同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング
2018年6月28日
事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。
この手順の全体的な目標は、腫瘍を開始する肺がん細胞をマウスの気道に移植する効率を高めることです。この方法は、薬剤耐性の原因や線維症と肺がんとの関係など、がん生物学における重要な疑問に答えるための新しい前臨床モデルを確立するのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまなマウス系統の肺への腫瘍開始細胞の移植効率が向上することです。
この技術の意味は、治療に対して異なる臨床反応を示すことが知られている、より多様なヒト肺がんのサブタイプをモデル化することを可能にするため、治療にまで及びます。このプロトコルでは、最初にマウスにブレオマイシンを注射する必要があります。その後、14日後に腫瘍細胞を注入します。
両方の注射の手順は非常に似ており、ここで説明します。注射の2時間前に、ブレオマイシンストックを氷上で解凍し、使用濃度まで希釈します。氷の上に置いてください。
細胞ボーラスの場合、テキストプロトコルに記載されているように細胞懸濁液を調製してください。各マウスの処置時間は、全部で約10分です。つま先をつまんで適切な麻酔を確認し、獣医の軟膏を目に塗ってください。
このとき、マウスの毛が黒い場合は、肋骨の腹側と背側の両方を剃り、正しく画像化できるようにします。次に、マウスを前歯で固定し、マウスをプラットフォームに背を向けて挿管プラットフォームに置きます。細胞ボーラスを注入する場合は、穏やかなトリチュレーションで今すぐ再懸濁します。.
次に、胸の上部を照らし、口を開けて、平らな鉗子を使用して舌をそっと引き出します。針を取り外して気管用のIVカテーテルを準備し、気管開口部の上に配置します。次に、カテーテルの上部が前歯に近づくまでカテーテルを気管に挿入し、カテーテルの内部を照らして配置を確認します。
次に、50マイクロリットルの新しくできたブレオマイシンまたは細胞懸濁液をカテーテルに直接分注します。ボリューム全体がカテーテルを下って移動するまで数秒待ちます。その後、カテーテルを取り外し、10%漂白剤で廃棄します。
マウスが液体を吸い込んでいない場合は、マウスの呼吸を注意深く監視し、カテーテルの位置を調整します。マウスの呼吸が止まった場合は、すぐにカテーテルを取り外し、マウスが呼吸するのを待ってから、カテーテルを再挿入します。カテーテルを抜去した後、5匹の治療マウスを麻酔したまま、画像化の準備を整えるために手順を続けます。
回復のためには、マウスをIACUC承認の回復ケージ内の加熱パッドに仰臥位で置き、完全に回復するまで監視します。細胞を注入してから2〜3分後、インスリン針を使用して、100マイクロリットルのルシフェリンを眼窩後向きに注入します。イメージングセッションごとに注射に使用する眼を交互に行います。
少なくとも2分間待った後、動物生物発光イメージャーで最大5匹のマウスを胸骨横臥位に配置し、発光設定を使用して背側画像を取得します。コントロールパネルの下で、解像度と感度の設定を調整して、細胞の発光を測定します。ほとんどのアプリケーションでは、3分から始めて、ビニングを中に設定し、f /ストップを1に設定し、視野をdに設定し、被写体の高さを1.5に設定します。
注射が成功した場合、片方の肺または両方の肺の胸部上部で信号が検出されます。細胞が気管の入り口に集まっている場合、注射は成功しませんでした。背側画像を撮影した後、マウスを反転させて腹側画像を取得し、必要に応じて設定を調整します。
イメージング後、テキストプロトコルに記載されているように術後ケアを進めます。次に、このイメージングプロトコルを生着の3日後に繰り返し、その後毎週繰り返します。画像を解析するには、生物発光解析ソフトウェアを使用します。
まず、シリーズ内の適切な画像をすべて読み込みます。このセクションでは、1つのソフトウェアパッケージについて詳しく説明します。次に、各マウスについて、シリーズの最初の画像で、正方形の関心領域を作成し、肺領域全体をカバーする胸の上部領域上に配置します。
次に、右クリックを使用してすべての関心領域をコピー機能にアクセスし、このツールを使用して、グループ内の各画像に同じ関心領域を適用します。次に、各画像内で、各マウスの上部胸を覆うように正方形の位置を微調整します。これは、腹側と背側の両方のビューに対して行います。
次に、画像ウィンドウの左上隅で、フォトン関数を選択します。次に、測定オプションを選択します。その後、関心領域のデータは、全流束として出力テーブルに表示されます。
必要に応じて、このデータを分析します。免疫力が低下した場合、無腸性マウスをブレオマイシンで治療しました。細胞ボーラス生着の前に、ブレオマイシンで治療されたマウスでは14日目までに一過性の線維化が観察されましたが、ビヒクルで治療されたマウスでは観察されませんでした。.
次に、確立されたヒト肺がん細胞株H2030の細胞を、これらのマウスの肺に気管内導入しました。35日後、ブレオマイシンで治療したマウスは肺腫瘍の負荷が高かった。しかし、ビヒクルで治療した動物では、腫瘍は検出されませんでした。
肺腫瘍の負荷は組織学を用いて確認された。ビヒクルで前処理された肺には腫瘍結節の証拠がありませんでしたが、ブレオマイシンで前処理された肺には大きな腫瘍結節がありました。転移性H2030 BrM 3細胞株を移植した後、39〜57日までに、生物発光が強すぎてイメージングできなかったため、転移は遠隔臓器でex vivoで分析されました。
小さな病変はさまざまな組織で検出される可能性があり、この方法が自然播種性疾患を研究するために有望であることを示唆しています。この手法を習得すると、イメージングなしで5匹のマウスのケージあたり10分、マウスをイメージングする場合はケージあたり20分で行うことができます。この手順を試みるときは、カテーテルの適切な挿入を確認し、動物の呼吸を監視することを忘れないでください。
この手順に続いて、薬理学的研究や採取した組織のアミノ酢酸化学などの他の方法を実行して、生着腫瘍が薬物にどのように反応するか、または肺に特異的な腫瘍間質相互作用を特徴付けるなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、生理学的に関連性のある環境での患者由来の異種移植片を含む、さまざまなマウス系統や腫瘍モデルに適用できます。ブレオマイシンの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、バイオハザードフードの操作や適切な廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、傷害を通じて気道を前処置することで、マウスの肺における肺がん細胞の移植を強化する方法について説明します。この技術は、間質相互作用、転移性の広がり、肺がんの併存症の研究を促進することができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 腫瘍学
- 臨床転換研究
- 前臨床モデル
背景
- 腫瘍形成肺がん細胞をマウスに移植することは、がん生物学を研究する上で重要です。
- 薬剤耐性と線維症と肺がんの関係を理解することが不可欠です。
- 異なるヒトの肺がんサブタイプは治療に様々な反応を示します。
- 現在のモデルはこれらの変異を適切に表現していない可能性があります。
研究目的
- マウスにおける肺がん細胞移植の効率を改善すること。
- がん生物学の重要な質問に答えることができる前臨床モデルを確立すること。
- より広範囲のヒトの肺がんサブタイプをモデル化すること。
使用した方法
- マウスにブレオマイシンを注射して気道傷害を誘発します。
- 14日後、腫瘍細胞を気道に注射します。
- 様々なマウス系統で移植効率を評価します。
- 間質相互作用と転移行動の分析を実施します。
主要な結果
- この方法は腫瘍形成細胞の移植効率を大幅に向上させます。
- 多様な肺がんサブタイプのモデル化を可能にします。
- 肺がんと線維症の関係に関する洞察が得られます。
- 治療と薬剤耐性の理解に対する潜在的な影響が強調されます。
結論
- この技術は、前臨床モデルにおける肺がん生物学の研究を強化します。
- 様々な肺がんサブタイプにおける治療反応を調査するプラットフォームを提供します。
- 将来の研究は、この方法を活用して新しい治療戦略を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
