,3,4,5,6,変異マウスにおける聴覚と平衡機能の機能回復を示されています。7。 内耳遺伝子治療の成功は、手術アプローチは内耳にアクセスするために使用を決定要因のキーの 1 つ。理想的には、外科的アプローチが実行には簡単だろう、一貫性があり、わかりやすい解剖学的ランドマークになるし、標的細胞の種類の結果の伝達は高いでしょう。
最近の研究で示した舞踏変異マウス (難聴、前庭機能不全のモデル) の後半規管から注入するウイルスの遺伝子療法、感覚毛の細胞の効率的な伝達が、前庭に見られました。器官蝸牛5と同様。感覚毛の細胞の情報伝達の効率はこれらの突然変異体のマウスの聴覚と前庭の機能の改善で起因しました。
この記事で新生児マウス内耳に接近する後半規管で詳しく述べる。

<table><tbody><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico ENT顕微鏡。他の解剖顕微鏡も機能します。</td></tr><tr><td>マイクロ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10、11295-51</td><td>#5 および #55 デュモン</td></tr><tr><td>マイクロはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter2000 マイクロインジェクター</td><td>ワールド精密機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>マステックス</td><td>モデル 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl 縫合</td><td>エチコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>ベクターBiolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>サッター機器</td><td>B100-75-10</td><td>ホウケイ酸ガラス</td></tr></tbody></table>

新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

内耳遺伝子治療は、難聴やめまいの潜在的な治療としての偉大な約束を提供しています。内耳遺伝子療法の成功の重要な要因の 1 つは聴力損失を最小限に抑えながら標的細胞のタイプの一貫性のある伝達効率で起因する配信方法を見つけることです。この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための現実的な方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。後半規管の簡単な解剖学的同定と同様、必要な側頭骨の最小限の操作、make この手術アプローチ内耳遺伝子送達のための魅力的なオプションです。

後半規管を介して新生児舞踏マウスに遺伝子治療を AAV8 有の注入は 53.1% の感染効率と有小嚢の有毛細胞 (図 2) に式 (緑) の結果 (SD 38.1、n = 28)5.導入された有毛細胞は不動 (赤) 非注入側の耳から有毛細胞に比較して伸長いた (μ m ± 2.11 5.35 3.20 ± 0.34 μ m、対それぞれ)5。
AAV8 有の後半規管注入はまたベーキング マウス (図 3) における蝸牛の有毛細胞の伝達で起因しました。内部の有毛細胞を平均感染効率は 77.1% (SD 12.7、n = 8)5。導入された有毛細胞有 (グリーン) 不動のヒントを表明し、不動 (赤)...

この研究では、新生児マウス内耳遺伝子送達のための信頼性の高い方法として後半規管のアプローチについて述べる。後半規管を介して遺伝子デリバリーが全体の内耳を灌流することができることを示します。

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

この手順の全体的な目標は、マウスの内耳にアクセスして遺伝子送達を行うことです。この方法は、効率的な方法でマウスの内耳に遺伝子治療を行うのに役立ちます。この手法の主な利点は、信頼性が高く、習得が容易であることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、マウスの内耳のサイズが小さいため、苦労します。しかし、練習すれば、ほとんどの人は10分以内に外科的解剖を完了することができます。滅菌器具で手順を開始し、ビーズ滅菌器の電源を入れて動物間の器具を清掃します。マイクロインジェクターに取り付けられた直径10ミクロンのマイクロピペットに治療用ウイルスをロードします。私たちの実験で使用したウイルスベクターはAAV28-whirlinで、1ミリリットルあたり10〜13ゲノムコピーの力価があります。この動画では、見やすくするためにメチレンブルーの染料を使用しました。耳の後ろの皮膚を3つのベタジンスクラブできれいにし、続いてアルコールワイプします。次に、マイクロハサミを使用して、耳の約2ミリメートル後ろに耳介後骨を作成し、下にある軟組織を分割します。顔面神経と水疱を特定します。胸鎖乳突筋は顔面神経に対して垂直にあります。アブミ骨動脈は、便利なランドマークであるブラを通して見ることができます。顔面神経を上および後方にたどって、後半規管を見つけます。マイクロハサミを使用して、後半規管を覆っている筋繊維と軟組織を切除します。次に、マイクロインジェクターに装填したガラスマイクロピペットで後半規管を貫通し、色素を内耳に注入します。典型的には、49ナノリットルの合計20回の注射が、約1マイクロリットルの総量に対して、40秒にわたって後半規管に送達される。最後の容量を投与した直後にピペットを引き出します。次に、5-0ポリグラクチン縫合糸を使用して皮膚切開部を閉じます。このビデオに示すように、新生児ホワーラーマウスにAAV8-ワーリンを注射すると、卵形有毛細胞に緑色で示されるワーリン発現が得られました。形質導入された有毛細胞は、反対側の注射されていない耳の有毛細胞と比較して、赤で示される細長い立体繊毛を持っていました。AAV8-whirlinの後方半規管注射も、whirlerマウスの蝸牛有毛細胞の形質導入をもたらしました。形質導入された有毛細胞は、立体繊毛の先端で渦巻きを発現し、反対側の非注射耳からの有毛細胞と比較して細長い立体繊毛を持っていました。この手順に続いて、ABIやステレオテストなどの他の方法を実行して、内耳遺伝子送達が聴覚および前庭機能に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、内耳遺伝子送達の分野の研究者がマウスの内耳における遺伝子送達の欠陥を調査する道を開きました。

posterior-semicircular-canal-approach-for-inner-ear-gene-delivery

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医学

マウス内耳は、その発達プログラム妊娠中に詳述されているプラ​​コード由来の感覚器官である。我々は定義され...

開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで&gt;</em&gt;エレクトロポレーション

出典: Kozin, E. D., et.al.聴覚経路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛核の直接可視化J. Vis.

光誘発聴覚刺激のためのマウス背側蝸牛核へのウイルス介在遺伝子導入

このビデオでは、聴覚と前庭機能へのダメージを最小限に抑えながら、半規管を介してマウスの内耳に局所的に薬物を送達する術であるカロストミーを紹介しています。この方法により、ウイルスベクター、医薬品、および低分子をマウスの内耳に接種することができます。...

成体マウスの内耳への局所薬物送達のためのカナロストミー

出典: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane.J. Vis. 経験。 (2015年)このビデオは、遺伝性難聴のマウスの子犬の内耳に治療遺伝子を送達する手順を示しています。アデノ随伴ウイルス (AAV)...

マウスモデルにおける聴覚回復のためのウイルスベクターベースの遺伝子治療

説明されている耳介後の外科的アプローチは、失血と動物の死亡率を最小限に抑えながら、マウスの蝸牛スカラティンパニへの迅速かつ直接的な送達を可能にします。この方法は、丸い窓の膜を介して出生後のマウスに分子、薬理、およびウイルスを送達する蝸牛療法に使用できます。...

円窓膜を介してマウスインナーイヤーにウイルスにより媒介遺伝子送達のための手術方法

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新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

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ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy...

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

学ぶ後半規管アプローチによる新生児マウスの内耳遺伝子デリバリー法。外科的解剖とAAVベクター注入により、内耳全体への効率的な遺伝子治療を実現し、聴覚・前庭研究に応用可能です。

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